Name: a simple bioassay for the evaluation of vascular endothelial growth factors
Uploaded: 2016-03-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Simple Bioassay for the Evaluation of Vascular Endothelial Growth Factors at JoVE.com

SAS and MGA are supported by Project Grants, a Program Grant and Research Fellowships from the National Health and Medical Research Council of Australia (NHMRC), and by funds from the Operational Infrastructure Support Program provided by the Victorian Government, Australia. MMH has support from a Peter MacCallum Foundation Grant.

מקור IL-3 ו הכנת אחד מעמיתי המחקר-3D ממוזג בינוני הערה: תא לוקמיה granulocytic העכבר קו אחד מעמיתי המחקר-3D הוא תרבותי כדי ליצור בינוני מותנה המכיל IL-3. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות, אחד מעמיתי המחקר-3D ב בינוני של הנ...

<ol>
	<li>Ferrara, N., Gerber, H. P., LeCouter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+VEGF+and+its+receptors.">The biology of VEGF and its receptors.</a> Nat Med. 9, 669-676 (2003).</li><li>Achen, M. G., Stacker, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+growth+factor-D:signalling+mechanisms,+biology+and+clinical+relevance.">Vascular endothelial growth factor-D:signalling mechanisms, biology and clinical relevance.</a> Growth Factors. 5, 283-296 (2012).</li><li>Ferrara, N., Mass, R. D., Campa, C., Kim, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+VEGF-A+to+treat+cancer+and+age-related+macular+degeneration.">Targeting VEGF-A to treat cancer and age-related macular degeneration.</a> Annu Rev Med. 58, 491-504 (2007).</li><li>Ferrara, N., Hillan, K. J., Gerber, H. P., Novotny, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+and+development+of+bevacizumab,+an+anti-VEGF+antibody+for+treating+cancer.">Discovery and development of bevacizumab, an anti-VEGF antibody for treating cancer.</a> Nat Rev Drug Discov. 3, 391-400 (2004).</li><li>Korpelainen, E. I., Alitalo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+angiogenesis+and+lymphangiogenesis.">Signaling angiogenesis and lymphangiogenesis.</a> Curr Opin Cell Biol. 10, 159-164 (1998).</li><li>Senger, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+cells+secrete+a+vascular+permeability+factor+that+promotes+accumulation+of+ascities+fluid.">Tumour cells secrete a vascular permeability factor that promotes accumulation of ascities fluid.</a> Science. 219, 983-985 (1983).</li><li>Joukov, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+vascular+endothelial+growth+factor,+VEGF-C,+is+a+ligand+for+the+Flt-4+(VEGFR-3)+and+KDR+(VEGFR-2)+receptor+tyrosine+kinases.">A novel vascular endothelial growth factor, VEGF-C, is a ligand for the Flt-4 (VEGFR-3) and KDR (VEGFR-2) receptor tyrosine kinases.</a> EMBO J. 15, 290-298 (1996).</li><li>Achen, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+growth+factor+D+(VEGF-D)+is+a+ligand+for+the+tyrosine+kinases+VEGF+receptor+2+(Flk1)+and+VEGF+receptor+3+(Flt4).">Vascular endothelial growth factor D (VEGF-D) is a ligand for the tyrosine kinases VEGF receptor 2 (Flk1) and VEGF receptor 3 (Flt4).</a> Proc Natl Acad Sci USA. 95, 548-553 (1998).</li><li>Leppanen, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+determinants+of+vascular+endothelial+growth+factor-D+receptor+binding+and+specificity.">Structural determinants of vascular endothelial growth factor-D receptor binding and specificity.</a> Blood. 117, 1507-1515 (2011).</li><li>Wise, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+growth+factor+(VEGF)-like+protein+from+orf+virus+NZ2+binds+to+VEGFR2+and+neuropilin-1.">Vascular endothelial growth factor (VEGF)-like protein from orf virus NZ2 binds to VEGFR2 and neuropilin-1.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 96, 3071-3076 (1999).</li><li>Yamazaki, Y., Takani, K., Atoda, H., Morita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Snake+venom+vascular+endothelial+growth+factors+(VEGFs)+exhibit+potent+activity+through+their+specific+recognition+of+KDR+(VEGF+receptor+2).">Snake venom vascular endothelial growth factors (VEGFs) exhibit potent activity through their specific recognition of KDR (VEGF receptor 2).</a> J Biol Chem. 278, 51985-51988 (2003).</li><li>Stacker, S. A., Achen, M. G., Jussila, L., Baldwin, M. E., Alitalo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphangiogenesis+and+cancer+metastasis.">Lymphangiogenesis and cancer metastasis.</a> Nat Rev Cancer. 2, 573-583 (2002).</li><li>Stacker, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF-D+promotes+the+metastatic+spread+of+tumor+cells+via+the+lymphatics.">VEGF-D promotes the metastatic spread of tumor cells via the lymphatics.</a> Nat Med. 7, 186-191 (2001).</li><li>Skobe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+tumor+lymphangiogenesis+by+VEGF-C+promotes+breast+cancer+metastasis.">Induction of tumor lymphangiogenesis by VEGF-C promotes breast cancer metastasis.</a> Nat Med. 7, 192-198 (2001).</li><li>Mandriota, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+growth+factor-C-mediated+lymphangiogenesis+promotes+tumour+metastasis.">Vascular endothelial growth factor-C-mediated lymphangiogenesis promotes tumour metastasis.</a> EMBO J. 20, 672-682 (2001).</li><li>Stacker, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphangiogenesis+and+lymphatic+vessel+remodelling+in+cancer.">Lymphangiogenesis and lymphatic vessel remodelling in cancer.</a> Nat Rev Cancer. 14, 159-172 (2014).</li><li>Karnezis, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF-D+promotes+tumor+metastasis+by+regulating+prostaglandins+produced+by+the+collecting+lymphatic+endothelium.">VEGF-D promotes tumor metastasis by regulating prostaglandins produced by the collecting lymphatic endothelium.</a> Cancer Cell. 21, 181-195 (2012).</li><li>Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis:+an+organizing+principle+for+drug+discovery.">Angiogenesis: an organizing principle for drug discovery.</a> Nat Rev Drug Discov. 6, 273-286 (2007).</li><li>Stacker, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthesis+of+vascular+endothelial+growth+factor-D+involves+proteolytic+processing+which+generates+non-covalent+homodimers.">Biosynthesis of vascular endothelial growth factor-D involves proteolytic processing which generates non-covalent homodimers.</a> J Biol Chem. 274, 32127-32136 (1999).</li><li>McColl, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmin+activates+the+lymphangiogenic+growth+factors+VEGF-C+and+VEGF-D.">Plasmin activates the lymphangiogenic growth factors VEGF-C and VEGF-D.</a> J Exp Med. 198, 863-868 (2003).</li><li>Jaffe, E. A., Nachman, R. L., Becker, C. G., Minick, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+human+endothelial+cells+derived+from+umbilical+veins.+Identification+by+morphologic+and+immunologic+criteria.">Culture of human endothelial cells derived from umbilical veins. Identification by morphologic and immunologic criteria.</a> J Clin Invest. 52, 2745-2756 (1973).</li><li>Shibuya, M., Claesson-Welsh, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+transduction+by+VEGF+receptors+in+regulation+of+angiogenesis+and+lymphangiogenesis.">Signal transduction by VEGF receptors in regulation of angiogenesis and lymphangiogenesis.</a> Exp Cell Res. 312, 549-560 (2006).</li><li>Pacifici, R. E., Thomason, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+tyrosine+kinase/cytokine+receptors+transmit+mitogenic+signals+in+response+to+ligand.">Hybrid tyrosine kinase/cytokine receptors transmit mitogenic signals in response to ligand.</a> J Biol Chem. 269, 1571-1574 (1994).</li><li>Stacker, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mutant+form+of+vascular+endothelial+growth+factor+(VEGF)+that+lacks+VEGF+receptor-2+activation+retains+the+ability+to+induce+vascular+permeability.">A mutant form of vascular endothelial growth factor (VEGF) that lacks VEGF receptor-2 activation retains the ability to induce vascular permeability.</a> J Biol Chem. 274, 34884-34892 (1999).</li><li>Davydova, N., Roufail, S., Streltsov, V. A., Stacker, S. A., Achen, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+VD1+neutralizing+antibody+to+vascular+endothelial+growth+factor-D:+binding+epitope+and+relationship+to+receptor+binding.">The VD1 neutralizing antibody to vascular endothelial growth factor-D: binding epitope and relationship to receptor binding.</a> J Mol Biol. 407, 581-593 (2011).</li><li>Wise, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+vascular+endothelial+growth+factors+vary+extensively+in+amino+acid+sequence,+receptor-binding+specificities,+and+the+ability+to+induce+vascular+permeability+yet+are+uniformly+active+mitogens.">Viral vascular endothelial growth factors vary extensively in amino acid sequence, receptor-binding specificities, and the ability to induce vascular permeability yet are uniformly active mitogens.</a> J Biol Chem. 278, 38004-38014 (2003).</li><li>Davydova, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+human+vascular+endothelial+growth+factor-D+for+structural+and+preclinical+therapeutic+studies.">Preparation of human vascular endothelial growth factor-D for structural and preclinical therapeutic studies.</a> Protein Expr. Purif. 82, 232-239 (2012).</li><li>Baldwin, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+forms+of+mouse+vascular+endothelial+growth+factor-D+are+generated+by+RNA+splicing+and+proteolysis.">Multiple forms of mouse vascular endothelial growth factor-D are generated by RNA splicing and proteolysis.</a> J. Biol. Chem. 276, 44307-44314 (2001).</li><li>Baldwin, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+specificity+of+receptor+binding+by+vascular+endothelial+growth+factor-D+is+different+in+mouse+and+man.">The specificity of receptor binding by vascular endothelial growth factor-D is different in mouse and man.</a> J. Biol. Chem. 276, 19166-19171 (2001).</li><li>Makinen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolated+lymphatic+endothelial+cells+transduce+growth,+survival+and+migratory+signals+via+the+VEGF-C/D+receptor+VEGFR-3.">Isolated lymphatic endothelial cells transduce growth, survival and migratory signals via the VEGF-C/D receptor VEGFR-3.</a> EMBOJ. 20, 4762-4773 (2001).</li><li>Achen, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibodies+to+vascular+endothelial+growth+factor-D+block+its+interactions+with+both+VEGF+receptor-2+and+VEGF+receptor-3.">Monoclonal antibodies to vascular endothelial growth factor-D block its interactions with both VEGF receptor-2 and VEGF receptor-3.</a> Eur J Biochem. 267, 2505-2515 (2000).</li><li>Bamford, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+COSMIC+(Catalogue+of+Somatic+Mutations+in+Cancer)+database+and+website.">The COSMIC (Catalogue of Somatic Mutations in Cancer) database and website.</a> Br J Cancer. 91, 355-358 (2004).</li><li>Pleasance, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+catalogue+of+somatic+mutations+from+a+human+cancer+genome.">A comprehensive catalogue of somatic mutations from a human cancer genome.</a> Nature. 463, 191-196 (2010).</li></ol>

Assay המתואר כאן מסתמך על שימוש בתאים של כדאיויות גבוהות, אשר תלויים בגורמי צמיחה. תאים ולכן צריכים להיות מתורבת בקפידה כדי לוודא שהם גורמים תלויים, ולשמר ביטוי של הקולטן chimeric. הבטיח כי המדיום הוא עשה טרי ולא מאוחסן לתקופת זמן ממושכת מדי וכי אחד מעמיתי המחקר-3D CM הוא מאוד ...

הגורם (vascular endothelial growth VEGF) המשפחה של גורמי גדילה חלבון המופרש ו קולטנים בתא השטח מאותו מקור שלהם היא קבוצה חשובה ומגוונת של הליגנדים מסיסים קולטני-מוטבע הממברנה, בהתאמה כי הפונקציה transducing אותות על פני קרום התא. הן מתפקדות בעיקר בתאי האנדותל אלא גם בתאים ממוצא אפיתל ואלה של 1,2 מערכת החיסון. מסלולי איתות עוסקת ידי קולטני VEGF המופעל ליגנד (VEGFRs) הן קריטיות פתולוגיות הגדולות, כגון ניוון וסרטן מקולרי הקשור לגיל, ותרופות מיקוד מהם נמצאים בשימוש קליני תכופים (למשל, bevacizumab נוגדן חד-שבטי שמכוונת-A VEGF) 3,4. אחת המורכבויות של משפחת VEGF הוא המגוון של הליגנדים מסיסים הנוכחי בטבע (-A VEGF, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, חלבונים VEGF המקודדים על ידי ORF המשפחה וירוס parapox ו VEGF ארס נחשים, בתוספת אחרים מעכבisoforms של VEGF-A) 2. ליגנדים אלה אינטראקציה עם שלושה מבני משפחת טירוזין קינאז קולטן, כלומר VEGFR-1, VEGFR-2 ו VEGFR-3. קולטנים אלה באים לידי ביטוי variably על תאים מסוגים שונים, אך לעתים קרובות הם הביעו במשותף על פני השטח של תאי האנדותל המרפדים את כלי הדם הלימפה מכל הגדלים 5. VEGFR-2 יכול לחייב את יונקים הליגנדים VEGF-A 6, VEGF-C 7 ו VEGF-D 8,9 וכן ORF וירוס 10 VEGF ו- נחש ארס 11 VEGF. VEGFR-2 משחק תפקיד מרכזי בהנעת אנגיוגנזה (צמיחת כלי דם חדשים מכלי קיימים) ב ההתפתחות העוברית, ריפוי פצעים, סרטן ומחלות עיניים. בהקשרים אלה, הליגנדים כגון-A VEGF, לאגד -C ו -D ולהפעיל את הקולטן על תאי האנדותל של כלי דם דם 12-15. על תאי אנדותל הלימפה, VEGFR-2 ממלא תפקיד lymphangiogenesis, היווצרות של כלי הלימפה חדש 16. VEGFR-2 יכול גם לקדם התרחבות והרחבת העורקים הגדולים lymphatics בתאים בריאים המחלה 17. הבנה מלאה של VEGFR-2: אינטראקציות ליגנד לכן חשובה לפיתוח מעכבים לשימוש בטיפול במחלות תלויה אנגיוגנזה 18. בעוד שרוב isoforms של VEGF-A נקשר VEGFR-2, מחשוף פרוטאוליטים של VEGF-C ו- VEGF-D נדרש לשחרר שבר המורכב של תחום VEGF-ההומולוגיה שמספק זיקה גבוהה מחייבת VEGFR-2 19,20. פתחנו מבדק לפקח ליגנדים של VEGFR-2 אשר נועד לעקוף את הצורך בתאי האנדותל עיקריים, אשר קשים מבחינה טכנית למעבר, יקרים לרכישת תרבות (הדורשים בינוני מיוחד) 21 ולהביע VEGFRs מרובה הקשורים שיתוף קולטני 22. Heterodimerization של VEGFR-2 עם קולטנים VEGF אחרים או-קולטנים שיתוף יכול לגרום מורכבות רצויות כאשר מכוון כדי הרבעהקולטן ליגנד אינטראקציות בינארי y, הערכת פעילות מיוחסת קולטן מסוים, או בהערכת ההשפעה של חומרים כימיים מעכבות. 23. המבדק שומר ניידות של הקולטן הרלוונטי בקרום התא ומאפשר הערכה של יכולתו של ליגנד לקשור קשר צולב באזור תאיים VEGFR-2. המבדק מסתמך על יצירת קולטן chimeric בו נמצא האזור תאיים של קולטן VEGF (במקרה זה VEGFR-2) הוא קיבע את הטרנסממברני ואזורים תאיים של קולטן אריתרופואטין (EpoR), חבר של המשפחה הקולטן ציטוקינים 8,24. חלבון היתוך זו בא לידי ביטוי אז הקו הסלולרי פרו-B תלוי הגורם Ba / F3, שעליו גירוי עם ליגנד מסוגל מחייב צולבות המקשרים את התחום התאי של הקולטן גורם הפעלה של האזור מפעיל cytoplasmic, מסוגל של transducing אות הישרדות באמצעות קינאזות יאנוס (JAKs) לקדם התאהישרדות ו / או התפשטות. לעומת זאת, הביטוי של VEGFR-2 באורך מלא בסוג התא אותו, וגירוי עם ליגנד, אינו מקדם הישרדות התא ושגשוגם, המציין כי effectors איתות הפרוקסימלי של מסלול VEGFR-2 אינם זמינים סוג תא זה. השתמשנו assay במגוון בהקשרים לחקור מחייב של הליגנדים VEGFR-2 הרומן 10,19,20,24-29. בשילוב עם assay VEGFR-3-EpoR-Ba / F3, השווינו את הפעילות היחסית של VEGF-C ו- גורמי גדילה VEGF-D לקשירה cross-linking VEGFR-2 ו VEGFR-3 30. את assay נעשה שימוש כדי לאפיין את פעילות המעכבת של נוגדנים מנטרלים חד-שבטיים כדי VEGFR-2 או VEGF-D, מלכודת VEGFR-2 מסיסים peptidomimetics מיקוד המשפחה VEGF 31. את assay שימש גם להראות את היכולת של VEGFs מן זני נגיף ORF שונים לקשור קשר צולב VEGFR-2 לפני הבדיקה בתאי האנדותל העיקרי <sעד&gt; 10,26. Assay הוא שימושי במיוחד עבור לסינון המהיר של מוטציות של VEGFs אשר ניתן להעריך במהירות לפעילות לפני שהם מוצגים בפני מבחני תא האנדותל המייגעים יותר 25 או כאשר פרוטוקולי הערכה לצמיחת טיהור גורמי 27. את assay אנו מתארים הוא קל לביצוע, והגרסה וכמותיות מאפשרת לקביעות מהירה שלפעמים נדרשות כאשר הניטור בייצור או הטיהור של גורמי גדילה, נוגדנים או תחומי קולטן מסיסים לניסויים אחרים. קלות השימוש של assay עושות את זה אידיאלי המשלים עוד ועוד מחקרים מלאים הופיעו עם תאי אנדותל עיקריים נגזרו דם או כלי לימפה מרקמות ספציפיות או מערכות איברים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1110">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:323px;">Trypan Blue</td>
			<td style="width:183px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:181px;">T8154</td>
			<td style="width:424px;">0.4% solution in PBS is used 1:1 with cell suspensions to measure viable cells. Hazard-may cause cancer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">G418 Sulphate (Geneticin)</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-gn-5</td>
			<td>Agent for selecting transfected eukaryotic cells. Hazard-may cause allergy or asthma symptoms or breathing difficluties.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">3H-Thymidine</td>
			<td style="width:183px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:181px;">NET-027</td>
			<td>This radioactive nucleoside is incorporated into chromosomal DNA during mitosis. Hazard-radiation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vialight Plus Kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>LT07-221</td>
			<td>Bioluminescent detection of cellular ATP to quantify viability, using ATP Monitoring Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Prestoblue Cell Viability Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A13261</td>
			<td>Resazurin-based indicator of cell viability. Turns red in color in the reducing environment of the cell</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Nunc Minitray with Nunclon Delta Surface (72 well)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>136528</td>
			<td>Small microtitre plate</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:323px;">96 well Tissue Culture Plate</td>
			<td style="width:183px;">Falcon, Corning Inc.</td>
			<td style="width:181px;">353072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:323px;">DMEM (1X)</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td style="width:181px;">11965-92</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:323px;">GlutaMAX (100X)</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td style="width:181px;">35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:323px;">Foetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td style="width:181px;">&#160;10099-141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cell Harvester</td>
			<td style="width:183px;">Tomtec Life Sciences</td>
			<td style="width:181px;">N/A</td>
			<td>Tomtec Harvester, 96 Mach 3M Cell Harvester</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Liquid Scintillation Counter</td>
			<td style="width:183px;">LKB Wallac</td>
			<td style="width:181px;">1205</td>
			<td>LKB Wallac 1205 Betaplate Scintillation Counter</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:323px;">UniFilter-96 GF/B</td>
			<td style="width:183px;">Perkin Elmer</td>
			<td>6005177</td>
			<td>White 96-well Barex Microplate with GF/B filterof 1 &#181;m poresize</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:323px;">Gentamicin</td>
			<td style="width:183px;">Gibco, Life Technologies</td>
			<td style="width:181px;">15750-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:183px;">Gibco, Life Technologies</td>
			<td style="width:181px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:323px;">0.22um pore cellulose acetate centrifuge tube filter unit</td>
			<td style="width:183px;">Costar, Corning Inc.</td>
			<td style="width:181px;">8160</td>
			<td>Centrifuge tube filters have a 0.22&#181;m pore CA membrane-containing filter unit within a 500&#181;l capacity polypropylene microcentrifuge tube.</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Fluorescence Reader</td>
			<td style="width:183px;">BioTek</td>
			<td style="width:181px;">N/A</td>
			<td>BioTek Synergy 4 Hybrid Microplate Reader&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple bioassay for the evaluation of vascular endothelial growth factors

הניתוח של טירוזין קינאז הקולטן הליגנדים האינטראקציה שלהם מעורב ביולוגיה וסקולרית הרבה פעמים הוא מאתגר בשל הביטוי המכונן של משפחות של רצפטורים קשורים, מגוון רחב של הליגנדים המתייחסים ואת הקושי להתמודד עם תרבויות עיקריות של תאי אנדותל מיוחדים. כאן אנו מתארים מבדק לצורך זיהוי של הליגנדים לגורם צמיחה של אנדותל כלי דם קולטן 2 (VEGFR-2), מתמר מפתח של אותות המקדמים אנגיוגנזה lymphangiogenesis. CDNA קידוד היתוך של האזור (ליגנד המחייבת) תאיים של VEGFR-2 עם הטרנסממברני ואזורי cytoplasmic של הקולטן אריתרופואטין (EpoR) מתבטא הקו הסלולרי גורם תלויה Ba / F3. שורת תאים זה גדל בנוכחות interleukin-3 (IL-3) ונסיגה של תוצאות גורם זה מוות של תאים בתוך 24 שעות. הביטוי של היתוך קולטן VEGFR-2 / EpoR מספק מנגנון חלופי לקדם הישרדות בפוטנציהlly תרבות תאי Ba / F3 transfected ביציבות בנוכחות ליגנד מסוגל חייב cross-linking החלק התאי של חלבון ההיתוך (כלומר, אחד שיכול קשר צולב באזור תאיים VEGFR-2). Assay יכול להתבצע בשתי דרכים: גישה כמותית למחצה שבו כמויות קטנות של ליגנד ותאי להתיר מכך מהיר ב -24 שעות, ועל גישת כמותית המעורבת סמנים פונדקאיים של מספר תאי קיימא. Assay הוא יחסית קל לבצע, הוא היענות נלהבת הליגנדים VEGFR-2 ידוע והוא יכול להכיל מעכבי תאיים של VEGFR-2 איתות כגון נוגדנים חד שבטיים לקולטן או ליגנדים, ומלכודות ליגנד מסיסים.

בחלק זה, אנו מציגים את התוצאות של ניסוי המדגימות את התכונות החיוניות של מבדק VEGFR-2-EpoR-Ba / F3 (ראה איור 1 עבור עקרונות של assay). מחקרים שפורסמו אחרים מדגימים יישומים רחבים של assay עבור הליגנדים VEGFR-2 חלופיים, מולקולות VEGF מוטציה ונוגדנים חד-שבטיים מעכב...

Watch this Scientific Journal Video about A Simple Bioassay for the Evaluation of Vascular Endothelial Growth Factors at JoVE.com

A Simple Bioassay for the Evaluation of Vascular Endothelial Growth Factors

אנו מתארים המבדק פשוט מבוססי תאים לזיהוי, כימות לפקח על פעילות בני משפחת פקטור הגדילה של אנדותל כלי הדם של הליגנדים. את assay משתמש קולטנים chimeric לידי ביטוי קו תא גורם תלוי לתת הערכה וכמותיות או הכמות של קולטן מחייב cross-linking ידי ליגנד.

מבדק פשוט עבור הערכת גורמי הגדילה של אנדותל כלי דם

The analysis of receptor tyrosine kinases and their interacting ligands involved in vascular biology is often challenging due to the constitutive ...

The overall goal of this simple, cell-based bioassay is to detect, quantify, and monitor the activity of members of the vascular endothelial growth factor family of ligins. This method can answer key questions in vascular biology, virology, cancer, and opthamology, where VEG-FR family ligins radiate key processes in these diseases. The main advantage of this assay is it allows evaluation of VEG-FM family ligins in terms of their capacity to bind and cross link their different receptors without requiring specialized epithelial cells.Culture the IL3 secreting cell line WEHI-3D by pipetting five times ten to the sixth cells in the log face of growth into four to ten T175 flasks containing 50 millimeters of fresh culture medium. Incubate for seven days or until the cells have passed their log phase of growth by about 24 to 48 hours. Decant the fluid and cells from the flasks.And spin at 1, 000 Gs for 15 minutes to remove cells and cellular debris. Then remove the top 90%of supernaytent and filter it through a 0.22 micron filter unit. Aliquot the conditioned medium into one milliliter aliquots for assay preparation.50 milliliter aliquots for making culture medium to passage a factor dependent cell lines and 200 milliliter volumes for long term storage at 20 degree Celsius. Store the smaller volumes at 20 Celsius. Culture control BAF3 cells in culture media containing 10%WEHI-3D conditioned medium.and VegFR2-EPoR-BAF3 cells in the same media plus one milligram per milliliter G418. Passage cells at one to 15 dilutions from cells growing in log phase. Harvest control BAF3 or VegFR2VPoR-BAF3 cells for mid log phase cultures.By gently pipetting to remove the cells from the bottom of the flask centrifuge at 750 Gs for five minutes to recover cell pellet. Re-suspend the pellet in 10 milliliters of mouse tonicity phosphate buffered saline and centrifuge again at 750 Gs for five minutes. Repeat the wash two further times to remove medium containing IL3.Wash the cells once using media without DEHI-3D conditioned medium. It is important to wash away culture medium containing IL3 to ensure that no additional growth factors remain, which might generate a false positive result or high background activity. After centrifuging and discarding the supernayten re-suspend cells in the same IL3 free medium at a concentration of 7.4 times 10 to the fourth cells per milliliter.Finally mix equal volumes of trypan blue in PBS with a cell population and load into a hemacytometer. Count at least 100 cells. Cells that take up the dye are considered dead or dying.It is critical that cells used for the assay have high viability to ensure they are able to respond their assay conditions. Use a well calibrated P20 automated pipet and autoclaved tips to add 1, 000 cells in 13.5 microliters of IL deficient medium to the wells of a 72 well plate. Take care to mix the cell suspension during aliquoting to ensure cell settling by gravity does not bias cell concentration.Use a well calibrated P2 pipet to add 1.5 microliters of IL3 free media in triplicate to the control wells. Intrictery to mix. In the same manner add the 10%WEHI-3D conditioned medium and the 100 nanograms per milliliter VegFA no IL3 control to the desired wells.Finally add 1.5 microliters of the test samples in triplicate. Fill any unused wells of the microwell plate with sterile water, PBS or medium. Place water soaked tissue paper in a gas permeable container to create a humidified chamber that allows gas exchange.Incubate the assay plates in the chambers in a humidified atmosphere of 10%carbon dioxide for 16 hours. After 16 hours of incubation analyze the plates using a standard inverted phase microscope at 40 to 100x magnification. At this time it is possible to discriminate between positive and negative samples.Wells without support of growth factors or with medium alone will have reduced numbers of round cells as well as dead or dying cells and cellular debris. Whereas cells incubated with medium containing IL3 or ligin for VegFR2 are large and translucent and there is no or minimal evidence of granularity in the cell cytoplasm or cell debris in the culture. Add 10, 000 washed cells in 135 microliters of IL3 deficient medium to the wells of a standard 96 well plate.Use a calibrated P20 pipet to add 15 microliters of the test samples and controls to the wells. Incubate the mixture of cells growth factors and/or inhibitor agents as before for 48 hours. At the completion of the incubation period evaluate the number of viable cells in the wells using the methods outlined in the written portion of the protocol.Here are represented results of an assay in which the VEGF-R2 EPoR BAF3 bioassay is used to quantify the activity of the three recumbent human ligins with specificity for VEGF-R2. VEGF-A165, VEGF-C, and VEGF-D. Activity was quantified in the presence of bevacizumab, an inhibitory monoclonal antibody to VEGF-A165 or in the presence of trastuzumab, a non neutralizing antibody.Data have been normalized versus the response to VEGF-A165 alone. As expected bevacizumab blocked the effect of VEGF-A165 in the assay but had no effect on the activity of VEGF-C and VEGF-D. Cells exposed to IL3 were highly viable.Whereas those exposed to no additional growth factor show poor viability. When attempting this procedure it's important to bare in mind that they're a range of controlling agents in conditioned media that need to be generated prior to the assay. This technique paved the way for resurgence in vascular biology, virology, cancer and opthomology to explore the role of VEG-FM in ligins.After watching this video you should have a good understanding how to prepare the bioassay cells, to run the bioassay and to conduct the quantitative or semiquantitative analyses of VEG-FM ligin activity.

Research

JoVE Journal

Biology

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

שיטה פשוטה הדמיה ארבידופסיס מותיר שימוש Perfluorodecalin כנושאת הדמיה Infiltrative

The problem of acquiring high-resolution images deep into biological samples is widely acknowledged1. In air-filled tissue such as the spongy mesophyll of ...

A Simple Protocol for Extracting Hemocytes from Wild Caterpillars

פרוטוקול פשוט לחילוץ Hemocytes מזחלי Wild

Insect hemocytes (equivalent to mammalian white blood cells) play an important role in several physiological processes throughout an insect's life cycle ...

Simple and Efficient Technique for the Preparation of Testicular Cell Suspensions

טכניקה פשוטה ויעילה להכנת השעיות תא אשכים

Mammalian testes are very complex organs that contain over 30 different cell types, including somatic testicular cells and different stages of germline ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

בידוד של תאי Murine Valve האנדותל

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

בידוד והתרבות ראשית של לתאי אנדותל עכבר אב העורקים

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

בידוד של תאי שריר חלק Murine כלילית דם

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

בידוד סינון של חומצות גרעין: שיטת הפקת DNA פשוטה ומהירה

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

Molecular Analysis of Endothelial-mesenchymal Transition Induced by Transforming Growth Factor-&#946; Signaling

אנליזה מולקולרית של אנדותל-mesenchymal מעבר המושרה על ידי הפיכת גורם גידול-β איתות

Phenotypic plasticity of endothelial cells underlies cardiovascular system development, cardiovascular diseases, and various conditions associated with ...

Using En Face Immunofluorescence Staining to Observe Vascular Endothelial Cells Directly

שימוש בפני הפנים הללו Immunofluorescence כתמים כדי להתבונן בתאי כלי דם אנדותל ישירות

Aberrant changes in endothelial phenotype and morphology are considered to be initial events in the pathogenesis of atherosclerosis. Direct observation of ...