Name: identification of critical conditions for immunostaining in the pea aphid embryos: increasing tissue permeability and decreasing background staining
Uploaded: 2016-02-02T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Critical Conditions for Immunostaining in the Pea Aphid Embryos: Increasing Tissue Permeability and Decreasing Background Staining at JoVE.c

We are grateful to Chau-Ti Ting (Fly Core in Taiwan) for providing the monoclonal 4D9 antibody, Technology Commons (TechComm) of the College of Life Science NTU for confocal microscopy, Hsiao-Ling Lu for proofreading the manuscript, and Chen-yo Chung for helping filming. CC particularly thanks Charles E. Cook for providing strategic suggestions and for critical editing of the manuscript. This work was supported by the Ministry of Science and Technology (101-2313-B-002-059-MY3 and 104-2313-B-002-022-MY3 for GWL and CC), and the National Taiwan University (NTU-CESRP 101R4602D3 for CC; 103R4000 for GWL).

1. ثقافة المن جمعت سلالة مختبر عذري لود البازلاء المن A pisum أصلا في وسط تايوان، وقد تربى على النباتات المضيفة (وبيسوم حديقة البازلاء Pisum أو الفول الفول الفول) تحت الضوئية يوم طويل لأكثر من 300 أجيال: ملاحظة. (جيل واحد: ~ 10 يو?...

<ol>
	<li>Blackman, R. L., Minks, A. K., Harrewijn, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproduction,+cytogenetics+and+development.">Reproduction, cytogenetics and development.</a> Aphids: their biology, natural enemies. , 163-195 (1987).</li><li>Davis, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclical+parthenogenesis+and+viviparity+in+aphids+as+evolutionary+novelties.">Cyclical parthenogenesis and viviparity in aphids as evolutionary novelties.</a> J. Exp. Zool. 318, 448-459 (2012).</li><li>The International Aphid Genomics Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequence+of+the+pea+aphid+Acyrthosiphon+pisum.">Genome sequence of the pea aphid Acyrthosiphon pisum.</a> PLoS Biol. 8 (2), e1000313 (2010).</li><li>Abzhanov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+we+there+yet?+Tracking+the+development+of+new+model+systems.">Are we there yet? Tracking the development of new model systems.</a> Trends Genet. 24 (7), 353-360 (2008).</li><li>Chang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apvasa+marks+germ-cell+migration+in+the+parthenogenetic+pea+aphid+Acyrthosiphon+pisum+(Hemiptera:+Aphidoidea)).">Apvasa marks germ-cell migration in the parthenogenetic pea aphid Acyrthosiphon pisum (Hemiptera: Aphidoidea)).</a> Dev. Genes Evol. 217 (4), 275-287 (2007).</li><li>Chang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+identification+of+gene+transcripts+in+aphids:+Protocols+and+evaluation+of+probe+accessibility.">Whole-mount identification of gene transcripts in aphids: Protocols and evaluation of probe accessibility.</a> Arch. Insect Biochem. 68 (4), 186-196 (2008).</li><li>Chung, C. Y., Cook, C. E., Lin, G. W., Huang, T. Y., Chang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliable+protocols+for+whole-mount+fluorescent+in+situ+hybridization+(FISH)+in+the+pea+aphid+Acyrthosiphon+pisum:+a+comprehensive+survey+and+analysis.">Reliable protocols for whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) in the pea aphid Acyrthosiphon pisum: a comprehensive survey and analysis.</a> Insect Sci. 21 (3), 265-277 (2014).</li><li>Mutti, N. S., Park, Y., Reese, J. C., Reeck, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi+knockdown+of+a+salivary+transcript+leading+to+lethality+in+the+pea+aphid,+Acyrthosiphon+pisum.">RNAi knockdown of a salivary transcript leading to lethality in the pea aphid, Acyrthosiphon pisum.</a> J. Insect Sci. 6, 38 (2006).</li><li>Jaubert-Possamai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+knockdown+by+RNAi+in+the+pea+aphid+Acyrthosiphon+pisum.">Gene knockdown by RNAi in the pea aphid Acyrthosiphon pisum.</a> BMC Biotechnol. 7, 63 (2007).</li><li>Sapountzis, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insight+into+the+RNA+interference+response+against+cathepsin-L+gene+in+the+pea+aphid,+Acyrthosiphon+pisum:+Molting+or+gut+phenotypes+specifically+induced+by+injection+or+feeding+treatments.">New insight into the RNA interference response against cathepsin-L gene in the pea aphid, Acyrthosiphon pisum: Molting or gut phenotypes specifically induced by injection or feeding treatments.</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 51, 20-32 (2014).</li><li>Braendle, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+origin+and+evolution+of+bacteriocytes+in+the+aphid-Buchnera+symbiosis.">Developmental origin and evolution of bacteriocytes in the aphid-Buchnera symbiosis.</a> PLoS Biol. 1 (1), e21 (2003).</li><li>Miura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+parthenogenetic+and+sexual+embryogenesis+of+the+pea+aphid+Acyrthosiphon+pisum+(Hemiptera:+Aphidoidea).">A comparison of parthenogenetic and sexual embryogenesis of the pea aphid Acyrthosiphon pisum (Hemiptera: Aphidoidea).</a> J. Exp. Zool. 295 (1), 59-81 (2003).</li><li>Chang, C., Lee, W. C., Cook, C. E., Lin, G. W., Chang, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germ-plasm+specification+and+germline+development+in+the+parthenogenetic+pea+aphid+Acyrthosiphon+pisum:+Vasa+and+Nanos+as+markers.">Germ-plasm specification and germline development in the parthenogenetic pea aphid Acyrthosiphon pisum: Vasa and Nanos as markers.</a> Int. J. Dev. Biol. 50 (4), 413-421 (2006).</li><li>Koshy, A. A., Cabral, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-D+imaging+and+analysis+of+neurons+infected+in+vivo+with+Toxoplasma+gondii.">3-D imaging and analysis of neurons infected in vivo with Toxoplasma gondii.</a> J. Vis. Exp. (94), e52237 (2014).</li><li>Brisson, J. A., Stern, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pea+aphid,+Acyrthosiphon+pisum:+an+emerging+genomic+model+system+for+ecological,+developmental+and+evolutionary+studies.">The pea aphid, Acyrthosiphon pisum: an emerging genomic model system for ecological, developmental and evolutionary studies.</a> Bioessays. 28 (7), 747-755 (2006).</li><li>Tautz, D., Pfeifle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-radioactive+in+situ+hybridization+method+for+the+localization+of+specific+RNAs+in+Drosophila+embryos+reveals+translational+control+of+the+segmentation+gene+hunchback.">A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback.</a> Chromosoma. 98 (2), 81-85 (1989).</li><li>Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-situ+hybridization:+an+improved+whole-mount+method+for+Xenopus+embryos.">In-situ hybridization: an improved whole-mount method for Xenopus embryos.</a> Method. Cell Biol. 36, 685-695 (1991).</li><li>Wolff, C., Sommer, R., Schroder, R., Glaser, G., Tautz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+and+divergent+expression+aspects+of+the+Drosophila+segmentation+gene+hunchback+in+the+short+germ+band+embryo+of+the+flour+beetle+Tribolium.">Conserved and divergent expression aspects of the Drosophila segmentation gene hunchback in the short germ band embryo of the flour beetle Tribolium.</a> Development. 121 (12), 4227-4236 (1995).</li><li>Jowett, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+in+situ+hybridization+techniques+in+zebrafish.">Double in situ hybridization techniques in zebrafish.</a> Methods. 23 (4), 345-358 (2001).</li><li>Lin, G. W., Cook, C. E., Miura, T., Chang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posterior+localization+of+ApVas1+positions+the+preformed+germ+plasm+in+the+sexual+oviparous+pea+aphid+Acyrthosiphon+pisum.">Posterior localization of ApVas1 positions the preformed germ plasm in the sexual oviparous pea aphid Acyrthosiphon pisum.</a> Evodevo. 5, 18 (2014).</li><li>Straus, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+peroxidase+by+methanol+and+by+methanol-nitroferricyanide+for+use+in+immunoperoxidase+procedures.">Inhibition of peroxidase by methanol and by methanol-nitroferricyanide for use in immunoperoxidase procedures.</a> J. Histochem. Cytochem. 19 (11), 682-688 (1971).</li></ol>

حددنا الظروف المثلى حاسمة لنجاح المناعية في البازلاء المن A. pisum، وهو الناشئة كائن نموذج للدراسات الجينية والتنموية 3،15. الظروف الأمثل لزيادة نفاذية الأنسجة وتقليل تلوين الخلفية عززت كثافة ونوعية الإشارات. وهي تختلف عن البروتوكولات القياسية لالمناعي...

المن والحشرات hemipteran مع (1-10 ملم) هيئات صغيرة ناعمة. تتغذى على النباتات التي تمتص عصارة اللحاء مع فمها خارقة. بالإضافة إلى ذلك، فهي تعتمد على البكتيريا endosymbiotic تلزم، Buchnera aphidicola، لتجميع الأحماض الأمينية الأساسية التي تعاني من نقص في الغذاء عصارة اللحاء. المن لها تاريخ حياة معقد يتضمن الاستنساخ لود عذري خلال فصلي الربيع والصيف الضوئية يوم طويل والاستنساخ بياض الجنسي سببها الضوئية قصيرة اليوم تم خلاله وضع عدد محدود من البيات الشتوي البيض 1،2. في ربيع هذه يفقس البيض لإنتاج الجيل الأول من كل الإناث المن (fundatrices)، وبعد عدة جولات من الاستنساخ عذري حتى الخريف. والتوالد العذري الدوري في المن، حيث مراحل اللاجنسي والجنسي البديل في دورة الحياة السنوية، وقد تم اعتباره 1،2 الجدة التطوري. في المن لود عذري، مرحلة التطور الجنيني يحدث داخل غرف البيض من الأنابيب المبيض (ovarioles). على النقيض من ذلك، الأجنة بيوض الجنسية تتطور في البيض المخصب. وبصرف النظر عن ليونة الإنجابية، ويمكن المن عرض transgenerational polyphenism الجناح: استجابة لإشارات الاكتظاظ والتهديدات المفترس، يمكن للإناث اللاجنسي unwinged إنتاج viviparously ذرية المجنح للهجرة لمسافات طويلة. نشر تسلسل الجينوم من المن البازلاء Acyrthosiphon pisum -THE أول تسلسل الجينوم لالقاعدية الحشرات يسمح hemimetabolous مواصلة استكشاف اللدونة الإنجابية، polyphenism الجناح، وغيرها من الميزات بما في ذلك التفاعلات الحشرات والنبات، vectoring الفيروسي والتعايش في المن على الجزيئي أساس 3. بالإضافة إلى تسلسل الجينوم، الأدوات المطلوبة لتحديد خصائص التعبير الجيني وظيفة لتعزيز المن البازلاء كنموذج كائن ناضج 4. وصفناها بروتوكولات قوية من كامل جبل <em&gt; التهجين الموضعي للكشف عن التعبير مرنا في الأجنة أولا بأول 5-7 في. وقد استخدم تدخل الحمض النووي الريبي (رني) عن طريق الحقن المزدوج تقطعت بهم السبل RNA والتغذية لإسكات الجينات في حوريات المن والكبار، ولكن لم يتم الابلاغ عن ظروف مستقرة لجين ضربة قاضية في الأجنة 10/08. المناعية، وهو النهج القائم على الأجسام المضادة التي يمكن الكشف عن البروتين التعبير في عينات قبل وبعد رني ضربة قاضية، وقد أجريت على الأجنة البازلاء أولا بأول 11-13. ومع ذلك، زيادة نفاذية الأنسجة والقضاء على تلوين الخلفية غير مرضية حتى الآن باستخدام البروتوكولات القياسية لالمناعية في الأجنة لود اللاجنسي من المن البازلاء. على سبيل المثال، وجدنا أن انخفض اختراق الأجسام المضادة إلى الأنسجة في الأجنة gastrulating (مراحل 10/08) وأن الأجنة مع براعم الأطراف يمكن تحديدها شكليا (مراحل 13-14) كانت بالكاد يسهل اختراقها للأجسام المضادة. وبالإضافة إلى ذلك، تم تصور تلوين الخلفية في viviparo اللاجنسيلنا البازلاء الأجنة أولا بأول الملون باستخدام الأجسام المضادة ضد علامة سلالة الجرثومية فاسا وكذلك ضد البروتين Engrailed / Invected أعرب في قطاعات الجنينية 12،13. في الواقع كان لا يزال تلوين الخلفية واضحة للعيان في الأجنة ملطخة الأجسام المضادة الثانوية وحدها. من أجل زيادة نفاذية دون الإضرار سلامة الأنسجة أولا بأول، ونحن معاير بعناية وتركيز بروتين K وتحديد الظروف المثلى لعملية الهضم الأنسجة على الأجنة أولا بأول. من أجل تجنب تلطيخ غير محددة في المن البازلاء، ونحن بحثت عن المركبات التي يمكن أن تمنع بالفعل الأجنة والنشاط البيروكسيداز الذاتية (POD)، وهو إنزيم يعمل على تضخيم الإشارات خلال المناعية قمع. A كاشف الحجب التي يقدمها Digoxigenin (DIG) المستندة إلى مجموعة العازلة، بدلا من مصل الماعز العادي يستخدم تقليديا (خ ع) / الأبقار مصل الزلال (BSA)، انخفاضا كبيرا تلوين الخلفية. وعلاوة على ذلك، تم العثور على الميثانول ليتنهىبت النشاط POD الذاتية أكثر فعالية من بيروكسيد الهيدروجين (H 2 O 2). وسيتم وصف تفاصيل بشأن هذه الشروط أولا بأول محددة لالمناعية على الأجنة في الأقسام التالية.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>30% hydrogen perxidase (H&#8322;O&#8322;)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>18304</td>
			<td>For bleaching endogenous peroxidase of embryos.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8217;6-diamidino-2-phenyl-indole dihydrochloride (DAPI)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td>For labeling the double-strand DNA. TOXIC. Wear gloves, dispense into small aliquots and feeze to minimize exposure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4D9 anti-engrailed/invected mouse monoclonal antibody</td>
			<td>Developmental studies hybridoma bank</td>
			<td>AB_528224</td>
			<td>For labeling the developing segments of embryo.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ApVas1 rabbit polyclonal antibody</td>
			<td>Our laboratory</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For labeling the aphid germline specific Vas1 protein in embryos. This antibody was made by our laboratory.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Austerlitz Insect pins</td>
			<td>ENTOMORAVIA</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For seperating each egg chambers from an ovariole. Size 000, BLACK ENAMELLED.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td>For blocking the non-specific binding of antibodies.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera connted to compound microscope</td>
			<td>Canon</td>
			<td>EOS 5D</td>
			<td>For photographing of aphid embryos.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colorimetric 8 cell tray</td>
			<td>Kartell Labware</td>
			<td>357</td>
			<td>For developing the staining signal of aphid embryos. Diameter 95 x 57 mm, cell depth 2 mm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compound microscope with DIC optics</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>DMR</td>
			<td>For photographing of aphid embryo mounted on the slides.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIG Wash and Block Buffer Set</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Roche)</td>
			<td>1.1586E+10</td>
			<td>For blocking the non-specific binding of antibodies. We diluted the 10X Blocking solution into 1X as blocking reagent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Ideal-tek</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For dissection of ovaries from aphids. Manufacturer part No 5: 5 SA.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass dropper</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For transfering ovaries of aphids from the splot plate to tubes. 150 mm of total length and 5 3/4&#34; of tip length.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td>For clearing of aphid embryos and mounting.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For blocking the enzyme activity of proteinase K (PK).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG conjugated Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11017</td>
			<td>For detection of primary antibody from mouse.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG conjugated Alexa Fluor 633</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21072</td>
			<td>For detection of primary antibody from rabbit.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intelli mixer</td>
			<td>ELMI laboratory equipment</td>
			<td>RM-2M</td>
			<td>For improving the thorughly reaction of reagents with ovaries.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser-scanning confocal microscopy</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>SP5</td>
			<td>For photographing of aphid embryo mounted on the slides with florecent tag.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methanol&#160;</td>
			<td>Burdick and Jackson</td>
			<td>AH2304</td>
			<td>For bleaching endogenous peroxidase of embryos.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides&#160;</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>10143560</td>
			<td>For mounting of embryos. SUPERFROST ground edges, ca./env. 76 x 26 mm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover glasses</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>0101030</td>
			<td>For mounting embryos on the slides. Size 18 x 18 mm. Thickness No. 1 (0.13 to 0.16 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover glasses</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>0101050</td>
			<td>For mounting embryos on the slides. Size 22 x 22 mm. Thickness No. 1 (0.13 to 0.16 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse monoclonal anti-alphaTubulin antibody (DM1A)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-32293</td>
			<td>For labeling the distrbution of alpha-tubulin of cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail polish</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For sealing the coverslips on the slides.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum (NGS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9023</td>
			<td>For blocking the non-specific binding of antibodies.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>MK262159</td>
			<td>For fixation of aphid ovaries.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin-TRITC</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1951</td>
			<td>For labeling the distrbution of F-actin on embryos.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>As isotonic solution for aphid ovaries.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic dropper</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For transfering ovaries of aphids from tube to cell tray. Size 3 ml.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Merck</td>
			<td>124678</td>
			<td>For creating pores (punching) on the cell membrane and facilitating the access of antibodies.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex spot plate</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For dissection and color reactions of aphid ovaries under microscopy. Each cavity with diameter 22 mm and&#160; depth 7 mm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SIGMAFAST 3,3&#8217;-diaminobenzidine (DAB) tablets&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4168</td>
			<td>For developing of substrated signals. Also called DAB peroxidase substrate tablet set.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>EZ4</td>
			<td>For dissection and observation of aphid ovaries.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X 100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td>For creating pores (punching) on the cell membrane.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD Elite ABC Kit (Rabbit IgG)</td>
			<td>Vector laboratories</td>
			<td>PK-6101</td>
			<td>For enhancement of the signal. Including of biotinylated goat anti-rabbit IgG secondary antibody, A and B reagents.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD mounting medium</td>
			<td>Vector laboratories</td>
			<td>H1000</td>
			<td>For clearing of aphid embryos and mounting.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of critical conditions for immunostaining in the pea aphid embryos: increasing tissue permeability and decreasing background staining

وAcyrthosiphon pisum البازلاء أولا بأول، مع تسلسل الجينوم واللدونة المظهرية وفيرة، وأصبحت نموذجا الناشئة للدراسات الجينية والتنموية. مثل المن أخرى، A. pisum نشر بسرعة عن طريق الاستنساخ لود عذري، حيث تطور الأجنة داخل غرف البيض بطريقة خط التجميع في ovariole. سابقا أنشأنا منصة قوية من جبل لالجامع في الموقع التهجين السماح الكشف عن التعبير مرنا في الأجنة أولا بأول. لتحليل التعبير من البروتين، على الرغم من إنشاء بروتوكولات لالمناعية للovarioles من المن لود اللاجنسي لم تسفر عن نتائج مرضية. نحن هنا تقرير الظروف الأمثل لزيادة نفاذية الأنسجة وتقليل تلوين الخلفية، سواء التي كانت مشاكل عند تطبيق النهج المعمول بها. وتشمل التحسينات: (1) حضانة بروتين K (1 ميكروغرام / مل، 10 دقيقة)، الذي عثر عليه و الأساسيةأو اختراق الأجسام المضادة في الأجنة المتوسطة والمرحلة المتأخرة أولا بأول. (2) استبدال العادي مصل الماعز / البقري ألبومين المصل مع كاشف الحجب توفيره من قبل Digoxigenin (DIG) المستندة العازلة مجموعة و(3) تطبيق الميثانول بدلا بيروكسيد الهيدروجين (H 2 O 2) لتبيض البيروكسيداز الذاتية. مما ادى الى تراجع كبير في تلوين الخلفية في الأنسجة أولا بأول. وهذه الظروف الحرجة الأمثل لالمناعية السماح الكشف الفعال للمنتجات الجينات في الأجنة من A. pisum والمن أخرى.

في هذه الدراسة، أجرينا كله جبل المناعية على الأجنة من المن البازلاء اللاجنسي (الشكل 1A). هذه الإناث تنتج ذرية parthenogenetically وviviparously. هذه الأجنة الإناث تتطور داخل غرف البيض من الأنابيب المبيض (ovarioles) (1B الشكل والشكل 2A). قبل المجه?...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Critical Conditions for Immunostaining in the Pea Aphid Embryos: Increasing Tissue Permeability and Decreasing Background Staining at JoVE.c

Identification of Critical Conditions for Immunostaining in the Pea Aphid Embryos: Increasing Tissue Permeability and Decreasing Background Staining

تحديد الظروف الحرجة لالمناعية في البازلاء المن الأجنة: زيادة نفاذية الأنسجة وتقليل خلفية تلطيخ

A protocol of whole-mount immunostaining on aphid embryos is presented, in which critical conditions for decreasing background staining and increasing tissue permeability are addressed. These conditions are specifically developed for effective detection of protein expression in the embryonic tissues of aphids.

The pea aphid Acyrthosiphon pisum, with a sequenced genome and abundant phenotypic plasticity, has become an emerging model for genomic and developmental ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral T Cells Using Sendai Virus in Feeder-free Conditions

جيل من المستحثة متعددة القدرات الخلايا الجذعية من الإنسان الطرفية T الخلايا باستخدام سينداي الفيروسات في ظروف خالية من الطاعم

Recently, iPSCs have attracted attention as a new source of cells for regenerative therapies. Although the initial method for generating iPSCs relied on ...

Loss- and Gain-of-function Approach to Investigate Early Cell Fate Determinants in Preimplantation Mouse Embryos

Loss- ونهج كسب من وظيفة إلى التحقيق في خلية المبكر مصير محددات في سابق للانغراس أجنة الفئران

 Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene ...

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

متعددة الهدف اللونية الجامع جبل<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين لمقارنة الجينات مجالات التعبير في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الأجنة

To analyze gene regulatory networks active during embryonic development and organogenesis it is essential to precisely define how the different genes are ...

Small-scale Propagation of Human iPSCs in Serum-free Conditions for Routine Immunocytochemical Characterization

نشر على نطاق صغير iPSCs الإنسان في الظروف المصل خالية لتوصيف Immunocytochemical الروتينية

There is great interest in utilizing human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) for disease modeling and cell therapeutics due to their patient ...

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

في فيفو التصوير التعبير المعدلة وراثيا الجينات في الفرد الشبكية الأسلاف في الجنين اسماك الزرد همي لدراسة الخلية التأثيرات Nonautonomous

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

بروتوكولات لتصور الستيرويدي المنشأ أجهزة وهيئات التفاعلية مع المناعية في ذبابة الفاكهة<em&gt; ذبابة الفاكهة</em

In multicellular organisms, a small group of cells is endowed with a specialized function in their biogenic activity, inducing a systemic response ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

تصوير لايف من ماوس الثانوي باليت فيوجن

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

تشريح وتلطيخ إيممونوفلوريسسينت للفطر الجسم وعلم الخلايا العصبية في أدمغة البالغين melanogaster المورفولوجية

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

التصور للنشاط الكهربائي الخلوية في الزرد الأجنة في وقت مبكر، والأورام

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

تصور بالعقدة ولوحة نوتوتشوردال في جاسترولاتينج الأجنة الماوس باستخدام الميكروسكوب الإلكتروني المسح وكله جبل الفلورة

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...