Name: in vivo functional brain imaging approach based on bioluminescent calcium indicator gfp-aequorin
Uploaded: 2016-01-08T15:00:01
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin at JoVE.com

We are indebted to E. Karplus, from Sciences Wares, USA, for his precious and useful help and advices. We thank E. Carbognin, A. Avet-Rochex, M. Murmu, P. Pavot, D. Minocci, G. Vinatier, and J. Stinnakre for their contribution to the development and improvement of this technique. We also thank B. Pfeiffer and G. Rubin, Janelia Farm, H.H.M.I., Ashburn, USA, for the pJFRC65-13XLexAop2-IVS-G5A-BP line. This work was supported by the Chateaubriand Fellowship, French Embassy, Washington, USA to A. Lark, by the National Science Foundation (IOS 1352882) to T. Kitamoto, and by the French ANRs (ANR-05-NEUR-009 Drosaequorin, 2005, and FlyBrainImaging, 2011), the Conseil R&#233;gional Ile-De France (NeRF and DIM), the IFR-144, the Physique-Chimie-Biologie Interface Program of the CNRS (2009), and by the CNRS, France to JR Martin.

1. Framställning av prover <ol><li> Beredning av lösningar och ställa in <ol><li> Behåll alla Drosophila melanogaster linjer vid 24 ° C på vanliga livsmedel medium. Bakre och hålla dem vid låg densitet i flaskan för att generera standardiserad storlek och vikt av flugor. <ol><li> Tillsätt 10 nyproducerade honor med 10 män i en flaska, låt dem para sig och överföra dem varje 2 dagar till en ny flaska. Därefter 10 dagar senare, när flugorna börjar Eclose, skörda flugorna varje dag. Håll en ex...

<ol>
	<li>Martin, J. -. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+brain+imaging:+fluorescence+or+bioluminescence,+which+to+choose.">In vivo brain imaging: fluorescence or bioluminescence, which to choose.</a> J Neurogenet. 22 (3), 285-307 (2008).</li><li>Shimomura, O., Johnson, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxidized+coelenterazine,+the+active+group+in+the+photoprotein+aequorin.">Peroxidized coelenterazine, the active group in the photoprotein aequorin.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 75 (6), 2611-2615 (1978).</li><li>Shimomura, O., Johnson, F. H., Saiga, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Further+data+on+the+bioluminescent+protein,+aequorin.">Further data on the bioluminescent protein, aequorin.</a> J. Cell. Comp. Physiol. 62 (1), 1-8 (1963).</li><li>Baubet, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+green+fluorescent+protein-aequorin+as+bioluminescent+Ca2++reporters+at+the+single-cell+level.">Chimeric green fluorescent protein-aequorin as bioluminescent Ca2+ reporters at the single-cell level.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 97 (13), 7260-7265 (2000).</li><li>Cabrero, P., Richmond, L., Nitabach, M., Davies, S. A., Dow, J. A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+biogenic+amine+and+a+neuropeptide+act+identically:+tyramine+signals+through+calcium+in+Drosophila+tubule+stellate+cells.">A biogenic amine and a neuropeptide act identically: tyramine signals through calcium in Drosophila tubule stellate cells.</a> Proc. Biol. Sci. 280 (1757), 20122943 (2013).</li><li>Leclerc, C., Webb, S. E., Daguzan, C., Moreau, M., Miller, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+patterns+of+calcium+transients+during+neural+induction+in+Xenopus+laevis+embryos.">Imaging patterns of calcium transients during neural induction in Xenopus laevis embryos.</a> J. Cell Sci. 113 (19), 3519-3529 (2000).</li><li>Martin, J. -. R., Rogers, K. L., Chagneau, C., Br&#251;let, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+bioluminescence+imaging+of+Ca2++signalling+in+the+brain+of+Drosophila.">In vivo bioluminescence imaging of Ca2+ signalling in the brain of Drosophila.</a> PLoS One. 2 (3), e275 (2007).</li><li>Murmu, M. S., Stinnakre, J., Martin, J. -. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+Ca2++stores+contribute+to+odor-induced+responses+in+Drosophila+olfactory+receptor+neurons.">Presynaptic Ca2+ stores contribute to odor-induced responses in Drosophila olfactory receptor neurons.</a> J. Exp. Biol. 213 (24), 4163-4173 (2010).</li><li>Murmu, M. S., Stinnakre, J., R&#233;al, E., Martin, J. -. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-stores+mediate+adaptation+in+axon+terminals+of+Olfactory+Receptor+Neurons+in+Drosophila.">Calcium-stores mediate adaptation in axon terminals of Olfactory Receptor Neurons in Drosophila.</a> BMC Neurosci. 12, 105 (2011).</li><li>Pavot, P., Carbognin, E., Martin, J. -. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKA+and+cAMP/CNG+channels+independently+regulate+the+cholinergic+Ca2+-response+of+Drosophila+mushroom+body+neurons.">PKA and cAMP/CNG channels independently regulate the cholinergic Ca2+-response of Drosophila mushroom body neurons.</a> eNeuro. 2 (2), 0054-0068 (2015).</li><li>Minocci, D., Carbognin, E., Murmu, M. S., Martin, J. -. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+functional+calcium+imaging+of+induced+or+spontaneous+activity+in+the+fly+brain+using+a+GFP-apoaequorin-based+bioluminescent+approach.">In vivo functional calcium imaging of induced or spontaneous activity in the fly brain using a GFP-apoaequorin-based bioluminescent approach.</a> BBA-Mol Cell Res. 1833 (7), 1632-1640 (2013).</li><li>Lima, S. Q., Miesenb&#246;ck, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+control+of+behavior+through+genetically+targeted+photostimulation+of+neurons.">Remote control of behavior through genetically targeted photostimulation of neurons.</a> Cell. 121 (1), 141-152 (2005).</li><li>Shimomura, O., Musicki, B., Kishi, Y., Inouye, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-emitting+properties+of+recombinant+semisynthetic+aequorins+and+recombinant+fluorescein-conjugated+aequorin+for+measuring+cellular+calcium.">Light-emitting properties of recombinant semisynthetic aequorins and recombinant fluorescein-conjugated aequorin for measuring cellular calcium.</a> Cell Calcium. 14 (5), 373-378 (1993).</li><li>Berridge, M. J., Bootman, M. D., Roderick, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signalling:+dynamics,+homeostasis+and+remodelling.">Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling.</a> Nat Rev Mol Cell Bio. 4 (7), 517-529 (2003).</li><li>Fiala, A., Spall, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+calcium+imaging+of+brain+activity+in+Drosophila+by+transgenic+cameleon+expression.">In vivo calcium imaging of brain activity in Drosophila by transgenic cameleon expression.</a> Sci STKE. 2003 (174), PL6 (2003).</li><li>Wang, J. W., Wong, A. M., Flores, J., Vosshall, L. B., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+calcium+imaging+reveals+an+odor-evoked+map+of+activity+in+the+fly+brain.">Two-photon calcium imaging reveals an odor-evoked map of activity in the fly brain.</a> Cell. 112 (2), 271-282 (2003).</li><li>Wilson, R. I., Turner, G. C., Laurent, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+Olfactory+Representations+in+the+Drosophila+Antennal+Lobe.">Transformation of Olfactory Representations in the Drosophila Antennal Lobe.</a> Science. 303 (5656), 366-370 (2004).</li></ol>

Den nyligen utvecklade bioluminescent baserade GFP-aequorin tillvägagångssätt presenteras här tillåter in vivo-funktionell inspelning av Ca2 + -activity i olika neuroner, såväl som, om så önskas, i andra typer av celler såsom njure stellatceller såsom rapporteras i Cabrero et al., 2013 5. Ändringar, felsökning, ytterligare komponenter, och kritiska steg Drosophila Husb...

Den grundläggande mönster och funktion aktivitet i hjärnan och dess diskreta strukturer har länge varit ett område med intensiva studier inom området neurovetenskap. Kanske några av de tidigaste framgångsrika metoder som används för att behandla denna fråga var direkt fysiologisk mätning av förändringen i elektrisk aktivitet - men alternativa metoder som möjliggör levande avbildning av förändringar i spännings, pH eller kalciumkoncentrationer (som mått på aktivitet) har medfört nya möjligheter till studiet av nervaktivitet 1. Avbildningstekniker har ett brett utbud av fördelar såsom minskad invasiv och förmågan att övervaka aktiviteten inom hela hjärnstrukturer. Dessutom hos djur med lätthanterliga genetik inklusive bananflugan Drosophila, utvecklingen av genetiskt kodade kalcium indikatorer, såsom Cameleon, GCaMPs och övriga 1 har gjort det möjligt för forskare att övervaka enskilda nervceller, neuronala populationer och hela hjärnanstrukturer. Även mer traditionella fluorescerande kalciumavbildningsmetoder med hjälp av GCaMPs (GFP smält till kalmodulin) eller FRET (GFP och YFP smält till kalmodulin) har visat sig vara användbara tekniker som ger god spatial och temporal upplösning, den bakomliggande processen av ljus excitation framkallar vissa begränsningar på dess experimentella applikationer. På grund av ljusets natur excitation, autofluorescens, fotoblekning och fototoxicitet är oundvikligen produceras, vilket följaktligen begränsar djupet av de strukturer som kan avbildas, hur länge inspelningar samt realtids kontinuiteten i inspelningen. Med andra ord måste inspelningar ofta utföras intermittent för att undvika dessa oönskade bieffekter. På grund av dessa utmaningar har ytterligare alternativa metoder för kalcium avbildning utvecklats. En av de mest lovande metoderna är självlysande avbildning, som bygger på ljus som produceras genom en enzymatisk reaktion efter kalciumbindande. Bioluminescent avbildning kräver inte lätt excitation och därmed inte upplever samma svårigheter som konventionell kalcium avbildning. Bioluminescent reporter Aequorin - isolerad från Aequorea Victoria, samma maneter från vilket GFP också isolated- binder kalcium via sina tre EF handen strukturer och undergår en konformationsförändring, vilket leder till oxidation av dess kofaktor coelenterazin och frisläppandet av blått ljus (λ = 469 nm) 2,3. Aequorin har en mycket låg affinitet för kalcium (Kd = 10 nM), vilket gör den idealisk för övervakning av kalcium transienter eftersom det ger mycket lite bakgrundsljud och inte stör den intracellulära kalciumbuffertsystem 4. Även aequorin har tidigare använts för att övervaka processen för neural induktion i Xenopus ägg 5 ljuset som produceras är för svag för att användas för realtids avbildning av nervaktivitet. I ett försök att ta itu med denna utmaning, Philippe Br &amp;# 251; låt och kollegor vid Pasteurinstitutet skapade en genetisk konstruktion fusing GFP och aequorin gener, imitera det nativa tillståndet inom maneter 4. Detta fusions genprodukten binder kalcium återigen via de tre EF handen strukturer av aequorin, som genomgår en konformationsförändringar som leder till oxidation av coelenterazin, som överför energi icke-radiativt till GFP. Denna energiöverföringsresulterar i frisättning av grönt ljus (λ = 509 nm) från GFP, istället för blått ljus från aequorin. Sammansmältningen av GFP och aequorin ger också större proteinstabilitet hjälpa fusionsprotein producerar ljus 19 till 65 gånger starkare än aequorin ensam 4. Med hjälp av en självlysande tillvägagångssätt i hjärnan utökar nuvarande försöket med kalcium imaging både när det gäller längden på kontinuerlig inspelning och antal strukturer i hjärnan som kan spelas in. I stora drag i samband med tidigare arbete det innebär att både global och en störrekan övervakas olika regionaliserad &quot;aktivitet&quot; i hjärnan (genom fullmakt av kalcium transienter). Ännu viktigare aktivitet kan övervakas under längre tid, i realtid och fortlöpande, som lätt lämpar sig för att uppnå en fullständig förståelse av basala funktion i hjärnan. Under de senaste åren har vårt labb och andra utvecklade transgena flugor som uttrycker GFP-aequorin under kontroll av den binära expressionssystemet (GAL4 / UAS-GFP-aequorin) 5,6. Vi har använt GFP-aequorin bioluminescens för att spela in aktivitet som produceras av naturliga stimuli såsom doft 7,8, såväl som studerade cellkomponentema modulerar Ca2 + -activity i svampkroppar följande acetylkolinreceptorstimulering genom direkt nikotin tillämpning 9. Dessutom har vi också använt GFP-aequorin att ta itu med ett antal experimentella frågor som inte har kunnat tas upp tidigare, som på lång siktavbildning av spontana kalcium transienter och visualisering av djupare hjärnstrukturer 10. På senare tid har vi använt GAL4 / UAS-system för att uttrycka däggdjurs ATP-receptorn P2X 2 11 en katjon kanal i projektions nervceller (PN) och använde LexA-systemet för att uttrycka GFP-aequorin i svamporgan (MB247-LexA, 13XLexAop2-IVS-G5A-BP) (en artighet av B. Pfeiffer, Janelia Farm, USA). Detta har gjort det möjligt för oss att aktivera PNS genom applicering av ATP, som i sin tur aktiverar svampkropparna (en nedströms målet för den PNS), imitera flera fysiska förhållanden, såsom svar på en lukt stimulans. Sammantaget denna teknik kombinerar P2X 2 och GFP-aequorin utökar de experimentella möjligheterna. I stora drag det ger en möjlighet att bättre förstå aktivitetsmönster i hjärnan, att inleda nya studier om hur olika stimuli och störningar kan ändra den basala mönstring av aktivitet.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1023911000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7365-45-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCL&#160;</td>
			<td>prolabo</td>
			<td>26 764.298</td>
			<td>normapur</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl</td>
			<td>prolabo</td>
			<td>25 108.295</td>
			<td>normapur</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N3876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2383</td>
			<td>Adenosine 5&#8242;-triphosphate disodium salt hydrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>benzyl-coelenterazine</td>
			<td>Prolume, nanolight&#160;</td>
			<td>Cat #301 Coelenterazine h</td>
			<td>http://www.prolume.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dental glue</td>
			<td>3M ESPE&#8482;</td>
			<td>46954</td>
			<td>Protemp&#8482; IV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>silicon glue</td>
			<td>3M ESPE&#8482;</td>
			<td>36958</td>
			<td>Express&#8482; 2 Regular Body Quick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tape</td>
			<td>3M Scotch</td>
			<td>122s</td>
			<td>3M Scotch Magic Tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette tips</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>4868</td>
			<td>100-1000&#181;L Univesal Pipette Tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chamber and holder (stage)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>hand made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>incubation box</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>hand made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forceps (No 5)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-00</td>
			<td>Micro-dissecting forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>curved forceps</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4142</td>
			<td>Micro-dissecting forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glue applicator&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>hand made&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>knife</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10316-14</td>
			<td>5mm Depth 15&#176; stab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EM-CCD camera&#160;</td>
			<td>Andor</td>
			<td>DU-897E-CS0-#BV</td>
			<td>iXon (cooled to -80&#176;C)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Eclipse-E800</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>immersion objective lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>N/A</td>
			<td>20x Fluor .5w</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dissection microscope with fluorescence</td>
			<td>Leica MZ Fl III</td>
			<td>N/A</td>
			<td>leica dissection scope and florescent lamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tight dark box</td>
			<td>Science Wares</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Custom built by Science Wares</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>peristaltic pump&#160;</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Minipuls 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tubing</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>depends on thickness</td>
			<td>Tygon R3603, St-Gobain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>perfusion system</td>
			<td>Warner</td>
			<td>64-0135 &#160;(VC-66CS)</td>
			<td>Perfusion valve control system, complete, with pinch valves, 6 channel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>perfusion regulators</td>
			<td>Leventon</td>
			<td>201108</td>
			<td>Dosi-flow 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>measurement and automation explorer</td>
			<td>Sciences Wares &#38; National Instruments</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>photon imager&#160;</td>
			<td>Science Wares &#38; National Instruments</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>photon viewer</td>
			<td>Science Wares &#38; National Instuments</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software https://www.microsoft.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>virtual dub</td>
			<td>open access&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software http://virtualdub.sourceforge.net/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UAS-GA2</td>
			<td>Martin et al., 2007, Ref. 1&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td>&#160;No stocks {currently} publicly available&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pJFRC65-13XLexAop2-IVS-G5A-BP&#160;&#160;</td>
			<td>B. Pfeiffer, Janelia Farms, Ashburn USA.&#160;</td>
			<td>(STOCK #1117340)</td>
			<td>pfeifferb@janelia.hhmi.org</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P2X2</td>
			<td>Lima and Misenboeck, Ref. 11&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td>&#160;No stocks {currently} publicly available&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OK107</td>
			<td>Bloomington stock center</td>
			<td>854</td>
			<td>http://flystocks.bio.indiana.edu/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo functional brain imaging approach based on bioluminescent calcium indicator gfp-aequorin

Funktionell in vivo imaging har blivit en kraftfull metod för att studera funktion och fysiologi av hjärnceller och strukturer av intresse. Nyligen har en ny metod för Ca2 + -imaging hjälp av självlysande reporter GFP-aequorin (GA) har utvecklats. Denna nya teknik bygger på en sammanslagning av GFP och aequorin gener, som producerar en molekyl som kan binda kalcium och - med tillägg av sin cofaktor coelenterazine - avger starkt ljus som kan övervakas genom en foton samlare. Transgena linjer som bär GFP-aequorin-genen har tagits fram för både möss och Drosophila. I Drosophila, har GFP-aequorin-genen placeras under kontroll av GAL4 / UAS binära uttrycket system som möjliggör riktade uttryck och bildbehandling i hjärnan. Denna metod har senare visat sig kunna upptäcka både inåt Ca2 + -transients och Ca2 + -released från inner butiker. Viktigast det möjliggör en större längd i kontinuerlig inspelning, bildbehandling på större djup i hjärnan, och inspelning med hög temporal upplösning (upp till 8,3 ms). Här presenterar vi den grundläggande metoden för att använda självlysande avbildning att registrera och analysera Ca2 + -activity inom svamp organ, en struktur centralt för inlärning och minne i gylfen hjärnan.

Sammansmältningen av GFP till aequorin tillåter oss att visualisera vår region av intresse före självlysande avbildning genom excitation av GFP i fluorescerande läge på mikroskop (Figur 3A, 4A, 6A, 6E). Ett av de enklaste sätten att stimulera svamp organ är genom aktivering av jonotropa nikotinacetylkolinreceptorer. Även acetylkolin är den endogena liganden för denna receptor har vi funnit att nikotin ger mer reproducerbara svar i svampkroppar. Detta beror delvis på att de specifikt uttryck...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin at JoVE.com

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

In Vivo Functional Brain Imaging strategi som bygger på Bioluminescent Kalcium indikator GFP-aequorin

Här presenterar vi en ny Ca2 + -imaging tillvägagångssätt med hjälp av en självlysande reporter. Detta tillvägagångssätt använder en kondenserad konstrukt GFP-aequorin som binder till Ca 2+ och emitterar ljus, vilket eliminerar behovet av ljusexcitering. Betydligt denna metod medger lång kontinuerlig avbildning, tillgång till djupa hjärnstrukturer och hög tidsupplösning.

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

Functional Calcium Imaging in Developing Cortical Networks

Funktionell Kalcium Imaging i utvecklingsländerna kortikala nätverk

A hallmark pattern of activity in developing nervous systems is spontaneous, synchronized network activity. Synchronized activity has been observed in ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Funktionell hjärnavbildning med ultraljud Blod-hjärnbarriären störningar och mangan-förstärkt MRT

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In vivo Neuronal kalcium Imaging i C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Ex Vivo Kalcium Imaging för att visualisera hjärnan Svaren till endokrin signalering i Drosophila

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model ...

In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish

I Vivo kalcium avbildning av sidolinje hårcellerna i Larval zebrafiskar

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

In vivo Kalciumavbildning i mus underlägsen oliv

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

&#181;Tongue: A Microfluidics-Based Functional Imaging Platform for the Tongue In Vivo

Ãƒâ€šÃ‚ÂµTongue: A Microfluidics-Based Functional Imaging Platform for the Tongue In Vivo

μTongue: En mikrofluidikbaserad funktionell bildplattform för tungan i Vivo

Intravital fluorescence microscopy is a tool used widely to study multicellular dynamics in a live animal. However, it has not been successfully used in ...

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

Hjärnans pericytkalcium och hemodynamisk avbildning hos transgena möss in Vivo

Recent advances in protein biology and mouse genetics have made it possible to measure intracellular calcium fluctuations of brain cells in vivo and to ...

Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging

Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging

Stereotaxisk viral injektion och gradientindexlinsimplantation för djup hjärna in vivo kalciumavbildning

A miniature fluorescence microscope (miniscope) is a potent tool for in vivo calcium imaging from freely behaving animals. It offers several advantages ...