Name: an efficient and high yield method for isolation of mouse dendritic cell subsets
Uploaded: 2016-04-18T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Efficient and High Yield Method for Isolation of Mouse Dendritic Cell Subsets at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par le NIH / NIAID subvention AI45889 à SAP cytométrie de flux des études ont été effectuées en utilisant FACS installations de base pris en charge par le Centre Einstein Cancer (NIH / NCI CA013330) et Centre de recherche sur le sida (NIH / NIAID AI51519).

Les expérimentations animales sont réalisées conformément aux lignes directrices approuvées de la protection des animaux et de l&#39;utilisation comité institutionnel (IACUC). Toutes les procédures nécessitant la stérilité sont effectuées dans une enceinte de sécurité biologique. 1. Implantation de B16.Flt3L mélanome chez la souris <ol><li> La culture de la lignée exprimant Flt-3 B16 de mélanome de cellules dans des fioles T25 pour culture de tissus , à une densité de 0,5...

<ol>
	<li>Steinman, R. M., Cohn, Z. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+novel+cell+type+in+peripheral+lymphoid+organs+of+mice.+I.+Morphology,+quantitation,+tissue+distribution.">Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice. I. Morphology, quantitation, tissue distribution.</a> J Exp Med. 137 (5), 1142-1162 (1973).</li><li>Banchereau, J., Steinman, R. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mini-review:+Regulation+of+cytotoxic+T+lymphocyte+responses+by+dendritic+cells:+peaceful+coexistence+of+cross-priming+and+direct+priming.">Mini-review: Regulation of cytotoxic T lymphocyte responses by dendritic cells: peaceful coexistence of cross-priming and direct priming.</a> Eur J Immunol. 33 (10), 2645-2654 (2003).</li><li>Bendelac, A., Savage, P. 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Immunology. 13 (2), 101-117 (2013).</li><li>Arora, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+subset+of+dendritic+cells+controls+the+cytokine+bias+of+natural+killer+T+cell+responses+to+diverse+glycolipid+antigens.">A single subset of dendritic cells controls the cytokine bias of natural killer T cell responses to diverse glycolipid antigens.</a> Immunity. 40 (1), 105-116 (2014).</li><li>Semmling, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+cross-priming+through+CCL17-CCR4-mediated+attraction+of+CTLs+toward+NKT+cell-licensed+DCs.">Alternative cross-priming through CCL17-CCR4-mediated attraction of CTLs toward NKT cell-licensed DCs.</a> Nat Immunol. 11 (4), 313-320 (2010).</li><li>Duriancik, D. M., Hoag, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+identification+and+enumeration+of+dendritic+cell+populations+from+individual+mouse+spleen+and+Peyer's+patches+using+flow+cytometric+analysis.">The identification and enumeration of dendritic cell populations from individual mouse spleen and Peyer's patches using flow cytometric analysis.</a> Cytometry A. 75 (11), 951-959 (2009).</li><li>Karsunky, H., Merad, M., Cozzio, A., Weissman, I. L., Manz, M. 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F., Pritchett-Corning, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manual+restraint+and+common+compound+administration+routes+in+mice+and+rats.">Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats.</a> J Vis Exp. (67), (2012).</li><li>Reeves, J. P., Reeves, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unit+1.9,+Removal+of+lymphoid+organs.">Unit 1.9, Removal of lymphoid organs.</a> Curr Protoc Immunol. , (2001).</li><li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appendix+3B,+Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability.">Appendix 3B, Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Curr Protoc Immunol. , (2001).</li><li>Vremec, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintaining+dendritic+cell+viability+in+culture.">Maintaining dendritic cell viability in culture.</a> Mol Immunol. 63 (2), 264-267 (2015).</li></ol>

Les cellules dendritiques sont acceptées comme le principal des cellules présentatrices d&#39;antigène professionnelles impliquées dans l&#39;amorçage de réponses des lymphocytes T. Leur fonction principale est de sonder le microenvironnement des tissus en prenant et le traitement des antigènes pour la présentation aux cellules T. Afin d&#39;étudier la fonction de sous-ensembles DC spécifiques, ceux-ci doivent être isolés en nombre suffisant en utilisant une approche qui maintient leur phénotype et les fonc...

Les cellules dendritiques (DC) ont été découverts il y a près de quarante ans que la &quot;grande étoilées (grec dendron) cellule&quot; trouvé dans les organes lymphoïdes 1. De nombreuses études ont montré que les DC sont les seules cellules présentatrices de l&#39; antigène qui peut stimuler efficacement les lymphocytes T naïfs 2. Une fonction majeure de ces cellules est l&#39;absorption et la présentation des antigènes et de leur traitement efficace et le chargement de ces molécules sur présentatrices d&#39;antigène. Dans la rate de la souris, les CD peuvent être séparés en plasmacytoïdes et des sous-ensembles classiques. Les CD plasmacytoïdes sont caractérisés par une faible expression de CD11c et des niveaux élevés de B220 et Gr-1. Ils sont également positifs pour le marqueur mPDCA1 de surface et sécrètent interféron de type I en réponse à péage comme récepteur 9 (TLR9) ligands. Les CD classiques sont élevés pour CD11c et classe l&#39;expression du CMH II. Ils peuvent être divisés en trois sous-ensembles distincts basés sur l&#39;expression de surface des marqueurs phénotypiques tels que CD4, CD8a, DEC205, CD11b et cellules dendritiques récepteur inhibiteur 2 (DCIR2, reconnu par l&#39;anticorps 33D1) protéines 3,4. Les CD8a Pos DC sont également connus comme CDC1, sont positifs pour DEC205, mais négatif pour les marqueurs myéloïdes tels que CD11b et 33D1. Le CD8a Neg DC, aussi appelé cdc2, sont positifs pour 33D1, CD11b et CD4 mais manquent DEC205. Le sous - ensemble double négation (ie, négatif à la fois CD4 et CD8a) est relativement rare, et est négative pour DEC205 et 33D1. Il est le sous - ensemble moins caractérisée et peut - être une forme moins différenciée de CD8a Neg DC. Les différences phénotypiques dans les différents sous - ensembles DC étendent aussi leurs fonctions in vivo. Le CD8a Neg DC sont très phagocytaire et sont pensés pour présenter l&#39; antigène exogène principalement par le CMH de classe II à des cellules T CD4 3. En revanche, les CD8a Pos DCs sont spécialisés pour la présentation d&#39; un antigène protéique soluble dans le CMH de classe Idans un mécanisme appelé présentation croisée. Le résultat de la présentation croisée dépend de l&#39;état d&#39;activation de ces PED 5, et peut conduire soit à l&#39; expansion des cellules T cytotoxiques (CTL) ou le développement de cellules T régulatrices 6 2,7. Le ciblage de l&#39; antigène à CD8a Pos DC en utilisant les résultats de la livraison anti-DEC205-anticorps médiée en grande partie dans la suppression des cellules T 8, alors que la présentation des antigènes dérivés de cellules apoptotiques infectées induit une réponse CTL forte 9. En plus de la reconnaissance des antigènes peptidiques, le système immunitaire des mammifères a évolué pour reconnaître les antigènes de lipides et glycolipides. Ces antigènes sont présentés par des molécules CD1, qui sont du CMH de classe de protéines de surface cellulaire I-like qui existent dans de multiples formes liées à divers mammifères. Chez la souris, un seul type de molécule CD1 hautement conservée appelée CD1 est responsable de la présentation des antigènes glycolipidiques 10. Le principal<html> une population de cellules T qui reconnaissent des complexes CD1d / glycolipides est appelé cellules NKT invariantes (cellules iNKT). Ces cellules expriment un récepteur de cellules T invariantes demi-(TCR) composé d&#39;une chaîne TCRa invariante qui est associée à des chaînes qui ont TCRβ diversité 11 limitées. Contrairement aux cellules T conventionnelles qui doivent proliférer et se différencier en cellules T effectrices activées, les cellules iNKT existent sous la forme d&#39; une population effectrice et commencer à intervenir rapidement après l&#39; administration de 12 glycolipides. L&#39;identification des cellules présentatrices d&#39;antigène lipidique physiologiquement pertinente est un domaine actif de recherche, ainsi que plusieurs types de cellules distinctes telles que des cellules B, les macrophages et les DC ont été proposées pour effectuer cette fonction. Cependant, il a été démontré que le sous - ensemble Pos CD8a de DC est la cellule primaire médiation absorption et la présentation des antigènes aux cellules lipidiques iNKT de souris 13 et des glycolipides à médiation par contre-amorçage des cellules T CD8 14. ove_content &quot;&gt; Pour comparer l&#39;efficacité de la présentation de l&#39;antigène par différentes cellules présentant l&#39;antigène, une approche directe consiste à transférer différents types de TTB purifiées puisées avec des quantités équivalentes de l&#39;antigène dans des hôtes naïfs. expériences de transfert de cellules de ce type sont souvent effectuées pour des études immunologiques. Cependant, la réalisation d&#39; études de transfert avec des DC antigène ex vivo traité est difficile, étant donné que ces cellules existent populations comme rares dans les organes lymphoïdes où ils représentent moins de 2% des cellules totales 15. Il est donc nécessaire de renforcer le développement de ces cellules chez les animaux donneurs d&#39;augmenter l&#39;efficacité des protocoles d&#39;isolement. Il est connu que le lymphoïde commun et progéniteurs myéloïdes communs, qui sont nécessaires pour la production de pDC, CD8 Pos et des sous - ensembles CD8 Neg DC, express liés fms-récepteur tyrosine kinase 3 (Flt-3). Une fois in vivo Flt-3 ligand (Flt-3L) l&#39; administration, emigration de Flt-3 exprimant des cellules progénitrices de la moelle osseuse est augmentée, ce qui entraîne une augmentation de l&#39;ensemencement des organes lymphoïdes périphériques et l&#39;expansion de leur descendance 16 dendritiques matures. L&#39;expression de Flt-3 est perdue lors de l&#39;engagement du B, T ou NK voies de différenciation cellulaire. Par conséquent, seules des modifications minimes sont observées dans ces cellules lors de l&#39;administration Flt-3L. Expansion similaire dans les populations DC est observée chez les souris portant des tumeurs générées par l&#39; implantation d&#39;une lignée de cellules B16-mélanome sécrétant murin Flt-3L, qui fournit une méthode simple et économique pour fournir des niveaux systémiques soutenus de Flt-3L 17,18. En utilisant cette approche, nous avons mis au point un protocole basé sur l&#39;implantation de cellules B16-mélanome sécrétant Flt-3L pour stimuler l&#39;expansion de tous les sous-ensembles DC normaux dans la rate de la souris, ce qui augmente considérablement les rendements de ces cellules qui peuvent être isolées pour des expériences ultérieures . Nous constatons régulièrement que dans les 10 - 14 jours après im sous-cutanéela plantation de la tumeur sécrétant Flt-3, les souris développent une splénomégalie avec un enrichissement notable de DCs pour constituer 40-60% des cellules de rate totales. A partir de ces rates, différents sous-ensembles DC peuvent être isolés avec une grande pureté en utilisant le standard disponibles dans le commerce des kits de purification de cellules qui emploient des marqueurs phénotypiques spécifiques sous-ensemble.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA&#160;</td>
			<td>Life Technologies, Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CDS019936-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase D&#160;</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>11088858001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I (dry powder)</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>79254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 proof ethanol&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>9-6705-004-220</td>
			<td>Used to prepare 70% ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBC lysis buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R7757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 medium with L-glutamine&#160;</td>
			<td>Life Technologies, Gibco</td>
			<td>11875-119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM medium with L-glutamine&#160;</td>
			<td>Life Technologies, Gibco</td>
			<td>11995-073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 mM L-glutamine&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM non-essential amino acids&#160;</td>
			<td>Life Technologies, Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM essential amino acids&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11130-051&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol&#160;</td>
			<td>Life Technologies, Invitrogen</td>
			<td>21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES&#160;</td>
			<td>Life Technologies, Invitrogen</td>
			<td>15630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS Ca2+ and Mg2+ free pH 7.2)</td>
			<td>Life Technologies, Invitrogen</td>
			<td>20012-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s PBS (DPBS with Ca2+ and Mg2+)</td>
			<td>Life Technologies, Gibco</td>
			<td>14040-182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M Ethylenediaminetetraacetate (EDTA) solution&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15575-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11050&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin&#160;</td>
			<td>Life Technologies, Invitrogen</td>
			<td>15140-163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue (dry powder)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6146-5G&#160;</td>
			<td>Prepare 0.08% with PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmacytoid Dendritic Cell Isolation Kit II, mouse</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-092-786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic beads conjugated with anti-mouse CD11c&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-152-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8&#945;Pos mouse DC isolation kit&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-091-169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc-gamma receptor blocking antibody (Clone 2.4G2)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD11c-FITC&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD8&#945;-PerCP&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse B220-PE&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml syringes&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>26048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23 G1 needle&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>305145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Petri dishes&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical instruments&#160;</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>INSMOUSEKIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer (70 &#181;m&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Petri plates&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum filtration system (500 ml(0.22 um&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS columns&#160;</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stand MACS separator&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide-bore 200 &#956;l pipette tips&#160;</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>111623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning ultra-low attachment 96-well plates&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS3474-24EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-8 week old female C57BL/6 mice&#160;</td>
			<td>Jackson Research Laboratories, Jax</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine B16.Flt3L melanoma cell line</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>described by Mach et al. ,2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serum free DMEM and RPMI media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 ml DMEM with L-glutamine, or 500 ml RPMI-1640 with L-glutamine 
			 
			5 ml MEM nonessential amino acids (100x, 10 mM)&#160;&#160;&#160;&#160; 
			 
			5 ml HEPES Buffer (1 M)&#160;&#160;&#160;&#160; 
			 
			5 ml L-glutamine (200 mM)&#160; 
			 
			0.5 ml 2-mercaptoethanol (5.5 x 10-2 M)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix all the ingredients in a biosafety cabinet with either DMEM or RPMI media depending on your need.&#160; Filter sterilize the media by passing through a 0.22 &#181;m vacuum filtration system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete RPMI and DMEM media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Add 50 ml of heat inactivated fetal calf serum to serum free RPMI or DMEM media to obtain complete media.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS buffer:&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Add 2 ml of 0.5 M EDTA and 10 ml of heat inactivated fetal calf serum to 500 ml of Phosphate-buffered saline (PBS, Ca2+ and Mg2+ Free, pH 7.2) and 2 ug/ml 2.4G2 (Fc-Block antibody).&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS staining buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissolve sodium azide to 0.05% (0.25 g per 500 ml) in MACS buffer to obtain FACS staining buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Collagenase D and DNase 1 stock solution 
			Dissolve 1 g of collagenase D and 0.2 ml of DNase 1 stock (1 mg/ml, 100x) in 20 ml of PBS containing Ca++ and Mg++ to obtain a solution of approximately 1,000-</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2,000 Units of collagenase activity per ml 
			 
			This 10x stock solution can be prepared ahead of time and stored at -20 &#176;C for several weeks. Dilute 1 ml of this with 9 ml of serum free RPMI immediately before use</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an efficient and high yield method for isolation of mouse dendritic cell subsets

Les cellules dendritiques (DC) sont des cellules présentatrices d&#39;antigènes professionnelles principalement responsable de l&#39;acquisition, le traitement et la présentation des antigènes sur des molécules présentatrices d&#39;antigènes pour déclencher une immunité des lymphocytes T à médiation. Les cellules dendritiques peuvent être séparés en plusieurs sous-ensembles phénotypiquement et fonctionnellement hétérogènes. Trois sous - ensembles importants de cellules dendritiques spléniques sont plasmacytoïdes, les cellules CD8a Pos et CD8a Neg. Les CD plasmacytoïdes sont des producteurs naturels de l&#39;interféron de type I, et sont importants pour l&#39;immunité anti-viral de cellule T. Le sous - ensemble CD8a Neg DC est spécialisé pour le CMH de classe II présentation de l&#39; antigène et est impliqué dans le centre de l&#39; amorçage des cellules T CD4. Le CD8a Pos PED sont principalement responsables de la présentation croisée des antigènes exogènes et CD8 T amorçage cellulaire. Les CD8a Pos PED ont été démontrés pour être plus efficace lors de la présentation des antigènes glycolipidiques par des molécules CD1d à un T cel spécialisél population connue sous le nom tueuses naturelles invariant cellules T (iNKT). L&#39;administration du ligand de Flt-3 augmente la fréquence de migration des précurseurs de cellules dendritiques provenant de la moelle osseuse, entraînant finalement l&#39;expansion des cellules dendritiques dans les organes lymphoïdes périphériques dans des modèles murins. Nous avons adapté le modèle pour purifier un grand nombre de cellules dendritiques fonctionnelles pour une utilisation dans des expériences de transfert de cellules pour comparer aptitude in vivo des différents sous - ensembles à courant continu.

Le résultat de cette procédure repose sur l&#39;expansion des sous-ensembles DC par murin Flt-3L exprimé par les cellules de mélanome implantées. B16.Flt3L la tumeur est dérivé d&#39;une souris C57BL / 6, et doivent être implantés dans les animaux avec cette souche de fond afin d&#39;éviter l&#39;échec de la tumeur à s&#39;établir en raison du rejet. Dans certains cas, il peut être souhaitable d&#39;utiliser des souris génétiquement modifiées pour dériver les PED avec d...

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An Efficient and High Yield Method for Isolation of Mouse Dendritic Cell Subsets

Distinct dendritic cell subsets exist as rare populations in lymphoid organs, and therefore are challenging to isolate in sufficient numbers and purity for immunological experiments. Here we describe a high efficiency, high yield method for isolation of all of the currently known major subsets of mouse splenic dendritic cells.

Une méthode de rendement efficace et haute pour l&#39;isolement des souris dendritiques sous-ensembles cellulaires

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen ...

The overall goal of this protocol, is to develop of a high efficiency, high yield method for generating dendritic cell or DCs, that fatefully reflect their in-vivo phenotypic and functional divergence. Dendritic cells exist as great populations in lymphoid organs. Therefore, we use filter ligand to increase the frequency of these essential cells in donor tissues to facilitate that isolation.The main advantage of this technique is that it removes generation of all the DC subsets in suitable numbers for analysis using only the commercially available agents. To harvest flt-3 ligand expressing B16 melanoma cells from a 90%confluent culture, first wash the cells with PBS and incubate the culture with 05%trypsin at 37 degrees Celsius. After 5 minutes, quench the protease activity with 20 milliliters of 4 degrees Celsius complete dima medium and detach the adherent cell model layer with light tapping and gentle pipetting.Collect the cells by centrifugation and count them. Then, re-suspend the single cell suspension to a 1 times to the 8 cells per milliliter concentration in PBS for their subcutaneous injection into C57 black 6 recipient mice. When the tumor reaches two to ten milliliters in diameter, harvest the spleens from the tumor bearing animals and place the spleens in a petri dish containing fresh RPMI medium.Using a scalpel, cut the tissues into 0.2 square centimeters pieces, and then incubate the fragments in ten milliliters of collagenase and Dnase at 37 degrees Celsius. After 30 minutes, pour the partially digested tissue slurry onto a 70 micron cell strainer, and use a five milliliter syringe plunger to press the remaining tissue fragments through the mesh of the strainer. Rinse the filter with 10 milliliters of fresh medium, pooling the wash with the rest of the single cell suspension and pellet the cells.We suspend the cell pellet in 2 milliliters of red blood cell lysis buffer at room temperature for 10 minutes. Then wash the cells in 10 milliliters of fresh RPMI medium, and re-suspend them at 1 times 10 to the 8 cells per milliliter in cell sorting buffer containing FC block. To isolate the plasma cytode DCs, thoroughly mix 300 microliters of biotin-labelled antibody cocktail from a plasma cytode DC isolation kit with 200 microliters of the splenic single cell suspension.Place the cells in an ice water bath for 15 minutes, with gentle tapping every three minutes. Then wash the cells with 12 milliliters of cell sorting buffer, and re-suspend the pellet in 500 microliters of fresh sorting buffer. Next, incubate the cells in 300 microliters of anti-biotin, antibody conjugated beads for another 15 minutes in the ice water with regular tapping.After washing the cells in fresh sorting buffer, re-suspend the pallet in 2 milliliters of cell sorting buffer, and load an appropriately sized magnetic column onto its corresponding magnet. Equilibrate the column with five milliliters of fresh 4 degree Celsius cell sorting buffer. When all of the buffer has drained from the top of the column, carefully add the cells to the center of the surface of the column head, and collect the flow-through.Then wash the column with 10 milliliters of fresh, 4 degrees Celsius sorting buffer and collect the flow-through in the same tube. After passage though a second magnetic column, a plasma cytode dendritic cell population with a greater than 94%purity can be expected. To isolate the CD8aplha+and CD8alpha-DCs, mix the rest of the splenic cell suspension with 100 microliters of biotion conjugated antibody cocktail from a CD8alpha+dendritic cell isolation kit for 15 minutes on ice with gentle tapping, as just demonstrated.At the end of the incubation, wash the cells in 12 milliliters of 4 degrees Celsius cell sorting buffer, and re-suspend the pellet in 150 microliters of fresh 4 degrees Celsius cell sorting buffer. Next, mix the cells with 100 microliters of the CD8alpha+dendritic cell isolation kit anti-biotin beads. After 15 minutes on ice with gentle tapping, wash the cells in 10 milliliters of 4 degrees Celsius cell sorting buffer, and re-suspend the pellet in 1 milliliter of fresh 4 degrees Celsius sorting buffer.At the end of the incubation, sort the cells by magnetic bead separation, as just demonstrated, collecting the flow-through and the first wash. Then, spin down the cells and re-suspend the pellet in one milliliter of fresh 4 degrees Celsius cell sorting buffer. Now label the cells with 200 microliters of anti-CD8aplha conjugated magnetic beads from the kit, and pass the cells through a new column, collecting the CD8alpha-dendritic cell flow-through.To collect the CD8alpha+DCs, transfer the column into a 15 milliliter conical tube, and plunge 5 milliliters of fresh 4 degrees Celsius cell sorting buffer though the column. After the running the cells through a second column, a greater than 96%CD8alpha+dendritic cell population can be expected. To isolate the CD8alpha-cells, spin the the CD8alpha-flow-through cell suspension.Then label the cells with 100 microliters of anti-CD11 c-magnetic beads and collect the magnetic bead positive cell population, as just demonstrated, to obtain a greater than 97%CD8alpha-dendritic cell subset population. Finally, determine the number of live cells, by trypan blue exclusion. Once the tumor becomes palpable, the B16 flt-3 ligand tumor bearing mice consistently exhibit a dramatic increase in the splenic cellularity that correlates with the expansion of the splenic dendritic cell subsets.Interestingly, while a 15 to 20-fold increase in the absolute cell numbers is observed for the conventional DCs in these animals, only about a 4-fold increase is observed for the plasma cytode DC subset. The different dendritic cell subsets are characterized according to their B220, CD11b, CD11c and CD8alpha expression. The cell populations also exhibit other unique subset markers, however, with mPDCA1 expressed exclusively on the plasma cytode DCs DEC205 highly expressed on the CD8alpa+DCs, and CD11b and 33D1 detected most prominently on the CD8alpha-DCs.Using this method, we have demonstrated CD8alpa+DCs to be the most efficient in the presentation of antigens by CD bonding molecules to a specialized T-cell population known as invariant NKT cells. The most critical feature of DC isolation is to maintain strict sterility and antidoxant-free conditions. During the procedures, these T-cells are highly responsive to antidoxant.While attempting this procedure, it is important to remember to handle the cells gently, as repeated mechnanical stimulation may alter the maturation state of dendtritic cells. Once mastered, this technique can be used to isolate a high number of all the major DC subsets from single spleen. Thanks for watching and good luck with your experiments.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Optimized Protocol for Efficient Transfection of Dendritic Cells without Cell Maturation

Protocole optimisé pour une transfection efficace des cellules dendritiques, sans maturation cellulaire

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection ...

Recherche

Immunologie et infection

Isolation of Mouse Lung Dendritic Cells

L&#39;isolement des cellules de souris poumon dendritiques

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the ...

Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine

L&#39;isolement et la caractérisation des cellules dendritiques et les macrophages de l&#39;intestin de souris

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and ...

Isolation of Precursor B-cell Subsets from Umbilical Cord Blood

Isolement des précurseurs des cellules B des sous-ensembles à partir de sang de cordon ombilical

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for ...

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

High Yield purification de<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Mérozoïtes Pour utilisation en opsonisants Anticorps dosages

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Souris Naïf CD4<sup&gt; +</sup&gt; Isolement des cellules T et<em&gt; In vitro</em&gt; Différenciation en sous-ensembles de cellules T

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Mise en place d&#39;un programme d&#39;installation à haut débit pour le criblage de petites molécules qui modulent c-di-GMP Signalisation dans<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluorescence-tri cellulaire activé pour la purification de cellules dendritiques plasmacytoïdes de la moelle osseuse de souris

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

An Efficient and Simple Method to Establish NK and T Cell Lines from Patients with Chronic Active Epstein-Barr Virus Infection

Une méthode Simple et efficace pour établir les NK et les lymphocytes T lignes provenant de Patients avec une Infection chronique Active Virus Epstein - Barr

A number of methods have been described to establish NK/T cell lines from patients with lymphoma or lymphoproliferative syndrome. These methods employed ...