Name: a simple bioassay for the evaluation of vascular endothelial growth factors
Uploaded: 2016-03-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Simple Bioassay for the Evaluation of Vascular Endothelial Growth Factors at JoVE.com

SAS and MGA are supported by Project Grants, a Program Grant and Research Fellowships from the National Health and Medical Research Council of Australia (NHMRC), and by funds from the Operational Infrastructure Support Program provided by the Victorian Government, Australia. MMH has support from a Peter MacCallum Foundation Grant.

Moyenne Source de l&#39;IL-3 et préparation de WEHI-3D-conditionné Remarque: La lignée cellulaire de la leucémie myéloïde de la souris WEHI-3D ​​est mis en culture pour produire un milieu conditionné contenant l&#39;IL-3. <ol><li> La culture des cellules WEHI-3D ​​en milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM), 10% de sérum de fœtus bovin (FBS), 1% de supplément de glutamine de longue durée, 50 pg / ml de gentamicine. Inoculer 5 × 10 6 cellules en phase de c...

<ol>
	<li>Ferrara, N., Gerber, H. P., LeCouter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+VEGF+and+its+receptors.">The biology of VEGF and its receptors.</a> Nat Med. 9, 669-676 (2003).</li><li>Achen, M. G., Stacker, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+growth+factor-D:signalling+mechanisms,+biology+and+clinical+relevance.">Vascular endothelial growth factor-D:signalling mechanisms, biology and clinical relevance.</a> Growth Factors. 5, 283-296 (2012).</li><li>Ferrara, N., Mass, R. D., Campa, C., Kim, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+VEGF-A+to+treat+cancer+and+age-related+macular+degeneration.">Targeting VEGF-A to treat cancer and age-related macular degeneration.</a> Annu Rev Med. 58, 491-504 (2007).</li><li>Ferrara, N., Hillan, K. J., Gerber, H. P., Novotny, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+and+development+of+bevacizumab,+an+anti-VEGF+antibody+for+treating+cancer.">Discovery and development of bevacizumab, an anti-VEGF antibody for treating cancer.</a> Nat Rev Drug Discov. 3, 391-400 (2004).</li><li>Korpelainen, E. I., Alitalo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+angiogenesis+and+lymphangiogenesis.">Signaling angiogenesis and lymphangiogenesis.</a> Curr Opin Cell Biol. 10, 159-164 (1998).</li><li>Senger, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+cells+secrete+a+vascular+permeability+factor+that+promotes+accumulation+of+ascities+fluid.">Tumour cells secrete a vascular permeability factor that promotes accumulation of ascities fluid.</a> Science. 219, 983-985 (1983).</li><li>Joukov, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+vascular+endothelial+growth+factor,+VEGF-C,+is+a+ligand+for+the+Flt-4+(VEGFR-3)+and+KDR+(VEGFR-2)+receptor+tyrosine+kinases.">A novel vascular endothelial growth factor, VEGF-C, is a ligand for the Flt-4 (VEGFR-3) and KDR (VEGFR-2) receptor tyrosine kinases.</a> EMBO J. 15, 290-298 (1996).</li><li>Achen, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+growth+factor+D+(VEGF-D)+is+a+ligand+for+the+tyrosine+kinases+VEGF+receptor+2+(Flk1)+and+VEGF+receptor+3+(Flt4).">Vascular endothelial growth factor D (VEGF-D) is a ligand for the tyrosine kinases VEGF receptor 2 (Flk1) and VEGF receptor 3 (Flt4).</a> Proc Natl Acad Sci USA. 95, 548-553 (1998).</li><li>Leppanen, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+determinants+of+vascular+endothelial+growth+factor-D+receptor+binding+and+specificity.">Structural determinants of vascular endothelial growth factor-D receptor binding and specificity.</a> Blood. 117, 1507-1515 (2011).</li><li>Wise, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+growth+factor+(VEGF)-like+protein+from+orf+virus+NZ2+binds+to+VEGFR2+and+neuropilin-1.">Vascular endothelial growth factor (VEGF)-like protein from orf virus NZ2 binds to VEGFR2 and neuropilin-1.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 96, 3071-3076 (1999).</li><li>Yamazaki, Y., Takani, K., Atoda, H., Morita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Snake+venom+vascular+endothelial+growth+factors+(VEGFs)+exhibit+potent+activity+through+their+specific+recognition+of+KDR+(VEGF+receptor+2).">Snake venom vascular endothelial growth factors (VEGFs) exhibit potent activity through their specific recognition of KDR (VEGF receptor 2).</a> J Biol Chem. 278, 51985-51988 (2003).</li><li>Stacker, S. A., Achen, M. G., Jussila, L., Baldwin, M. E., Alitalo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphangiogenesis+and+cancer+metastasis.">Lymphangiogenesis and cancer metastasis.</a> Nat Rev Cancer. 2, 573-583 (2002).</li><li>Stacker, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF-D+promotes+the+metastatic+spread+of+tumor+cells+via+the+lymphatics.">VEGF-D promotes the metastatic spread of tumor cells via the lymphatics.</a> Nat Med. 7, 186-191 (2001).</li><li>Skobe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+tumor+lymphangiogenesis+by+VEGF-C+promotes+breast+cancer+metastasis.">Induction of tumor lymphangiogenesis by VEGF-C promotes breast cancer metastasis.</a> Nat Med. 7, 192-198 (2001).</li><li>Mandriota, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+growth+factor-C-mediated+lymphangiogenesis+promotes+tumour+metastasis.">Vascular endothelial growth factor-C-mediated lymphangiogenesis promotes tumour metastasis.</a> EMBO J. 20, 672-682 (2001).</li><li>Stacker, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphangiogenesis+and+lymphatic+vessel+remodelling+in+cancer.">Lymphangiogenesis and lymphatic vessel remodelling in cancer.</a> Nat Rev Cancer. 14, 159-172 (2014).</li><li>Karnezis, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF-D+promotes+tumor+metastasis+by+regulating+prostaglandins+produced+by+the+collecting+lymphatic+endothelium.">VEGF-D promotes tumor metastasis by regulating prostaglandins produced by the collecting lymphatic endothelium.</a> Cancer Cell. 21, 181-195 (2012).</li><li>Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis:+an+organizing+principle+for+drug+discovery.">Angiogenesis: an organizing principle for drug discovery.</a> Nat Rev Drug Discov. 6, 273-286 (2007).</li><li>Stacker, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthesis+of+vascular+endothelial+growth+factor-D+involves+proteolytic+processing+which+generates+non-covalent+homodimers.">Biosynthesis of vascular endothelial growth factor-D involves proteolytic processing which generates non-covalent homodimers.</a> J Biol Chem. 274, 32127-32136 (1999).</li><li>McColl, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmin+activates+the+lymphangiogenic+growth+factors+VEGF-C+and+VEGF-D.">Plasmin activates the lymphangiogenic growth factors VEGF-C and VEGF-D.</a> J Exp Med. 198, 863-868 (2003).</li><li>Jaffe, E. A., Nachman, R. L., Becker, C. G., Minick, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+human+endothelial+cells+derived+from+umbilical+veins.+Identification+by+morphologic+and+immunologic+criteria.">Culture of human endothelial cells derived from umbilical veins. Identification by morphologic and immunologic criteria.</a> J Clin Invest. 52, 2745-2756 (1973).</li><li>Shibuya, M., Claesson-Welsh, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+transduction+by+VEGF+receptors+in+regulation+of+angiogenesis+and+lymphangiogenesis.">Signal transduction by VEGF receptors in regulation of angiogenesis and lymphangiogenesis.</a> Exp Cell Res. 312, 549-560 (2006).</li><li>Pacifici, R. E., Thomason, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+tyrosine+kinase/cytokine+receptors+transmit+mitogenic+signals+in+response+to+ligand.">Hybrid tyrosine kinase/cytokine receptors transmit mitogenic signals in response to ligand.</a> J Biol Chem. 269, 1571-1574 (1994).</li><li>Stacker, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mutant+form+of+vascular+endothelial+growth+factor+(VEGF)+that+lacks+VEGF+receptor-2+activation+retains+the+ability+to+induce+vascular+permeability.">A mutant form of vascular endothelial growth factor (VEGF) that lacks VEGF receptor-2 activation retains the ability to induce vascular permeability.</a> J Biol Chem. 274, 34884-34892 (1999).</li><li>Davydova, N., Roufail, S., Streltsov, V. A., Stacker, S. A., Achen, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+VD1+neutralizing+antibody+to+vascular+endothelial+growth+factor-D:+binding+epitope+and+relationship+to+receptor+binding.">The VD1 neutralizing antibody to vascular endothelial growth factor-D: binding epitope and relationship to receptor binding.</a> J Mol Biol. 407, 581-593 (2011).</li><li>Wise, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+vascular+endothelial+growth+factors+vary+extensively+in+amino+acid+sequence,+receptor-binding+specificities,+and+the+ability+to+induce+vascular+permeability+yet+are+uniformly+active+mitogens.">Viral vascular endothelial growth factors vary extensively in amino acid sequence, receptor-binding specificities, and the ability to induce vascular permeability yet are uniformly active mitogens.</a> J Biol Chem. 278, 38004-38014 (2003).</li><li>Davydova, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+human+vascular+endothelial+growth+factor-D+for+structural+and+preclinical+therapeutic+studies.">Preparation of human vascular endothelial growth factor-D for structural and preclinical therapeutic studies.</a> Protein Expr. Purif. 82, 232-239 (2012).</li><li>Baldwin, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+forms+of+mouse+vascular+endothelial+growth+factor-D+are+generated+by+RNA+splicing+and+proteolysis.">Multiple forms of mouse vascular endothelial growth factor-D are generated by RNA splicing and proteolysis.</a> J. Biol. Chem. 276, 44307-44314 (2001).</li><li>Baldwin, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+specificity+of+receptor+binding+by+vascular+endothelial+growth+factor-D+is+different+in+mouse+and+man.">The specificity of receptor binding by vascular endothelial growth factor-D is different in mouse and man.</a> J. Biol. Chem. 276, 19166-19171 (2001).</li><li>Makinen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolated+lymphatic+endothelial+cells+transduce+growth,+survival+and+migratory+signals+via+the+VEGF-C/D+receptor+VEGFR-3.">Isolated lymphatic endothelial cells transduce growth, survival and migratory signals via the VEGF-C/D receptor VEGFR-3.</a> EMBOJ. 20, 4762-4773 (2001).</li><li>Achen, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibodies+to+vascular+endothelial+growth+factor-D+block+its+interactions+with+both+VEGF+receptor-2+and+VEGF+receptor-3.">Monoclonal antibodies to vascular endothelial growth factor-D block its interactions with both VEGF receptor-2 and VEGF receptor-3.</a> Eur J Biochem. 267, 2505-2515 (2000).</li><li>Bamford, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+COSMIC+(Catalogue+of+Somatic+Mutations+in+Cancer)+database+and+website.">The COSMIC (Catalogue of Somatic Mutations in Cancer) database and website.</a> Br J Cancer. 91, 355-358 (2004).</li><li>Pleasance, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+catalogue+of+somatic+mutations+from+a+human+cancer+genome.">A comprehensive catalogue of somatic mutations from a human cancer genome.</a> Nature. 463, 191-196 (2010).</li></ol>

L&#39;essai décrit ici repose sur l&#39;utilisation de cellules de grande viabilité, qui dépendent des facteurs de croissance. Les cellules doivent donc être soigneusement cultivées pour assurer qu&#39;ils sont le facteur de charge, et de conserver l&#39;expression du récepteur chimérique. Veiller à ce que le milieu est fraîchement préparé et non stocké pendant une période excessivement longue et que WEHI-CM 3D est très actif est important. Les cellules doivent être soigneusement lavés à partir de IL-3 ...

La famille de facteur de croissance vasculaire endothélial (VEGF), les facteurs de croissance des protéines sécrétées et leurs congénères des récepteurs de surface cellulaire est un groupe important et diversifié de ligands solubles et des récepteurs de la membrane-embedded, respectivement cette fonction dans la transduction des signaux à travers les membranes cellulaires. Ils fonctionnent principalement dans les cellules endothéliales , mais également dans des cellules d&#39;origine épithéliale et ceux du 1,2- du système immunitaire. Les voies de signalisation engagées par les récepteurs activés par des ligands VEGF (VEGFR) sont essentiels dans des pathologies majeures telles que la dégénérescence et le cancer maculaire liée à l&#39;âge, et les thérapeutiques qui leur sont destinés sont en utilisation clinique fréquente (par exemple, le bevacizumab anticorps monoclonal qui cible VEGF-A) 3,4. L&#39;une des complexités de la famille de VEGF est la diversité des ligands solubles présents dans la nature (VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, les protéines de VEGF codées par le orf de famille des virus parapox et venin de serpent VEGF, ainsi que d&#39;autres inhibiteurisoformes du VEGF-A) 2. Ces ligands interagissent avec les trois membres de la famille tyrosine kinase du récepteur, à savoir VEGFR-1, VEGFR-2 et VEGFR-3. Ces récepteurs sont variablement exprimés sur différents types de cellules , mais sont souvent co-exprimés sur la surface des cellules endothéliales qui tapissent les vaisseaux sanguins et lymphatiques de toutes tailles 5. VEGFR-2 peut se lier à des ligands de mammifère VEGF-A 6, le VEGF-C et VEGF-7 8,9 D ainsi que le virus orf VEGF 10 et 11 de venin de serpent VEGF. VEGFR-2 joue un rôle majeur dans l&#39;angiogenèse (la croissance de nouveaux vaisseaux sanguins à partir de vaisseaux préexistants) dans le développement embryonnaire, la cicatrisation des plaies, le cancer et les maladies oculaires conduite. Dans ces contextes, les ligands tels que le VEGF-A, -C et -D se lient et activent le récepteur sur les cellules endothéliales vasculaires sanguines 12-15. Sur les cellules endothéliales lymphatiques, VEGFR-2 joue un rôle dans la lymphangiogenèse, la formation de nouveaux vaisseaux lymphatiques 16. VEGFR2 peut également favoriser la dilatation et de l&#39; expansion des grandes artères et des vaisseaux lymphatiques dans les tissus et les maladies 17 sains. Une compréhension complète de VEGFR-2: interactions ligand est donc important pour le développement d&#39;inhibiteurs pour une utilisation dans le traitement de maladies dépendantes de l&#39; angiogenèse 18. Alors que la plupart des isoformes du VEGF-A se lient à VEGFR-2, le clivage protéolytique de VEGF-C et VEGF-D est nécessaire pour libérer un fragment constitué par le domaine VEGF-homologie qui présente la liaison à VEGFR-2 19,20 haute affinité. Nous avons mis au point un test biologique pour surveiller les ligands de VEGFR-2 qui est conçu pour contourner la nécessité pour les cellules endothéliales primaires, qui sont techniquement difficiles à passage, coûteux à l&#39; achat et de la culture (nécessitant moyen spécialisé) 21 et d&#39; exprimer plusieurs VEGFR et co - associé 22 récepteurs. Hétérodimérisation de VEGFR-2 avec d&#39;autres récepteurs du VEGF ou co-récepteurs peut provoquer la complexité indésirable lorsque l&#39;on cherche à goujoninteractions y binaires récepteur-ligand, en évaluant l&#39; activité attribuable à un récepteur spécifique, ou évaluant l&#39;effet des réactifs inhibiteurs. 23. L&#39;essai biologique conserve la mobilité du récepteur concerné dans la membrane cellulaire et permet d&#39;évaluer la capacité d&#39;un ligand à se lier et à réticuler la région extracellulaire de VEGFR-2. L&#39;essai biologique repose sur la création d&#39;un récepteur chimère dans lequel la région extracellulaire d&#39;un récepteur de VEGF (dans ce cas, VEGFR-2) est fusionnée à l&#39;extrémité régions transmembranaires et intracellulaires du récepteur de l&#39;érythropoïétine (EpoR), un membre de la famille des récepteurs de cytokines 8,24. Cette protéine de fusion est ensuite exprimée dans la lignée cellulaire pro-B dépendant du facteur Ba / F3, sur lequel la stimulation avec un ligand capable de se lier et de réticulation du domaine extracellulaire du récepteur entraîne l&#39;activation de la région effectrice cytoplasmique, qui est capable de transduire un signal de survie via Janus kinases (JAK) pour promouvoir la cellulela survie et / ou la prolifération. En revanche, l&#39;expression de pleine longueur de VEGFR-2 dans le même type de cellules et la stimulation avec le ligand, ne favorise pas la survie et la prolifération cellulaire, ce qui indique que les effecteurs de signalisation proximale de la voie de VEGFR-2 ne sont pas disponibles dans ce type de cellule. Nous avons utilisé le test dans une variété de contextes pour explorer la liaison de nouveaux VEGFR-2 ligands 10,19,20,24-29. En combinaison avec un essai / F3 VEGFR-3-EpoR-Ba, nous avons comparé les activités relatives du VEGF-C et les facteurs de croissance VEGF-D pour la liaison et la réticulation de VEGFR-2 et VEGFR-3 30. L&#39;essai a été utilisé pour caractériser l&#39;activité d&#39; inhibition de la neutralisation des anticorps monoclonaux contre le VEGFR-2 ou VEGF-D, soluble dans VEGFR-2 et le piège peptidomimétiques ciblant la famille VEGF 31. L&#39;essai a également été utilisé pour montrer la capacité de VEGF à partir de différentes souches de virus orf de lier et de cross-link VEGFR-2 avant le test dans les cellules endothéliales primaires <sup&gt; 10,26. L&#39;essai est particulièrement utile pour le criblage rapide de mutants de VEGF qui peuvent être rapidement évaluées pour l&#39; activité avant qu&#39;ils ne soient introduits dans les dosages de cellules endothéliales plus laborieuse lorsque les protocoles 25 ou l&#39; évaluation de la croissance de purification 27 facteurs. L&#39;essai, nous décrivons est facile à réaliser, et la version semi-quantitative permet des déterminations rapides qui sont parfois nécessaires lors de la surveillance de la production ou la purification des facteurs de croissance, des anticorps ou des domaines de récepteurs solubles pour d&#39;autres expériences. La facilité d&#39;utilisation de l&#39;essai, il est un complément idéal à d&#39;autres études et plus complètes réalisées avec des cellules endothéliales primaires dérivées de vaisseaux sanguins ou lymphatiques à partir de tissus spécifiques ou systèmes d&#39;organes.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1110">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:323px;">Trypan Blue</td>
			<td style="width:183px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:181px;">T8154</td>
			<td style="width:424px;">0.4% solution in PBS is used 1:1 with cell suspensions to measure viable cells. Hazard-may cause cancer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">G418 Sulphate (Geneticin)</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-gn-5</td>
			<td>Agent for selecting transfected eukaryotic cells. Hazard-may cause allergy or asthma symptoms or breathing difficluties.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">3H-Thymidine</td>
			<td style="width:183px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:181px;">NET-027</td>
			<td>This radioactive nucleoside is incorporated into chromosomal DNA during mitosis. Hazard-radiation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vialight Plus Kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>LT07-221</td>
			<td>Bioluminescent detection of cellular ATP to quantify viability, using ATP Monitoring Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Prestoblue Cell Viability Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A13261</td>
			<td>Resazurin-based indicator of cell viability. Turns red in color in the reducing environment of the cell</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Nunc Minitray with Nunclon Delta Surface (72 well)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>136528</td>
			<td>Small microtitre plate</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:323px;">96 well Tissue Culture Plate</td>
			<td style="width:183px;">Falcon, Corning Inc.</td>
			<td style="width:181px;">353072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:323px;">DMEM (1X)</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td style="width:181px;">11965-92</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:323px;">GlutaMAX (100X)</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td style="width:181px;">35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:323px;">Foetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td style="width:181px;">&#160;10099-141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cell Harvester</td>
			<td style="width:183px;">Tomtec Life Sciences</td>
			<td style="width:181px;">N/A</td>
			<td>Tomtec Harvester, 96 Mach 3M Cell Harvester</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Liquid Scintillation Counter</td>
			<td style="width:183px;">LKB Wallac</td>
			<td style="width:181px;">1205</td>
			<td>LKB Wallac 1205 Betaplate Scintillation Counter</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:323px;">UniFilter-96 GF/B</td>
			<td style="width:183px;">Perkin Elmer</td>
			<td>6005177</td>
			<td>White 96-well Barex Microplate with GF/B filterof 1 &#181;m poresize</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:323px;">Gentamicin</td>
			<td style="width:183px;">Gibco, Life Technologies</td>
			<td style="width:181px;">15750-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:183px;">Gibco, Life Technologies</td>
			<td style="width:181px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:323px;">0.22um pore cellulose acetate centrifuge tube filter unit</td>
			<td style="width:183px;">Costar, Corning Inc.</td>
			<td style="width:181px;">8160</td>
			<td>Centrifuge tube filters have a 0.22&#181;m pore CA membrane-containing filter unit within a 500&#181;l capacity polypropylene microcentrifuge tube.</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Fluorescence Reader</td>
			<td style="width:183px;">BioTek</td>
			<td style="width:181px;">N/A</td>
			<td>BioTek Synergy 4 Hybrid Microplate Reader&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple bioassay for the evaluation of vascular endothelial growth factors

L&#39;analyse des tyrosine kinases des récepteurs et leurs ligands impliqués dans l&#39;interaction de la biologie vasculaire est souvent difficile en raison de l&#39;expression constitutive de la famille des récepteurs apparentés, une large gamme de ligands associés et de la difficulté de traiter des cultures primaires de cellules endotheliales spécialisées. Nous décrivons ici un essai biologique pour la détection de ligands du facteur de croissance vasculaire endothélial récepteur-2 (VEGFR-2), un transducteur de signaux clés qui favorisent l&#39;angiogenèse et la lymphangiogenèse. Un ADNc codant pour une fusion de la région extracellulaire (liaison de ligand) de VEGFR-2 avec les régions transmembranaires et cytoplasmiques du récepteur de l&#39;érythropoïétine (EpoR) est exprimée dans la lignée cellulaire dépendante du facteur de Ba / F3. Cette lignée cellulaire se développe en présence d&#39;interleukine-3 (IL-3) et le retrait de ce facteur entraîne la mort des cellules dans les 24 heures. L&#39;expression de la / EpoR fusion du récepteur VEGFR-2 fournit un autre mécanisme pour favoriser la survie et potentially prolifération de cellules Ba / F3 transfectées de façon stable en présence d&#39;un ligand capable de se lier et de réticulation de la partie extracellulaire de la protéine de fusion ( par exemple, celui qui peut réticuler la région extracellulaire du VEGFR-2). Le test peut être réalisé de deux façons: une approche semi-quantitative dans laquelle de petits volumes de ligand et les cellules permettent un résultat rapide en 24 heures, et une approche quantitative impliquant des marqueurs de substitution d&#39;un certain nombre de cellules viables. L&#39;essai est relativement facile à réaliser, est très sensible à VEGFR-2 connus et peuvent accueillir des ligands inhibiteurs extracellulaires de VEGFR-2 de signalisation tels que des anticorps monoclonaux dirigés contre le récepteur ou des ligands et des pièges de ligands solubles.

Dans cette section, nous montrons les résultats d&#39;une expérience démontrant les caractéristiques essentielles d&#39;un bioessai VEGFR-2-EpoR-Ba / F3 (voir la figure 1 pour les principes de l&#39;essai). D&#39; autres études publiées démontrent des applications plus larges de l&#39;essai pour d&#39; autres VEGFR-2 ligands, molécules de VEGF mutantes et des anticorps monoclonaux inhibiteurs 8,10,19,24-30. <p class="jove_content" fo:keep-together....

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A Simple Bioassay for the Evaluation of Vascular Endothelial Growth Factors

Nous décrivons un test biologique simple, basée sur des cellules pour la détection, la quantification et le suivi de l&#39;activité des membres de la famille du facteur de croissance endothélial vasculaire des ligands. L&#39;essai utilise des récepteurs chimères exprimés dans une lignée cellulaire dépendant du facteur de fournir une évaluation semi-quantitative ou quantitative de la liaison au récepteur et la réticulation par le ligand.

Un bioessai simple pour l&#39;évaluation des facteurs de croissance endothélial vasculaire

The analysis of receptor tyrosine kinases and their interacting ligands involved in vascular biology is often challenging due to the constitutive ...

The overall goal of this simple, cell-based bioassay is to detect, quantify, and monitor the activity of members of the vascular endothelial growth factor family of ligins. This method can answer key questions in vascular biology, virology, cancer, and opthamology, where VEG-FR family ligins radiate key processes in these diseases. The main advantage of this assay is it allows evaluation of VEG-FM family ligins in terms of their capacity to bind and cross link their different receptors without requiring specialized epithelial cells.Culture the IL3 secreting cell line WEHI-3D by pipetting five times ten to the sixth cells in the log face of growth into four to ten T175 flasks containing 50 millimeters of fresh culture medium. Incubate for seven days or until the cells have passed their log phase of growth by about 24 to 48 hours. Decant the fluid and cells from the flasks.And spin at 1, 000 Gs for 15 minutes to remove cells and cellular debris. Then remove the top 90%of supernaytent and filter it through a 0.22 micron filter unit. Aliquot the conditioned medium into one milliliter aliquots for assay preparation.50 milliliter aliquots for making culture medium to passage a factor dependent cell lines and 200 milliliter volumes for long term storage at 20 degree Celsius. Store the smaller volumes at 20 Celsius. Culture control BAF3 cells in culture media containing 10%WEHI-3D conditioned medium.and VegFR2-EPoR-BAF3 cells in the same media plus one milligram per milliliter G418. Passage cells at one to 15 dilutions from cells growing in log phase. Harvest control BAF3 or VegFR2VPoR-BAF3 cells for mid log phase cultures.By gently pipetting to remove the cells from the bottom of the flask centrifuge at 750 Gs for five minutes to recover cell pellet. Re-suspend the pellet in 10 milliliters of mouse tonicity phosphate buffered saline and centrifuge again at 750 Gs for five minutes. Repeat the wash two further times to remove medium containing IL3.Wash the cells once using media without DEHI-3D conditioned medium. It is important to wash away culture medium containing IL3 to ensure that no additional growth factors remain, which might generate a false positive result or high background activity. After centrifuging and discarding the supernayten re-suspend cells in the same IL3 free medium at a concentration of 7.4 times 10 to the fourth cells per milliliter.Finally mix equal volumes of trypan blue in PBS with a cell population and load into a hemacytometer. Count at least 100 cells. Cells that take up the dye are considered dead or dying.It is critical that cells used for the assay have high viability to ensure they are able to respond their assay conditions. Use a well calibrated P20 automated pipet and autoclaved tips to add 1, 000 cells in 13.5 microliters of IL deficient medium to the wells of a 72 well plate. Take care to mix the cell suspension during aliquoting to ensure cell settling by gravity does not bias cell concentration.Use a well calibrated P2 pipet to add 1.5 microliters of IL3 free media in triplicate to the control wells. Intrictery to mix. In the same manner add the 10%WEHI-3D conditioned medium and the 100 nanograms per milliliter VegFA no IL3 control to the desired wells.Finally add 1.5 microliters of the test samples in triplicate. Fill any unused wells of the microwell plate with sterile water, PBS or medium. Place water soaked tissue paper in a gas permeable container to create a humidified chamber that allows gas exchange.Incubate the assay plates in the chambers in a humidified atmosphere of 10%carbon dioxide for 16 hours. After 16 hours of incubation analyze the plates using a standard inverted phase microscope at 40 to 100x magnification. At this time it is possible to discriminate between positive and negative samples.Wells without support of growth factors or with medium alone will have reduced numbers of round cells as well as dead or dying cells and cellular debris. Whereas cells incubated with medium containing IL3 or ligin for VegFR2 are large and translucent and there is no or minimal evidence of granularity in the cell cytoplasm or cell debris in the culture. Add 10, 000 washed cells in 135 microliters of IL3 deficient medium to the wells of a standard 96 well plate.Use a calibrated P20 pipet to add 15 microliters of the test samples and controls to the wells. Incubate the mixture of cells growth factors and/or inhibitor agents as before for 48 hours. At the completion of the incubation period evaluate the number of viable cells in the wells using the methods outlined in the written portion of the protocol.Here are represented results of an assay in which the VEGF-R2 EPoR BAF3 bioassay is used to quantify the activity of the three recumbent human ligins with specificity for VEGF-R2. VEGF-A165, VEGF-C, and VEGF-D. Activity was quantified in the presence of bevacizumab, an inhibitory monoclonal antibody to VEGF-A165 or in the presence of trastuzumab, a non neutralizing antibody.Data have been normalized versus the response to VEGF-A165 alone. As expected bevacizumab blocked the effect of VEGF-A165 in the assay but had no effect on the activity of VEGF-C and VEGF-D. Cells exposed to IL3 were highly viable.Whereas those exposed to no additional growth factor show poor viability. When attempting this procedure it's important to bare in mind that they're a range of controlling agents in conditioned media that need to be generated prior to the assay. This technique paved the way for resurgence in vascular biology, virology, cancer and opthomology to explore the role of VEG-FM in ligins.After watching this video you should have a good understanding how to prepare the bioassay cells, to run the bioassay and to conduct the quantitative or semiquantitative analyses of VEG-FM ligin activity.

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