Name: identification of critical conditions for immunostaining in the pea aphid embryos: increasing tissue permeability and decreasing background staining
Uploaded: 2016-02-02T15:00:00
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We are grateful to Chau-Ti Ting (Fly Core in Taiwan) for providing the monoclonal 4D9 antibody, Technology Commons (TechComm) of the College of Life Science NTU for confocal microscopy, Hsiao-Ling Lu for proofreading the manuscript, and Chen-yo Chung for helping filming. CC particularly thanks Charles E. Cook for providing strategic suggestions and for critical editing of the manuscript. This work was supported by the Ministry of Science and Technology (101-2313-B-002-059-MY3 and 104-2313-B-002-022-MY3 for GWL and CC), and the National Taiwan University (NTU-CESRP 101R4602D3 for CC; 103R4000 for GWL).

1. Cultura de pulgões NOTA:. A cepa laboratorial da parthenogenetic viviparous ervilha pulgão A pisum foram originalmente coletadas no centro de Taiwan e tem sido criados em plantas hospedeiras (a sativum jardim ervilha Pisum ou fava Vicia faba) sob longo dia fotoperíodo para mais de 300 gerações (uma geração: ~ 10 dias). <ol><li> Germinação de sementes <ol><li> Mergulhe as sementes de plantas hospedeiras em água corrente por 3-5 dias em temperatura ambien...

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	<li>Blackman, R. L., Minks, A. K., Harrewijn, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproduction,+cytogenetics+and+development.">Reproduction, cytogenetics and development.</a> Aphids: their biology, natural enemies. , 163-195 (1987).</li><li>Davis, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclical+parthenogenesis+and+viviparity+in+aphids+as+evolutionary+novelties.">Cyclical parthenogenesis and viviparity in aphids as evolutionary novelties.</a> J. Exp. 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W., Chang, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germ-plasm+specification+and+germline+development+in+the+parthenogenetic+pea+aphid+Acyrthosiphon+pisum:+Vasa+and+Nanos+as+markers.">Germ-plasm specification and germline development in the parthenogenetic pea aphid Acyrthosiphon pisum: Vasa and Nanos as markers.</a> Int. J. Dev. Biol. 50 (4), 413-421 (2006).</li><li>Koshy, A. A., Cabral, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-D+imaging+and+analysis+of+neurons+infected+in+vivo+with+Toxoplasma+gondii.">3-D imaging and analysis of neurons infected in vivo with Toxoplasma gondii.</a> J. Vis. Exp. (94), e52237 (2014).</li><li>Brisson, J. A., Stern, D. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-situ+hybridization:+an+improved+whole-mount+method+for+Xenopus+embryos.">In-situ hybridization: an improved whole-mount method for Xenopus embryos.</a> Method. 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Identificamos condições óptimas críticas para immunostaining sucesso no pulgão da ervilha A. Pisum, um organismo modelo emergente para estudos genômicos e de desenvolvimento 3,15. Condições otimizadas para aumentar a permeabilidade dos tecidos e reduzindo a coloração de fundo aumentou a intensidade e especificidade dos sinais. Eles diferem de protocolos padrão para a imunocoloração, em outros modelos animais nos passos para a criação de poros em membranas celulares e anticorpo...

Pulgões são insetos hemípteros com pequenos (1-10 mm) corpos macios. Eles se alimentam de plantas sugando a seiva floema com mouthparts piercing. Além disso, eles contam com uma bactéria endosymbiotic obrigatório, Buchnera aphidicola, para sintetizar aminoácidos essenciais que são deficientes na dieta seiva floema. Pulgões tem uma história de vida complexo que inclui reprodução vivípara parthenogenetic durante a primavera eo verão fotoperíodo longo dia e reprodução ovípara sexual desencadeada por fotoperíodos de curto-dia durante o qual eles estabelecem um número limitado de ovos overwintering 1,2. Na Primavera esses ovos eclodem para produzir a primeira geração de todo-fêmea pulgões (fundatrices), na sequência de muitas rodadas de reprodução parthenogenetic até o outono. A partenogênese cíclico em pulgões, onde fases sexuada e assexuada, alternam no ciclo de vida anual, tem sido considerada como um 1,2 novidade evolucionária. Nos pulgões vivíparos partenogenéticas, Embriogênese ocorre dentro de câmaras de ovos dos túbulos ovarianos (ovaríolos). Em contrapartida, os embriões ovíparos sexuais desenvolver nos ovos fertilizados. Além de plasticidade reprodutiva, os pulgões podem exibir transgeracional polifenismo asa: em resposta a sinais de superlotação e ameaças de predadores, as fêmeas assexuadas unwinged pode vivíparos produzir descendentes voado para a migração de longa distância. Publicação da sequência do genoma do pulgão da ervilha pisum Acyrthosiphon -a primeira sequência de genoma para uma basal inseto-hemimetabolous permite uma maior exploração da plasticidade reprodutiva, asa polifenismo, e outros recursos, incluindo interações inseto-planta, vetorização viral e simbiose em pulgões em um molecular 3 base. Além do genoma sequenciado, ferramentas para caracterizar expressão e função do gene são necessários para promover o afídeo da ervilha como um organismo modelo 4 madura. Nós descrevemos protocolos robustos de todo-mount <em&gt; hibridação in situ para detectar a expressão de ARNm em embriões de afídeos 5-7. Interferência de RNA (RNAi), através de injecção de ARN de cadeia dupla e de alimentação foi usado para silenciamento de genes em ninfas de afídeos e adultos, mas condições estáveis ​​para o gene knockdown nos embriões não foram ainda relatados 8-10. A imunocoloração, uma abordagem baseada em anticorpo que se pode detectar a expressão de proteínas em amostras antes e depois de ARNi knockdown, foi realizada em embriões de ervilha 11-13 afídeos. No entanto, o aumento da permeabilidade do tecido e a eliminação de coloração de fundo é ainda insatisfatória utilizando protocolos convencionais para a imunocoloração nas embriões vivíparos assexuadas de ervilha pulgão. Por exemplo, verificou-se que a penetração do anticorpo aos tecidos diminuiu em embriões gastrulating (fases 8-10) e que os embriões com brotos dos membros morfologicamente identificáveis ​​(etapas 13-14) eram pouco permeável ao anticorpo. Além disso, a coloração de fundo foi visualizado no viviparo assexuadaUS embriões de afídeos de ervilha coradas utilizando o anticorpo contra o marcador da linha germinativa dos vasos, bem como contra a proteína que Engrailed / Invected expressa nos segmentos embrionárias 12,13. Na verdade, a coloração de fundo foi ainda claramente visível em embriões corados com o anticorpo secundário sozinho. A fim de aumentar a permeabilidade, sem danificar a integridade dos tecidos de afídeos, cuidadosamente titulada a concentração de proteinase K e determinaram as condições óptimas para a digestão de tecidos de embriões de afídeos. A fim de evitar coloração não específica na ervilha pulgão, temos procurado por compostos que poderia bloquear eficazmente os embriões e suprimir a actividade endógena de peroxidase (POD), uma enzima utilizada para amplificar os sinais durante a imunocoloração. Um reagente de bloqueio proporcionada por uma digoxigenina (DIG) -based conjunto tampão, em vez do soro de cabra normal utilizado tradicionalmente (NGS) / albumina do soro bovino (BSA), reduziu significativamente a coloração de fundo. Além disso, o metanol foi encontrado para inhimordeu a actividade POD endógena mais eficaz do que o peróxido de hidrogénio (H 2 O 2). Os detalhes a respeito dessas condições específicas de afídeos para immunostaining sobre os embriões serão descritos nas seções a seguir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>30% hydrogen perxidase (H&#8322;O&#8322;)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>18304</td>
			<td>For bleaching endogenous peroxidase of embryos.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8217;6-diamidino-2-phenyl-indole dihydrochloride (DAPI)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td>For labeling the double-strand DNA. TOXIC. Wear gloves, dispense into small aliquots and feeze to minimize exposure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4D9 anti-engrailed/invected mouse monoclonal antibody</td>
			<td>Developmental studies hybridoma bank</td>
			<td>AB_528224</td>
			<td>For labeling the developing segments of embryo.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ApVas1 rabbit polyclonal antibody</td>
			<td>Our laboratory</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For labeling the aphid germline specific Vas1 protein in embryos. This antibody was made by our laboratory.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Austerlitz Insect pins</td>
			<td>ENTOMORAVIA</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For seperating each egg chambers from an ovariole. Size 000, BLACK ENAMELLED.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td>For blocking the non-specific binding of antibodies.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera connted to compound microscope</td>
			<td>Canon</td>
			<td>EOS 5D</td>
			<td>For photographing of aphid embryos.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colorimetric 8 cell tray</td>
			<td>Kartell Labware</td>
			<td>357</td>
			<td>For developing the staining signal of aphid embryos. Diameter 95 x 57 mm, cell depth 2 mm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compound microscope with DIC optics</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>DMR</td>
			<td>For photographing of aphid embryo mounted on the slides.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIG Wash and Block Buffer Set</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Roche)</td>
			<td>1.1586E+10</td>
			<td>For blocking the non-specific binding of antibodies. We diluted the 10X Blocking solution into 1X as blocking reagent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Ideal-tek</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For dissection of ovaries from aphids. Manufacturer part No 5: 5 SA.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass dropper</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For transfering ovaries of aphids from the splot plate to tubes. 150 mm of total length and 5 3/4&#34; of tip length.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td>For clearing of aphid embryos and mounting.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For blocking the enzyme activity of proteinase K (PK).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG conjugated Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11017</td>
			<td>For detection of primary antibody from mouse.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG conjugated Alexa Fluor 633</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21072</td>
			<td>For detection of primary antibody from rabbit.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intelli mixer</td>
			<td>ELMI laboratory equipment</td>
			<td>RM-2M</td>
			<td>For improving the thorughly reaction of reagents with ovaries.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser-scanning confocal microscopy</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>SP5</td>
			<td>For photographing of aphid embryo mounted on the slides with florecent tag.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methanol&#160;</td>
			<td>Burdick and Jackson</td>
			<td>AH2304</td>
			<td>For bleaching endogenous peroxidase of embryos.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides&#160;</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>10143560</td>
			<td>For mounting of embryos. SUPERFROST ground edges, ca./env. 76 x 26 mm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover glasses</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>0101030</td>
			<td>For mounting embryos on the slides. Size 18 x 18 mm. Thickness No. 1 (0.13 to 0.16 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover glasses</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>0101050</td>
			<td>For mounting embryos on the slides. Size 22 x 22 mm. Thickness No. 1 (0.13 to 0.16 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse monoclonal anti-alphaTubulin antibody (DM1A)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-32293</td>
			<td>For labeling the distrbution of alpha-tubulin of cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail polish</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For sealing the coverslips on the slides.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum (NGS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9023</td>
			<td>For blocking the non-specific binding of antibodies.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>MK262159</td>
			<td>For fixation of aphid ovaries.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin-TRITC</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1951</td>
			<td>For labeling the distrbution of F-actin on embryos.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>As isotonic solution for aphid ovaries.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic dropper</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For transfering ovaries of aphids from tube to cell tray. Size 3 ml.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Merck</td>
			<td>124678</td>
			<td>For creating pores (punching) on the cell membrane and facilitating the access of antibodies.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex spot plate</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For dissection and color reactions of aphid ovaries under microscopy. Each cavity with diameter 22 mm and&#160; depth 7 mm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SIGMAFAST 3,3&#8217;-diaminobenzidine (DAB) tablets&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4168</td>
			<td>For developing of substrated signals. Also called DAB peroxidase substrate tablet set.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>EZ4</td>
			<td>For dissection and observation of aphid ovaries.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X 100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td>For creating pores (punching) on the cell membrane.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD Elite ABC Kit (Rabbit IgG)</td>
			<td>Vector laboratories</td>
			<td>PK-6101</td>
			<td>For enhancement of the signal. Including of biotinylated goat anti-rabbit IgG secondary antibody, A and B reagents.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD mounting medium</td>
			<td>Vector laboratories</td>
			<td>H1000</td>
			<td>For clearing of aphid embryos and mounting.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of critical conditions for immunostaining in the pea aphid embryos: increasing tissue permeability and decreasing background staining

O Acyrthosiphon pisum ervilha pulgão, com um genoma seqüenciado e abundante plasticidade fenotípica, tornou-se um modelo emergente para estudos genômicos e de desenvolvimento. Como outros pulgões, A. Pisum propagar rapidamente via reprodução vivípara parthenogenetic, onde os embriões se desenvolvem dentro de câmaras de ovo em uma forma de linha de montagem na ovaríolo. Anteriormente nós estabelecemos uma plataforma robusta de todo-mount hibridização in situ permitindo a detecção da expressão de mRNA nos embriões de afídeos. Para analisar a expressão de proteínas, no entanto, os protocolos estabelecidos para a imunocoloração os ovarioles de pulgões assexuadas vivíparos não produziu resultados satisfatórios. Aqui nós relatamos condições otimizadas para aumentar a permeabilidade dos tecidos e diminuição da coloração de fundo, sendo que ambos foram problemas ao aplicar abordagens estabelecidas. Optimizações incluem: (1) incubação de proteinase K (1 ug / ml, 10 min), o qual foi encontrado f essencialou a penetração de anticorpos em embriões de médio e em estágio final de pulgões; (2) a substituição de albumina sérica de soro de cabra / bovina normal com um reagente de bloqueio fornecido por um digoxigenina (DIG) -based conjunto de tampões e (3) aplicação de metanol em vez de peróxido de hidrogénio (H 2 O 2) para o branqueamento da peroxidase endógena; que reduziu significativamente a coloração de fundo nos tecidos de afídeos. Estas condições críticas optimizadas para imunocoloração permitirá a detecção eficaz de produtos de genes em embriões de A. Pisum e outros pulgões.

Neste estudo, realizamos todo mount-immunostaining em embriões de afídeos de ervilha assexuados (Figura 1A). Estas fêmeas produzir descendentes partenogeneticamente e vivíparos. Estes embriões femininos se desenvolvem em câmaras de ovo dos túbulos do ovário (ovarioles) (Figura 1B e Figura 2A). Antes de microscopia, os ovaríolos dissecados são os alvos de coloração; No entanto, a separação de câmaras de ovo...

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Identification of Critical Conditions for Immunostaining in the Pea Aphid Embryos: Increasing Tissue Permeability and Decreasing Background Staining

Identificação de condições críticas para Immunostaining no Pea Aphid Embriões: Aumento Tissue permeabilidade e diminuir a coloração de fundo

A protocol of whole-mount immunostaining on aphid embryos is presented, in which critical conditions for decreasing background staining and increasing tissue permeability are addressed. These conditions are specifically developed for effective detection of protein expression in the embryonic tissues of aphids.

The pea aphid Acyrthosiphon pisum, with a sequenced genome and abundant phenotypic plasticity, has become an emerging model for genomic and developmental ...

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There is great interest in utilizing human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) for disease modeling and cell therapeutics due to their patient ...

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

In vivo de imagens de Gene Transgenic Expressão em Individual Retinal Progenitores em embriões Zebrafish Quimérico para estudar celular Influências não-autônomos

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

Protocolos para a visualização de esteroidogênicas Órgãos e seus órgãos interativa com imunocoloração na mosca da fruta<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In multicellular organisms, a small group of cells is endowed with a specialized function in their biogenic activity, inducing a systemic response ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

Imagem ao vivo do mouse Fusão do palato secundário

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissecção e imunofluorescência coloração de cogumelo corpo e fotoreceptor neurônios em cérebros adultos Drosophila melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Visualização da atividade elétrica celular no Zebrafish embriões adiantados e tumores

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualizando o nó e placa Notochordal em Gastrulating embriões de rato usando microscopia eletrônica e imunofluorescência de montagem inteira

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...