Name: measurement of calcium fluctuations within the sarcoplasmic reticulum of cultured smooth muscle cells using fret-based confocal imaging
Uploaded: 2016-06-20T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Calcium Fluctuations Within the Sarcoplasmic Reticulum of Cultured Smooth Muscle Cells Using FRET-based Confocal Imaging at JoVE.com

وأيد هذا العمل من خلال تمويل من المعاهد الكندية لأبحاث الصحة [MOP-1112666 لCVB &amp; ME].

بيان الأخلاق: أجريت جميع التجارب والإجراءات بالاتفاق مع المبادئ التوجيهية مختبر السلامة الأحيائية التابع لجامعة كولومبيا البريطانية في فانكوفر، كندا. 1. إعداد أطباق 35 ملم الثقافة زجاج القاع للمتحد البؤر المجهري القائم الحنق، <ol style=";text-align...

<ol>
	<li>Hennings, H., Michael, D., Cheng, C., Steinert, P., Holbrook, K., Yuspa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+regulation+of+growth+and+differentiation+of+mouse+epidermal+cells+in+culture.">Calcium regulation of growth and differentiation of mouse epidermal cells in culture.</a> Cell. 19 (1), 245-254 (1980).</li><li>Whitfield, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+calcium+and+cyclic+AMP+in+cell+proliferation.">The roles of calcium and cyclic AMP in cell proliferation.</a> Ann N Y Acad Sci. 339 (1), 216-240 (1980).</li><li>Nicotera, P., Orrenius, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+calcium+in+apoptosis.">The role of calcium in apoptosis.</a> Cell Calcium. 23 (2-3), 173-180 (1998).</li><li>Wei, C., Wang, X., Chen, M., Ouyang, K., Song, L. S., Cheng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+flickers+steer+cell+migration.">Calcium flickers steer cell migration.</a> Nature. 457 (7231), 901-905 (2009).</li><li>Ashby, M. C., Tepikin, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ER+calcium+and+the+functions+of+intracellular+organelles.">ER calcium and the functions of intracellular organelles.</a> Sem Cell Dev Biol. 12 (1), 11-17 (2001).</li><li>Mattson, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ER+calcium+and+Alzheimer's+disease:+in+a+state+of+flux.">ER calcium and Alzheimer's disease: in a state of flux.</a> Sci signal. 3 (114), (2010).</li><li>Rutkowski, D. T., Kaufman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+trip+to+the+ER:+coping+with+stress.">A trip to the ER: coping with stress.</a> Trends Cell Biol. 14 (1), (2004).</li><li>Schroder, M., Kaufman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ER+stress+and+the+unfolded+protein+response.">ER stress and the unfolded protein response.</a> Mutat Res. 569 (1-2), 29-63 (2005).</li><li>Palmer, A. E., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+calcium+signaling+using+genetically+targetable+fluorescent+indicators.">Measuring calcium signaling using genetically targetable fluorescent indicators.</a> Nat Protoc. 1 (3), 1057-1065 (2006).</li><li>Poburko, D., Liao, C. H., van Breemen, C., Demaurex, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+regulation+of+sarcoplasmic+reticulum+Ca2++content+in+vascular+smooth+muscle+cells.">Mitochondrial regulation of sarcoplasmic reticulum Ca2+ content in vascular smooth muscle cells.</a> Circ Res. 104 (1), 104-112 (2009).</li><li>Esfandiarei, M., Fameli, N., Choi, Y. Y., Tehrani, A. Y., Hoskins, J. G., van Breemen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Waves+of+calcium+depletion+in+the+sarcoplasmic+reticulum+of+vascular+smooth+muscle+cells:+an+inside+view+of+spatiotemporal+Ca2++regulation.">Waves of calcium depletion in the sarcoplasmic reticulum of vascular smooth muscle cells: an inside view of spatiotemporal Ca2+ regulation.</a> PloS one. 8 (2), e55333 (2013).</li><li>Cobbold, P. H., Rink, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+and+bioluminescence+measurement+of+cytoplasmic+free+calcium.">Fluorescence and bioluminescence measurement of cytoplasmic free calcium.</a> Biochem J. 248 (2), 313-328 (1987).</li><li>Park, M. K., Ashby, M. C., Erdemli, G., Petersen, O. H., Tepikin, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perinuclear,+perigranular+and+sub-plasmalemmal+mitochondria+have+distinct+functions+in+the+regulation+of+cellular+calcium+transport.">Perinuclear, perigranular and sub-plasmalemmal mitochondria have distinct functions in the regulation of cellular calcium transport.</a> The EMBO journal. 20 (8), 1863-1874 (2001).</li><li>Lovett, J. L., Sibley, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+calcium+stores+in+Toxoplasma+gondii+govern+invasion+of+host+cells.">Intracellular calcium stores in Toxoplasma gondii govern invasion of host cells.</a> J Cell Sci. 116 (14), 3009-3016 (2003).</li><li>Kleinman, H. K., Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrigel:+basement+membrane+matrix+with+biological+activity.">Matrigel: basement membrane matrix with biological activity.</a> Semin Cancer Biol. 15 (5), 378-386 (2005).</li><li>Palmer, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++indicators+based+on+computationally+redesigned+calmodulin-peptide+pairs.">Ca2+ indicators based on computationally redesigned calmodulin-peptide pairs.</a> Chem Biol. 13 (5), 521-530 (2006).</li></ol>

يصف هذا البروتوكول ترنسفكأيشن من VSMCs مع اتش D1SR لدراسة الكالسيوم 2+ تركيزات داخل تجويف ريال. وتسمح هذه الطريقة لقياس المباشر من الكالسيوم 2+ ضمن هذه العضية وكذلك حركتها إلى / من ريال نتيجة لتطبيق مختلف وكلاء الحركة الكالسيوم. هذا الأسلوب لديه العديد من المزا?...

كاليفورنيا 2+ هو أيون المهم جدا وجدت في وفرة في كل خلية واحدة في الجسم. لها أدوار هامة في العديد من الوظائف الخلوية المختلفة، بما في ذلك النمو والانتشار، والهجرة، وموت الخلايا المبرمج 1-4. ومن الثابت أن الكالسيوم 2+ يمكن أن تؤثر هذه العمليات سواء من خلال الإجراءات المباشرة وغير المباشرة، وبالتالي، يمكن أن التغييرات في تركيزات داخل الخلايا العادية من هذا أيون تؤدي بسهولة إلى نتائج سلبية على الخلايا المتضررة. يعتبر ريال كأكبر الكالسيوم داخل الخلايا 2+ مخزن داخل الخلية 5. تتم المحافظة على مستوى الولاية ثابتة من الكالسيوم 2+ في كل من ريال والسيتوبلازم عادة من خلال تغير مستمر داخل وخارج كا 2+ -transporting قنوات هذه العضية. وترتبط ظروف ضاغطة المفروضة على الخلايا الناتجة عن أي شكل من أشكال الإصابة أو المرض عادة مع تغييرات كبيرة في ريال كا 2+ التي تذهب على أن يكون لها تأثيرات طويلة الأمد على أنهalth للخلية. في أشد الحالات، وعدم قدرة خلية أكد لاستعادة والحفاظ على حالة الاستقرار ريال كا 2+ مستويات قد تتوج حتى في الموت موت الخلايا المبرمج 6-8. الأبحاث الحالية إلى الخلوية الكالسيوم 2+ ديناميات محدودة بسبب حقيقة أن اختبار عدد قليل من الدراسات العضيم الكالسيوم 2+ المحتوى المخزن مباشرة 9-11. الممارسة الأكثر شيوعا بدلا من ذلك ينطوي على قياس هيولي مستويات الكالسيوم 2+ كما القياسات غير المباشرة للتغيرات في ريال كا 2+ محتوى 12-14. في هذه التجارب، كاليفورنيا 2+ التي يسببها عادة يتم الافراج عن ريال من خلال استخدام وكلاء الدوائية مما تسبب في استنزاف العضية (على سبيل المثال thapsigargin). ثم يتم استخلاص استنتاجات فيما يتعلق تغييرات على ريال كا 2+ على أساس التقلبات في هيولي تركيزات الكالسيوم 2+. وعلى الرغم من القدرة المتبقية للمحققين لرسم هذه الاستنتاجات في أماه دوارnner، وهذه الطريقة من قياس ريال كا 2+ بشكل واضح بطريقة غير مباشرة إلى جمع مثل هذه المعلومات، مع الكثير من القيود المتعلقة بتفسير البيانات التي تم جمعها. من أجل تجاوز هذا القيد واضح، فمن الضروري لقياس كمية من الكالسيوم 2+ وجدت مباشرة داخل الشبكة اللمعية ريال. حيوية في النتيجة النهائية لتكون قادرة على تسجيل مباشرة داخل اللمعة ريال مستويات الكالسيوم 2+ هي أدوات زراعة الخلايا ومؤشر الكالسيوم 2+ المستخدمة. للبيانات المشار إليها في المخطوطة الحالية، من المهم أن نلاحظ أن VSMCs المستخدمة جاءت من خط الخلايا المجمدة. كانت الخلايا المزروعة في المتوسط ​​التعديل النسر Dulbecco وفي (DMEM) + 10٪ مصل العجل (سي إس) عبر الممرات 22-26 لالتجارب المذكورة، المحتضنة في ثابت 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 العرض. باستخدام الطريقة الحالية، على سبيل المثال، قد نمت الخلايا بنجاح كبير على خليط من البروتين الذي يحاكي خارج الخليةالبيئة من العديد من أنواع مختلفة من الأنسجة (15). هام للنجاح على طول الوريد ريال كا 2+ البحث هو نوع من خليط من البروتين المستخدمة؛ في هذه الحالة، كانت منخفضة عامل النمو متنوعة اللازمة لتجنب مكونات هذه الأداة من التأثير على العادية الكالسيوم 2+ الإشارات والحركات التي تحدث باستمرار داخل الخلايا التي تم اختبارها. في أعقاب النمو الناجح للخلايا اختبار، ويجب أيضا أن قدم مؤشر الكالسيوم 2+ بفعالية لهذه الخلايا المستزرعة. وقد أصبح هذا ممكنا باستخدام ناقلات الفيروسة الغدانية الذي يحمل 2+ مؤشر D1SR الكالسيوم المقيمين ريال. لتحقيق الكفاءة ترنسفكأيشن عالية، ويجب أن تكون المحتضنة الخلايا مع ناقلات فيروسية ل36-48 ساعة على الأقل قبل التصوير. هذا المستحضر يوفر أداة موثوقة لقياس الكالسيوم 2+ العابرين داخل تجويف ريال مع دقة عالية والتكاثر. مؤشر D1SR المستخدمة في هذا البروتوكول هو البديل معدلة من D1ER الكالسيوم 2+ طndicator الذي تم إنشاؤه في الأصل من قبل مختبر الدكتور روجر تسيان في جامعة كاليفورنيا، سان دييغو، الولايات المتحدة الأمريكية 9،16. وD1ER الأصلي ينتمي إلى الجيل الثاني من المشفرة وراثيا مؤشرات الكالسيوم 2+ دعا cameleons التي تعرض الحساسيات الكالسيوم 2+ على نطاق أوسع من ذلك بكثير (0،5 حتي 160 ميكرومتر) بالمقارنة مع الكالسيوم 2+ المؤشرات السابقة 9،16. وD1SR البديل الجديد، هدية عينية من الدكتور واين تشن (جامعة ألبرتا، كندا)، ومع ذلك، يحمل تسلسل كالسيكويسترين متحولة (بدلا من تسلسل calreticulin كما في D1ER الأصلي). وكالسيكويسترين متحولة وخفض ملزم لكا 2+ أن يلغي قضية تتنافس مع كالسيكويسترين الذاتية في الربط إلى الكالسيوم 2+ داخل التجويف ريال 11. مؤشر D1SR يحمل اقتطاع تعزيز السماوي ببروتين (CFP) والبروتين أصفر فلوري (YFP) التي تربط بواسطة بروتين رابط يحتوي كالمودولين المعدلة (CAM) وM13 (رانه الببتيد 26 عاما بقايا من الميوسين كيناز ضوء سلسلة التي تربط لكام) متواليات. تم تعديل تسلسل كام M13 لمنع M13 من الربط إلى كالمودولين الذاتية. أيضا، لضمان الاحتفاظ ريال، تمت إضافة تسلسل كالسيكويسترين في نهاية 5&#39;من CFP 11. وعندما يرتبط الكالسيوم 2+، يذهب المجال كام M13 من خلال التغييرات متعلق بتكوين التي تؤدي إلى زيادة في نقل الطاقة بين CFP المرافقة وYFP، والتي يتم تسجيلها على أنها زيادة في كثافة إشارة الحنق. من ناحية أخرى، عندما ينخفض ​​تركيز الكالسيوم ريال اللمعية 2+، يذهب المجال كام M13 من خلال التغييرات متعلق بتكوين العكسية، مما أدى إلى انخفاض في نقل الطاقة بين CFP المرافقة وYFP، وانخفاض كبير في الحنق كثافة إشارة .

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (high glucose, pyruvate)</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>11995-065</td>
			<td>Warm in 37&#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced, 5mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356230</td>
			<td>Keep at -20&#176;C until right before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Newborn Calf Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Keep at -20&#176;C until right before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35mm glass-bottomed plates</td>
			<td>MatTek Corporation</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 mL 0.2 &#956;M vented blue plug seal cap flask</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA Solution</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>25200056</td>
			<td>Keep at -20&#176;C until right before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Polypropylene Conical Tube</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D1SR</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Gift</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo 4-AM</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>F-23917</td>
			<td>Keep at -20&#176;C until right before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Black Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Argos Technologies</td>
			<td>T7100BK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP5 confocal microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Application Suite 2.6.3 (with FRET SE Wizard application)</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism 5.0</td>
			<td>GraphPad Software, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of calcium fluctuations within the sarcoplasmic reticulum of cultured smooth muscle cells using fret-based confocal imaging

Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall health. A significant portion of intracellular Ca2+ content is found within the SR stores in VSMCs. As the only intracellular organelle with a close association to the surrounding extracellular space through plasma membrane-SR junctions, the SR can be considered to constitute the first line of response to any irregularity in Ca2+ transients, or stress experienced by the cell. Among its many functions, one of the most important is its role in the transmission of Ca2+-regulated signals throughout the cell to induce further cell-wide reactions downstream. The more common use of cytoplasmic Ca2+ indicators in this regard is overall insufficient for research into the highly dynamic changes to the intraluminal SR Ca2+ store that have yet to be fully characterized. Here, we provide a detailed protocol for the direct and clear measurement of luminal SR Ca2+. This tool is useful for investigation into the nuanced changes in SR Ca2+ that have significant subsequent effects on the normal function and health of the cell. Fluctuations in SR Ca2+ content specifically can provide us with a significant amount of information pertaining to cellular responses to disease or stress conditions experienced by the cell. In this method, a modified version of a SR-targeted Ca2+ indicator, D1SR, is used to detect Ca2+ fluctuations in response to the introduction of agents to cultured rat aortic smooth muscle cells (SMCs). Following incubation with the D1SR indicator, confocal fluorescence microscopy and fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based imaging are used to directly observe changes to intraluminal SR Ca2+ levels under control conditions and with the addition of agonist agents that function to induce intracellular Ca2+ movement.

ويوفر هذا القسم أمثلة من النتائج التي يمكن الحصول عليها باستخدام الطريقة الموصوفة لالتقاط البيانات تركيز الكالسيوم 2+ اللمعية ريال سعودي، مقارنة مع الطريقة المستخدمة عادة لقياس غير مباشر تغييرات على العضيم الكالسيوم 2+ تركيزات مخزن من ?...

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Calcium Fluctuations Within the Sarcoplasmic Reticulum of Cultured Smooth Muscle Cells Using FRET-based Confocal Imaging at JoVE.com

Measurement of Calcium Fluctuations Within the Sarcoplasmic Reticulum of Cultured Smooth Muscle Cells Using FRET-based Confocal Imaging

Currently, most available calcium indicators are used to quantify cytoplasmic calcium transients as indirect measures of calcium released from the sarcoplasmic reticulum in cultured smooth muscle cells. This protocol describes the use of a specific FRET-based indicator that allows direct measurement of calcium signals within the sarcoplasmic reticulum lumen.

التصوير متحد البؤر قياس التقلبات الكالسيوم داخل الهيولى العضلية شبكية من مثقف خلايا العضلات الملساء عن طريق الحنق المستندة إلى

Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall ...

The overall goal of this imaging technique is to monitor fluctuations in lumenal SR calcium levels in response to calcium mobilizing agents specifically in vascular smooth muscle cells. This method can be helpful in elucidating cellular calcium cycling in a more direct fashion. For example, it's very important to know the relation with between our calcium transport in the sarcoplasmic reticulum and ER stress.The advantage of this technique is that we can directly measure the calcium inside the lumen of the sarcoplasmic reticulum rather than to have to extrapolate it from indirect measurements of changes in the cytoplasm. Demonstrating this technique will be Gabriela Ziomek who is a graduate student in my laboratory. To begin this procedure, prepare a one to 25 dilution of protein mixture in DMEM.Next, transfer 200 microliters of protein mixture DMEM to each 35 milometer glass-bottomed plate to fully cover the bottom inner glass circle. Leave the plates at room temperature inside the safety cabinet for at least 30 minutes. In the meantime, warm DMEM with 10 percent NCS to 37 degrees Celsius in a water bath.Afterward, remove the DMEM from the culture flask using a glass pipette. Subsequently, wash the flask bottom with warm sterile PBS to remove the remaining DMEM residue. To dislodge the cultured smooth muscle cells from the flask bottom, wash the flask quickly with one milliliter of trypsin and remove it.Then add in another milliliter of trypsin. Swish the flask for about 30 to 60 seconds to ensure that the enzyme makes contact with the entire bottom of the flask before removing it. Once the cells have been dislodged with trypsin, add fresh DMEM with 10 percent NCS to the flask to stop the trypsin reaction.Transfer the resulting cell solution from the flask to a clean labeled 50 milliliter conical tube. Then add one milliliter of fresh DMEM plus 10 percent NCS to each plate being prepared. After that, gently invert the tube containing the cell solution multiple times to break up any pellet that may have formed.Pipette the desired volume of gently mixed cell solution into each plate. Subsequently, swirl each plate thoroughly clockwise or counter clockwise to ensure equal distribution of cells across the glass at the bottom. It's necessary to add enough cells to the plate to make sure that they reach high enough confluency over the next 48 hours for effective imaging.Following the addition of medium and cell solution to each plate, incubate the plates at 37 degrees Celsius with five percent carbon dioxide for at least one hour to allow the cells to attach properly to the glass bottom. Check the plates under a microscope at fifteen minute intervals until the cells are clearly attached. Then retrieve the Adenavirus D one SR aliquat from minus 80 degrees Celsius storage and transport it to the biological safety cabinet in a mobile ice bath.Afterward.Pipette the desired dose of chilled D one SR to each plate and incubate the infected cells at 37 degrees Celsius overnight. The next day, replenish the cells with one milliliter of fresh DMEM plus ten percent NCS. Subsequently, incubate the plates in a humidified incubator at 37 degrees Celsius with five percent carbon dioxide overnight.Following overnight incubation, remove the culture medium from the plate. Wash the culture plate with one milliliter of warm physiological HEPES-PSS buffer three times. Next, add one milliliter of fresh warm HEPES-PSS buffer immediately prior to recording.Perform initial imaging using the FRET SE application by opening the confocal microscope's associated software. Once the application is open, click the setup tab to adjust the desired experimental settings. Manually change the channel settings so that the cells are excited in sequence at 440 nanometers for donor and FRET and 513 nanometers for acceptor.Then set the emission wavelengths at 488 nanometers for donor and 535 nanometers for FRET and acceptor. Subsequently, set the light intensity at 15 percent transmission with 150 millisecond excitation exposure time of cells and 10 second intervals between exposures. Next stabilize the plate on the microscope stage.Use the live button to check the image resolution. Adjust the settings further for the desired resolution. Under the setup tab, take an image of the sample using the capture image button.Now moving to the evaluation tab, choose the appropriate method to calculate the FRET efficiencies for the experiments being preformed. Method three which uses ratiometric calculation is recommended for experiments involving Cameleons such as the D one SR indicator. After that, switch to the graph tab in order to observe the intensity values being recorded in a graph.If desired, draw an ROI in the image viewer to observe the corresponding average intensity of this area of interest on the graph. Start recording to collect the data for at least three minutes to ensure a steady base line signal prior to introducing the agent of interest. Then, introduce a calcium moving agent as a tool for depleting SR calcium by applying it directly into the plate near the region of interest being recorded.Continue the recording for a desired duration after treatment. Afterward, capture the ratiometric FRET serial images with a confocal inverted microscope using the FRET SE application. In this step, to prepare the culture plates of rat aortic smooth muscle cells wash the culture plate with one milliliter of warm physiological HEPES-PSS buffer three times.Then, mix the indicator with one milliliter of warm HEPES-PSS and load it onto the culture plates. Incubate the smooth muscle cells with the indicator for one hour at room temperature. After an hour, remove the indicator from the culture plate and wash it with one milliliter of warm physiological HEPES-PSS buffer three times.Then, add one milliliter of fresh warm HEPES-PSS buffer immediately prior to recording. Capture serial images with the confocal inverted microscope. Subsequently, introduce the calcium moving agent as a tool for depleting SR calcium and continue recording for the desired amount of time post treatment.Shown here are the representative snapshots of a smooth muscle cell transfected with D one SR indicator using CFP, FRET, and YFP band pass filters. This figure shows the real time pseudo-color snapshots of the cultured rat aortic smooth muscle cells transfected with D one SR.Treatment with two micromolar of Thapsigargin showed a decrease in signal intensity which indicated a significant drop in SR calcium content due to Thapsigargin induced calcium release. And this graph shows the representative trace for the normalized D one SR ratio in the cultured smooth muscle cells treated with two micromolar Thapsigargin which confirmed a significant drop in SR calcium.Here are the representative snapshots of the cultured rat aortic smooth muscle cells loaded with cytoplasmic calcium indicator and treated with two micromolar Thapsigargin. As shown, Thapsigargin causes a significant increase in signal intensity within the cytoplasm due to the release of calcium from the SR.And this graph shows a representative trace for the normalized Fluo four AM ratio in the cultured smooth muscle cells treated with two micromolar Thapsigargin. The depicted increase in calcium signal is considered to be proportional to the amount of calcium released from the SR.Once mastered, this technique can be done in approximately 48 hours from start to finish if it is done properly.While attempting this procedure, it's important to keep the cells in the described conditions to ensure their health prior to transfection with the calcium indicator. After watching this video, you should have a clear understanding of how to prepare cultured cells to allow for measurement of lumenal SR calcium levels using the D one SR indicator.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells (HUASMC)

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells HUASMC

عزل الشريان السري الإنسان خلايا العضلات الملساء (HUASMC)

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

مضان القائم على القياس من دخول الكالسيوم المتجر الذي يعمل في الخلايا الحية: من خلية السرطان مثقف على عضلة

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Isolation of Pulmonary Artery Smooth Muscle Cells from Neonatal Mice

عزل الشريان الرئوي خلايا العضلات الملساء من الفئران حديثي الولادة

Pulmonary hypertension is a significant cause of morbidity and mortality in infants. Historically, there has been significant study of the signaling ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

تقييم الكالسيوم سباركس السليمة في ألياف العضلات الهيكلية

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Subdomains in Cultured Cells

تصور هيولي باطني شبكية النطاقات الفرعية في الخلايا المستزرعة

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and ...

Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research

قياس السلس وظيفة العضلات في الأنسجة المعزولة حمام تطبيقات لأبحاث الصيدلة

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues.  ...

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

رسم الخرائط البصرية البينية العضلية شبكية كاليفورنيا<sup&gt; 2+</sup&gt; وإمكانية الغشاء في قلب الأرنب Langendorff perfused-

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a ...

Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP

Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP

رصد الباطنة شبكية الكالسيوم باستخدام<em&gt; Gaussia</em&gt; luciferase المراسل SERCaMP

The endoplasmic reticulum (ER) contains the highest level of intracellular calcium, with concentrations approximately 5,000-fold greater than cytoplasmic ...

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

عزل الفئران التاجي الأوعية الدموية خلايا العضلات الملساء

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

Measuring Proliferation of Vascular Smooth Muscle Cells Using Click Chemistry

قياس انتشار خلايا العضلات الملساء الوعائية باستخدام الكيمياء فوق

The ability of a cell to proliferate is integral to the normal function of most cells, and dysregulation of proliferation is at the heart of many disease ...