Name: an efficient and high yield method for isolation of mouse dendritic cell subsets
Uploaded: 2016-04-18T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Efficient and High Yield Method for Isolation of Mouse Dendritic Cell Subsets at JoVE.com

इस काम के रस प्रवाह करने के लिए एनआईएच / NIAID अनुदान AI45889 द्वारा समर्थित किया गया cytometry अध्ययनों FACS कोर आइंस्टीन कैंसर केंद्र (एनआईएच / NCI CA013330) और केंद्र एड्स अनुसंधान के लिए (एनआईएच / NIAID AI51519) द्वारा समर्थित सुविधाओं का उपयोग कर किए गए।

पशु प्रयोगों संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) से अनुमोदित दिशा निर्देशों के अनुसार किया जाता है। बाँझपन आवश्यकता होती है सभी प्रक्रियाओं एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में प्रदर्शन कर रहे हैं। <p class=...

<ol>
	<li>Steinman, R. M., Cohn, Z. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+novel+cell+type+in+peripheral+lymphoid+organs+of+mice.+I.+Morphology,+quantitation,+tissue+distribution.">Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice. I. Morphology, quantitation, tissue distribution.</a> J Exp Med. 137 (5), 1142-1162 (1973).</li><li>Banchereau, J., Steinman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+and+the+control+of+immunity.">Dendritic cells and the control of immunity.</a> Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).</li><li>Dudziak, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+antigen+processing+by+dendritic+cell+subsets+in+vivo.">Differential antigen processing by dendritic cell subsets in vivo.</a> Science. 315 (5808), 107-111 (2007).</li><li>Belz, G. T., Nutt, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+programming+of+the+dendritic+cell+network.">Transcriptional programming of the dendritic cell network.</a> Nat Rev Immunol. 12 (2), 101-113 (2012).</li><li>den Haan, J. M., Bevan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutive+versus+activation-dependent+cross-presentation+of+immune+complexes+by+CD8(+)+and+CD8(-)+dendritic+cells+in+vivo.">Constitutive versus activation-dependent cross-presentation of immune complexes by CD8(+) and CD8(-) dendritic cells in vivo.</a> J Exp Med. 196 (6), 817-827 (2002).</li><li>Carbone, F. R., Kurts, C., Bennett, S. R., Miller, J. F., Heath, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-presentation:+a+general+mechanism+for+CTL+immunity+and+tolerance.">Cross-presentation: a general mechanism for CTL immunity and tolerance.</a> Immunol Today. 19 (8), 368-373 (1998).</li><li>Yamazaki, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8++CD205++splenic+dendritic+cells+are+specialized+to+induce+Foxp3++regulatory+T+cells.">CD8+ CD205+ splenic dendritic cells are specialized to induce Foxp3+ regulatory T cells.</a> J Immunol. 181 (10), 6923-6933 (2008).</li><li>Mukherjee, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DEC-205-mediated+antigen+targeting+to+steady-state+dendritic+cells+induces+deletion+of+diabetogenic+CD8(+)+T+cells+independently+of+PD-1+and+PD-L1.">DEC-205-mediated antigen targeting to steady-state dendritic cells induces deletion of diabetogenic CD8(+) T cells independently of PD-1 and PD-L1.</a> Int Immunol. 25 (11), 651-660 (2013).</li><li>Melief, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mini-review:+Regulation+of+cytotoxic+T+lymphocyte+responses+by+dendritic+cells:+peaceful+coexistence+of+cross-priming+and+direct+priming.">Mini-review: Regulation of cytotoxic T lymphocyte responses by dendritic cells: peaceful coexistence of cross-priming and direct priming.</a> Eur J Immunol. 33 (10), 2645-2654 (2003).</li><li>Bendelac, A., Savage, P. B., Teyton, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+NKT+cells.">The biology of NKT cells.</a> Annu Rev Immunol. 25, 297-336 (2007).</li><li>Benlagha, K., Bendelac, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD1d-restricted+mouse+V+alpha+14+and+human+V+alpha+24+T+cells:+lymphocytes+of+innate+immunity.">CD1d-restricted mouse V alpha 14 and human V alpha 24 T cells: lymphocytes of innate immunity.</a> Semin Immunol. 12 (6), 537-542 (2000).</li><li>Brennan, P. J., Brigl, M., Brenner, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invariant+natural+killer+T+cells:+an+innate+activation+scheme+linked+to+diverse+effector+functions.">Invariant natural killer T cells: an innate activation scheme linked to diverse effector functions.</a> Nature reviews. Immunology. 13 (2), 101-117 (2013).</li><li>Arora, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+subset+of+dendritic+cells+controls+the+cytokine+bias+of+natural+killer+T+cell+responses+to+diverse+glycolipid+antigens.">A single subset of dendritic cells controls the cytokine bias of natural killer T cell responses to diverse glycolipid antigens.</a> Immunity. 40 (1), 105-116 (2014).</li><li>Semmling, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+cross-priming+through+CCL17-CCR4-mediated+attraction+of+CTLs+toward+NKT+cell-licensed+DCs.">Alternative cross-priming through CCL17-CCR4-mediated attraction of CTLs toward NKT cell-licensed DCs.</a> Nat Immunol. 11 (4), 313-320 (2010).</li><li>Duriancik, D. M., Hoag, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+identification+and+enumeration+of+dendritic+cell+populations+from+individual+mouse+spleen+and+Peyer's+patches+using+flow+cytometric+analysis.">The identification and enumeration of dendritic cell populations from individual mouse spleen and Peyer's patches using flow cytometric analysis.</a> Cytometry A. 75 (11), 951-959 (2009).</li><li>Karsunky, H., Merad, M., Cozzio, A., Weissman, I. L., Manz, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flt3+ligand+regulates+dendritic+cell+development+from+Flt3++lymphoid+and+myeloid-committed+progenitors+to+Flt3++dendritic+cells+in+vivo.">Flt3 ligand regulates dendritic cell development from Flt3+ lymphoid and myeloid-committed progenitors to Flt3+ dendritic cells in vivo.</a> J Exp Med. 198 (2), 305-313 (2003).</li><li>Mach, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+dendritic+cells+stimulated+in+vivo+by+tumors+engineered+to+secrete+granulocyte-macrophage+colony-stimulating+factor+or+Flt3-ligand.">Differences in dendritic cells stimulated in vivo by tumors engineered to secrete granulocyte-macrophage colony-stimulating factor or Flt3-ligand.</a> Cancer Res. 60 (12), 3239-3246 (2000).</li><li>Vremec, D., Segura, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+purification+of+large+numbers+of+antigen+presenting+dendritic+cells+from+mouse+spleen.">The purification of large numbers of antigen presenting dendritic cells from mouse spleen.</a> Methods Mol Biol. 960, 327-350 (2013).</li><li>Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manual+restraint+and+common+compound+administration+routes+in+mice+and+rats.">Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats.</a> J Vis Exp. (67), (2012).</li><li>Reeves, J. P., Reeves, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unit+1.9,+Removal+of+lymphoid+organs.">Unit 1.9, Removal of lymphoid organs.</a> Curr Protoc Immunol. , (2001).</li><li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appendix+3B,+Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability.">Appendix 3B, Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Curr Protoc Immunol. , (2001).</li><li>Vremec, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintaining+dendritic+cell+viability+in+culture.">Maintaining dendritic cell viability in culture.</a> Mol Immunol. 63 (2), 264-267 (2015).</li></ol>

वृक्ष के समान कोशिकाओं प्रमुख पेशेवर टी सेल प्रतिक्रिया की भड़काना में शामिल कोशिकाओं पेश प्रतिजन होने के लिए स्वीकार कर रहे हैं। उनका मुख्य कार्य सर्वेक्षण करने के लिए टी कोशिकाओं को प्रस्तुति के ल?...

वृक्ष के समान कोशिकाओं (डीसी) लगभग चालीस साल पहले की खोज &#39;के रूप में बड़े तारामय (ग्रीक Dendron) सेल &quot;लसीकावत् अंगों 1 में पाए गए। कई अध्ययनों से पता चला है कि डीसी केवल प्रतिजन कोशिकाओं को प्रभावी ढंग से भोले टी कोशिकाओं 2 को प्रोत्साहित कर सकते हैं। इन कोशिकाओं के एक प्रमुख कार्य तेज और एंटीजन की प्रस्तुति और उनके कुशल प्रसंस्करण और इनमें से लोड हो रहा है प्रतिजन अणुओं पर है। माउस तिल्ली में, डीसी plasmacytoid और पारंपरिक सबसेट में विभाजित किया जा सकता है। plasmacytoid डीसी CD11c की कम अभिव्यक्ति और B220 और जीआर -1 के उच्च स्तर की विशेषता है। उन्होंने यह भी सतह मार्कर mPDCA1 के लिए सकारात्मक रहे हैं और प्रकार मैं रिसेप्टर 9 (TLR9) ligands की तरह टोल के जवाब में इंटरफेरॉन छिपाना। पारंपरिक डीसी CD11c और MHC वर्ग द्वितीय अभिव्यक्ति के लिए उच्च रहे हैं। वे तीन अलग तरह के सीडी 4, CD8α, DEC205, सीडी के रूप में प्ररूपी मार्कर की सतह अभिव्यक्ति के आधार पर सबसेट में विभाजित किया जा सकता है11b और वृक्ष के समान सेल रिसेप्टर निरोधात्मक 2 (DCIR2, 33D1 एंटीबॉडी द्वारा मान्यता प्राप्त) प्रोटीन 3,4। CD8α स्थिति DCs भी cDC1 के रूप में जाना जाता है, इस तरह के CD11b और 33D1 के रूप में माइलॉयड मार्करों के लिए DEC205 के लिए सकारात्मक है, लेकिन नकारात्मक हैं। CD8α Neg DCs भी cDC2 कहा जाता है, 33D1, CD11b और सीडी 4 के लिए सकारात्मक हैं, लेकिन DEC205 की कमी है। डबल नकारात्मक सबसेट (यानी, दोनों सीडी 4 और CD8α के लिए नकारात्मक) अपेक्षाकृत दुर्लभ है, और DEC205 और 33D1 के लिए नकारात्मक है। यह कम से कम विशेषता सबसेट है और CD8α Neg डीसी के एक कम विभेदित रूप हो सकता है। विभिन्न डीसी सबसेट में प्ररूपी मतभेद भी उनके vivo कार्यों के लिए करता हूं। CD8α Neg डीसी अत्यधिक phagocytic हैं और मुख्य रूप से सीडी 4 टी कोशिकाओं से 3 MHC वर्ग द्वितीय के माध्यम से बहिर्जात प्रतिजन पेश करने के लिए लगा रहे हैं। इसके विपरीत, CD8α स्थिति डीसी MHC वर्ग मैं पर घुलनशील प्रोटीन प्रतिजन की प्रस्तुति के लिए विशेष कर रहे हैंएक तंत्र में पार प्रस्तुति बुलाया। पार प्रस्तुति के परिणाम इन DCs 5 के सक्रियण की स्थिति पर निर्भर करता है, और या तो साइटोटोक्सिक टी कोशिकाओं (CTLs) या नियामक टी कोशिकाओं 6 2,7 के विकास का विस्तार करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। , मोटे तौर पर टी कोशिकाओं 8 का विलोपन में विरोधी DEC205-एंटीबॉडी की मध्यस्थता वितरण परिणामों का उपयोग CD8α स्थिति डीसी को प्रतिजन का लक्ष्य निर्धारण जबकि संक्रमित apoptotic कोशिकाओं से व्युत्पन्न एंटीजन की प्रस्तुति एक मजबूत सीटीएल प्रतिक्रिया 9 लाती है। पेप्टाइड एंटीजन की मान्यता के अलावा, स्तनधारी प्रतिरक्षा प्रणाली लिपिड और glycolipid एंटीजन पहचान करने के लिए विकसित किया गया है। ये एंटीजन CD1 अणु है, जो MHC वर्ग मैं-तरह कोशिका की सतह प्रोटीन है कि विभिन्न स्तनधारियों में कई संबंधित रूपों में मौजूद हैं द्वारा प्रस्तुत कर रहे हैं। चूहों में, अत्यधिक संरक्षित CD1 अणु का एक प्रकार CD1d बुलाया glycolipid एंटीजन 10 की प्रस्तुति के लिए जिम्मेदार है। प्रमुख<html> टी कोशिकाओं है कि पहचान CD1d / glycolipid परिसरों की आबादी अपरिवर्तनीय NKT कोशिकाओं (iNKT कोशिकाओं) कहा जाता है। इन कोशिकाओं को एक अर्द्ध अपरिवर्तनीय टी सेल रिसेप्टर (TCR) एक अपरिवर्तनीय TCRα श्रृंखला है कि TCRβ श्रृंखला है कि विविधता 11 सीमित है के साथ रखा जाता है से बना व्यक्त करते हैं। पारंपरिक टी कोशिकाओं पैदा करना और सक्रिय प्रेरक टी कोशिकाओं बनने के लिए अंतर करने की जरूरत है कि विपरीत, iNKT कोशिकाओं को एक प्रेरक जनसंख्या के रूप में मौजूद हैं और glycolipid प्रशासन 12 के बाद तेजी से जवाब शुरू करते हैं। physiologically प्रासंगिक लिपिड प्रतिजन कोशिकाओं की पहचान अनुसंधान के एक सक्रिय क्षेत्र है, और इस तरह के बी कोशिकाओं, मैक्रोफेज और डीसी के रूप में कई अलग सेल प्रकार इस समारोह में प्रदर्शन करने के लिए सुझाव दिया गया है। हालांकि, यह प्रदर्शन किया गया है कि डीसी के CD8α स्थिति सबसेट प्राथमिक सेल तेज और लिपिड एंटीजन की प्रस्तुति माउस iNKT कोशिकाओं 13 और glycolipid मध्यस्थता सीडी 8 टी कोशिकाओं 14 के पार भड़काना करने के लिए मध्यस्थता है। ove_content &quot;&gt; विभिन्न प्रतिजन कोशिकाओं द्वारा प्रतिजन प्रस्तुति की क्षमता की तुलना करने के लिए, एक स्पष्ट दृष्टिकोण भोले मेजबान में प्रतिजन के बराबर मात्रा के साथ स्पंदित। शुद्ध APCs इस प्रकार के सेल हस्तांतरण प्रयोगों अक्सर प्रतिरक्षा अध्ययन के लिए प्रदर्शन कर रहे हैं के विभिन्न प्रकार के हस्तांतरण है। हालांकि, पूर्व vivo प्रतिजन इलाज किया डीसी के साथ स्थानांतरण के अध्ययन प्रदर्शन चुनौतीपूर्ण है, क्योंकि इन कोशिकाओं लसीकावत् अंगों जहां वे कुल 15 कोशिकाओं के कम से कम 2% का गठन में रूप में दुर्लभ आबादी मौजूद है। यह दाता पशुओं में इन कोशिकाओं के विकास को बढ़ाने के लिए इसलिए जरूरी है कि अलगाव प्रोटोकॉल की दक्षता बढ़ाने के लिए। यह ज्ञात है कि आम लसीकावत् और आम माइलॉयड पूर्वज है, जो पीडीसी, सीडी 8 स्थिति और सीडी 8 Neg डीसी सबसेट, एक्सप्रेस एफएमएस से संबंधित रिसेप्टर tyrosine kinase 3 (फ्लाइट -3) की पीढ़ी के लिए आवश्यक हैं। पर इन विवो फ्लाइट 3 ligand (फ्लाइट 3 एल) प्रशासन, emigratफ्लाइट 3 अस्थि मज्जा से पूर्वज कोशिकाओं को व्यक्त करने के आयन वृद्धि हुई है, परिधीय लसीकावत् अंगों की वृद्धि हुई बोने और उनके परिपक्व डीसी संतान 16 के विस्तार में जिसके परिणामस्वरूप। फ्लाइट -3 की अभिव्यक्ति बी, टी या एन.के. सेल भेदभाव रास्ते के लिए अपनी प्रतिबद्धता के दौरान खो दिया है। इसलिए, केवल न्यूनतम परिवर्तन फ्लाइट 3 एल प्रशासन पर इन कोशिकाओं में मनाया जाता है। डीसी आबादी में इसी प्रकार के विस्तार असर एक B16 मेलेनोमा सेल स्रावित murine फ्लाइट 3L, जो फ्लाइट 3 एल 17,18 के निरंतर प्रणालीगत स्तर प्रदान करने के लिए एक सरल और किफायती तरीका प्रदान करता है लाइन का आरोपण द्वारा उत्पन्न ट्यूमर चूहों में मनाया जाता है। इस दृष्टिकोण का प्रयोग, हम फ्लाइट 3 एल स्रावित माउस तिल्ली में सभी सामान्य डीसी सबसेट के विस्तार को प्रोत्साहित करने के लिए, इस प्रकार बहुत इन कोशिकाओं है कि बाद के प्रयोगों के लिए अलग किया जा सकता है की पैदावार बढ़ाने B16-मेलेनोमा कोशिकाओं का प्रत्यारोपण के आधार पर एक प्रोटोकॉल विकसित किया है । 14 दिनों के चमड़े के नीचे आईएम के बाद - हम लगातार कि 10 के भीतर मिलकुल तिल्ली कोशिकाओं के 60% - फ्लाइट 3 स्रावित ट्यूमर का वृक्षारोपण, चूहों का गठन करने के लिए 40 डीसी के रूप में चिह्नित संवर्धन के साथ तिल्ली का बढ़ना विकसित करना। इन spleens से, अलग डीसी सबसेट उच्च शुद्धता मानक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सेल शुद्धि किट कि सबसेट विशेष प्ररूपी मार्कर को रोजगार का उपयोग के साथ अलग किया जा सकता है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA&#160;</td>
			<td>Life Technologies, Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CDS019936-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase D&#160;</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>11088858001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I (dry powder)</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>79254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 proof ethanol&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>9-6705-004-220</td>
			<td>Used to prepare 70% ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBC lysis buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R7757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 medium with L-glutamine&#160;</td>
			<td>Life Technologies, Gibco</td>
			<td>11875-119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM medium with L-glutamine&#160;</td>
			<td>Life Technologies, Gibco</td>
			<td>11995-073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 mM L-glutamine&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM non-essential amino acids&#160;</td>
			<td>Life Technologies, Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM essential amino acids&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11130-051&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol&#160;</td>
			<td>Life Technologies, Invitrogen</td>
			<td>21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES&#160;</td>
			<td>Life Technologies, Invitrogen</td>
			<td>15630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS Ca2+ and Mg2+ free pH 7.2)</td>
			<td>Life Technologies, Invitrogen</td>
			<td>20012-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s PBS (DPBS with Ca2+ and Mg2+)</td>
			<td>Life Technologies, Gibco</td>
			<td>14040-182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M Ethylenediaminetetraacetate (EDTA) solution&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15575-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11050&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin&#160;</td>
			<td>Life Technologies, Invitrogen</td>
			<td>15140-163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue (dry powder)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6146-5G&#160;</td>
			<td>Prepare 0.08% with PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmacytoid Dendritic Cell Isolation Kit II, mouse</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-092-786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic beads conjugated with anti-mouse CD11c&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-152-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8&#945;Pos mouse DC isolation kit&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-091-169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc-gamma receptor blocking antibody (Clone 2.4G2)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD11c-FITC&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD8&#945;-PerCP&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse B220-PE&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml syringes&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>26048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23 G1 needle&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>305145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Petri dishes&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical instruments&#160;</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>INSMOUSEKIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer (70 &#181;m&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Petri plates&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum filtration system (500 ml(0.22 um&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS columns&#160;</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stand MACS separator&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide-bore 200 &#956;l pipette tips&#160;</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>111623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning ultra-low attachment 96-well plates&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS3474-24EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-8 week old female C57BL/6 mice&#160;</td>
			<td>Jackson Research Laboratories, Jax</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine B16.Flt3L melanoma cell line</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>described by Mach et al. ,2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serum free DMEM and RPMI media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 ml DMEM with L-glutamine, or 500 ml RPMI-1640 with L-glutamine 
			 
			5 ml MEM nonessential amino acids (100x, 10 mM)&#160;&#160;&#160;&#160; 
			 
			5 ml HEPES Buffer (1 M)&#160;&#160;&#160;&#160; 
			 
			5 ml L-glutamine (200 mM)&#160; 
			 
			0.5 ml 2-mercaptoethanol (5.5 x 10-2 M)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix all the ingredients in a biosafety cabinet with either DMEM or RPMI media depending on your need.&#160; Filter sterilize the media by passing through a 0.22 &#181;m vacuum filtration system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete RPMI and DMEM media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Add 50 ml of heat inactivated fetal calf serum to serum free RPMI or DMEM media to obtain complete media.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS buffer:&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Add 2 ml of 0.5 M EDTA and 10 ml of heat inactivated fetal calf serum to 500 ml of Phosphate-buffered saline (PBS, Ca2+ and Mg2+ Free, pH 7.2) and 2 ug/ml 2.4G2 (Fc-Block antibody).&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS staining buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissolve sodium azide to 0.05% (0.25 g per 500 ml) in MACS buffer to obtain FACS staining buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Collagenase D and DNase 1 stock solution 
			Dissolve 1 g of collagenase D and 0.2 ml of DNase 1 stock (1 mg/ml, 100x) in 20 ml of PBS containing Ca++ and Mg++ to obtain a solution of approximately 1,000-</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2,000 Units of collagenase activity per ml 
			 
			This 10x stock solution can be prepared ahead of time and stored at -20 &#176;C for several weeks. Dilute 1 ml of this with 9 ml of serum free RPMI immediately before use</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an efficient and high yield method for isolation of mouse dendritic cell subsets

वृक्ष के समान कोशिकाओं (डीसी) पेशेवर प्रतिजन पेश प्राप्त प्रसंस्करण और प्रतिजन अणुओं पेश टी सेल की मध्यस्थता प्रतिरक्षा को आरंभ करने के लिए पर एंटीजन पेश करने के लिए मुख्य रूप से जिम्मेदार कोशिकाओं रहे हैं। वृक्ष के समान कोशिकाओं कई phenotypically और कार्यात्मक विषम सबसेट में विभाजित किया जा सकता है। प्लीहा वृक्ष के समान कोशिकाओं के तीन महत्वपूर्ण सबसेट, plasmacytoid हैं CD8α स्थिति और CD8α Neg कोशिकाओं। plasmacytoid डीसी प्रकार मैं इंटरफेरॉन का प्राकृतिक उत्पादक हैं और विरोधी वायरल टी सेल प्रतिरक्षा के लिए महत्वपूर्ण हैं। CD8α Neg डीसी सबसेट MHC वर्ग द्वितीय प्रतिजन प्रस्तुति के लिए विशेष है और केन्द्र सीडी 4 टी कोशिकाओं भड़काना में शामिल है। CD8α स्थिति डीसी बहिर्जात एंटीजन और CD8 टी सेल भड़काना के पार प्रस्तुति के लिए मुख्य रूप से जिम्मेदार हैं। CD8α स्थिति DCs एक विशेष टी सेल को CD1d अणुओं द्वारा glycolipid एंटीजन की प्रस्तुति पर सबसे कुशल होने के लिए प्रदर्शन किया गया हैएल अपरिवर्तनीय प्राकृतिक हत्यारा टी (iNKT) कोशिकाओं के रूप में जाना जाता आबादी। फ्लाइट 3 ligand के प्रशासन अस्थि मज्जा से वृक्ष के समान सेल progenitors के पलायन की आवृत्ति बढ़ जाती है, अंततः murine मॉडल में परिधीय लसीकावत् अंगों में वृक्ष के समान कोशिकाओं के विस्तार में जिसके परिणामस्वरूप। हम सेल हस्तांतरण प्रयोगों में इस्तेमाल के विभिन्न डीसी सबसेट के vivo प्रवीणता की तुलना करने के लिए कार्यात्मक वृक्ष के समान कोशिकाओं की बड़ी संख्या को शुद्ध करने के लिए इस मॉडल ढाल लिया है।

इस प्रक्रिया के परिणाम murine फ्लाइट 3 एल द्वारा डीसी सबसेट के विस्तार प्रत्यारोपित मेलेनोमा कोशिकाओं द्वारा व्यक्त की पर निर्भर करता है। B16.Flt3L ट्यूमर एक C57BL / 6 माउस से निकाला गया था, और ट्यूमर अस्...

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An Efficient and High Yield Method for Isolation of Mouse Dendritic Cell Subsets

Distinct dendritic cell subsets exist as rare populations in lymphoid organs, and therefore are challenging to isolate in sufficient numbers and purity for immunological experiments. Here we describe a high efficiency, high yield method for isolation of all of the currently known major subsets of mouse splenic dendritic cells.

माउस वृक्ष के समान सेल सबसेट के अलगाव के लिए एक कुशल और उच्च उपज विधि

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen ...

The overall goal of this protocol, is to develop of a high efficiency, high yield method for generating dendritic cell or DCs, that fatefully reflect their in-vivo phenotypic and functional divergence. Dendritic cells exist as great populations in lymphoid organs. Therefore, we use filter ligand to increase the frequency of these essential cells in donor tissues to facilitate that isolation.The main advantage of this technique is that it removes generation of all the DC subsets in suitable numbers for analysis using only the commercially available agents. To harvest flt-3 ligand expressing B16 melanoma cells from a 90%confluent culture, first wash the cells with PBS and incubate the culture with 05%trypsin at 37 degrees Celsius. After 5 minutes, quench the protease activity with 20 milliliters of 4 degrees Celsius complete dima medium and detach the adherent cell model layer with light tapping and gentle pipetting.Collect the cells by centrifugation and count them. Then, re-suspend the single cell suspension to a 1 times to the 8 cells per milliliter concentration in PBS for their subcutaneous injection into C57 black 6 recipient mice. When the tumor reaches two to ten milliliters in diameter, harvest the spleens from the tumor bearing animals and place the spleens in a petri dish containing fresh RPMI medium.Using a scalpel, cut the tissues into 0.2 square centimeters pieces, and then incubate the fragments in ten milliliters of collagenase and Dnase at 37 degrees Celsius. After 30 minutes, pour the partially digested tissue slurry onto a 70 micron cell strainer, and use a five milliliter syringe plunger to press the remaining tissue fragments through the mesh of the strainer. Rinse the filter with 10 milliliters of fresh medium, pooling the wash with the rest of the single cell suspension and pellet the cells.We suspend the cell pellet in 2 milliliters of red blood cell lysis buffer at room temperature for 10 minutes. Then wash the cells in 10 milliliters of fresh RPMI medium, and re-suspend them at 1 times 10 to the 8 cells per milliliter in cell sorting buffer containing FC block. To isolate the plasma cytode DCs, thoroughly mix 300 microliters of biotin-labelled antibody cocktail from a plasma cytode DC isolation kit with 200 microliters of the splenic single cell suspension.Place the cells in an ice water bath for 15 minutes, with gentle tapping every three minutes. Then wash the cells with 12 milliliters of cell sorting buffer, and re-suspend the pellet in 500 microliters of fresh sorting buffer. Next, incubate the cells in 300 microliters of anti-biotin, antibody conjugated beads for another 15 minutes in the ice water with regular tapping.After washing the cells in fresh sorting buffer, re-suspend the pallet in 2 milliliters of cell sorting buffer, and load an appropriately sized magnetic column onto its corresponding magnet. Equilibrate the column with five milliliters of fresh 4 degree Celsius cell sorting buffer. When all of the buffer has drained from the top of the column, carefully add the cells to the center of the surface of the column head, and collect the flow-through.Then wash the column with 10 milliliters of fresh, 4 degrees Celsius sorting buffer and collect the flow-through in the same tube. After passage though a second magnetic column, a plasma cytode dendritic cell population with a greater than 94%purity can be expected. To isolate the CD8aplha+and CD8alpha-DCs, mix the rest of the splenic cell suspension with 100 microliters of biotion conjugated antibody cocktail from a CD8alpha+dendritic cell isolation kit for 15 minutes on ice with gentle tapping, as just demonstrated.At the end of the incubation, wash the cells in 12 milliliters of 4 degrees Celsius cell sorting buffer, and re-suspend the pellet in 150 microliters of fresh 4 degrees Celsius cell sorting buffer. Next, mix the cells with 100 microliters of the CD8alpha+dendritic cell isolation kit anti-biotin beads. After 15 minutes on ice with gentle tapping, wash the cells in 10 milliliters of 4 degrees Celsius cell sorting buffer, and re-suspend the pellet in 1 milliliter of fresh 4 degrees Celsius sorting buffer.At the end of the incubation, sort the cells by magnetic bead separation, as just demonstrated, collecting the flow-through and the first wash. Then, spin down the cells and re-suspend the pellet in one milliliter of fresh 4 degrees Celsius cell sorting buffer. Now label the cells with 200 microliters of anti-CD8aplha conjugated magnetic beads from the kit, and pass the cells through a new column, collecting the CD8alpha-dendritic cell flow-through.To collect the CD8alpha+DCs, transfer the column into a 15 milliliter conical tube, and plunge 5 milliliters of fresh 4 degrees Celsius cell sorting buffer though the column. After the running the cells through a second column, a greater than 96%CD8alpha+dendritic cell population can be expected. To isolate the CD8alpha-cells, spin the the CD8alpha-flow-through cell suspension.Then label the cells with 100 microliters of anti-CD11 c-magnetic beads and collect the magnetic bead positive cell population, as just demonstrated, to obtain a greater than 97%CD8alpha-dendritic cell subset population. Finally, determine the number of live cells, by trypan blue exclusion. Once the tumor becomes palpable, the B16 flt-3 ligand tumor bearing mice consistently exhibit a dramatic increase in the splenic cellularity that correlates with the expansion of the splenic dendritic cell subsets.Interestingly, while a 15 to 20-fold increase in the absolute cell numbers is observed for the conventional DCs in these animals, only about a 4-fold increase is observed for the plasma cytode DC subset. The different dendritic cell subsets are characterized according to their B220, CD11b, CD11c and CD8alpha expression. The cell populations also exhibit other unique subset markers, however, with mPDCA1 expressed exclusively on the plasma cytode DCs DEC205 highly expressed on the CD8alpa+DCs, and CD11b and 33D1 detected most prominently on the CD8alpha-DCs.Using this method, we have demonstrated CD8alpa+DCs to be the most efficient in the presentation of antigens by CD bonding molecules to a specialized T-cell population known as invariant NKT cells. The most critical feature of DC isolation is to maintain strict sterility and antidoxant-free conditions. During the procedures, these T-cells are highly responsive to antidoxant.While attempting this procedure, it is important to remember to handle the cells gently, as repeated mechnanical stimulation may alter the maturation state of dendtritic cells. Once mastered, this technique can be used to isolate a high number of all the major DC subsets from single spleen. Thanks for watching and good luck with your experiments.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Optimized Protocol for Efficient Transfection of Dendritic Cells without Cell Maturation

सेल परिपक्वता के बिना वृक्ष के समान कोशिकाओं के कुशल अभिकर्मक के लिए अनुकूलित प्रोटोकॉल

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection ...

Isolation of Mouse Lung Dendritic Cells

माउस फेफड़े वृक्ष के समान कोशिकाओं का अलगाव

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the ...

Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine

अलगाव और और माउस आंत से वृक्ष के समान कोशिकाओं मैक्रोफेज की विशेषता

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and ...

Isolation of Precursor B-cell Subsets from Umbilical Cord Blood

अग्रदूत बी सेल सबसेट के गर्भनाल रक्त से अलगाव

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for ...

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

हाई यील्ड शोधन की<em&gt; प्लाज्मोडियम फाल्सीपेरम</emOpsonizing एंटीबॉडी Assays में इस्तेमाल के लिए&gt; खंडजाणु

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

माउस भोले सीडी 4<sup&gt; +</sup&gt; टी सेल अलगाव और<em&gt; इन विट्रो</em&gt; टी सेल सबसेट में भेदभाव

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

छोटे अणुओं मिलाना सी-di-जीएमपी में संकेत है कि जांच के लिए एक उच्च throughput सेटअप की स्थापना<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

माउस अस्थि मज्जा से Plasmacytoid वृक्ष के समान कोशिकाओं की शुद्धि के लिए प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छंटनी

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

An Efficient and Simple Method to Establish NK and T Cell Lines from Patients with Chronic Active Epstein-Barr Virus Infection

जीर्ण सक्रिय Epstein-बर्र वायरस संक्रमण के साथ रोगियों से NK और टी सेल लाइनों की स्थापना करने के लिए एक कुशल और सरल तरीका

A number of methods have been described to establish NK/T cell lines from patients with lymphoma or lymphoproliferative syndrome. These methods employed ...