Name: clinicopathological analysis of mirna expression in breast cancer tissues by using mirna in situ hybridization
Uploaded: 2016-06-07T15:00:00
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This work was supported by the NIH grant (5R01 CA178386-03) and the USC ASPIRE-1 grant to HC. We would like to thank Vrushab Gowda for his assistance with manuscript.

この研究は、全南大学校和順病院、サウスカロライナ大学の治験審査委員会によって承認されました。乳がんと一致した隣接する正常な乳房組織で構成されるTMAサンプルは全南大学校和順病院、韓国バイオバンクネットワークのメンバーのバイオバンクから提供されました。 1.溶液の調製<ol><li> DNアーゼおよびRNaseフリー水1リットルを準備します。ジエチル（DEPC）処理...

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	<li>Shah, N. R., Chen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+in+pathogenesis+of+breast+cancer:+Implications+in+diagnosis+and+treatment.">MicroRNAs in pathogenesis of breast cancer: Implications in diagnosis and treatment.</a> World J Clin Oncol. 5, 48-60 (2014).</li><li>Tang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-185+suppresses+tumor+proliferation+by+directly+targeting+E2F6+and+DNMT1+and+indirectly+upregulating+BRCA1+in+triple-negative+breast+cancer.">miR-185 suppresses tumor proliferation by directly targeting E2F6 and DNMT1 and indirectly upregulating BRCA1 in triple-negative breast cancer.</a> Mol Cancer Ther. 13, 3185-3197 (2014).</li><li>Ye, X. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+silencing+of+miR-375+induces+trastuzumab+resistance+in+HER2-positive+breast+cancer+by+targeting+IGF1R.">Epigenetic silencing of miR-375 induces trastuzumab resistance in HER2-positive breast cancer by targeting IGF1R.</a> BMC Cancer. 14, 134 (2014).</li><li>Oneyama, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-mediated+downregulation+of+mTOR/FGFR3+controls+tumor+growth+induced+by+Src-related+oncogenic+pathways.">MicroRNA-mediated downregulation of mTOR/FGFR3 controls tumor growth induced by Src-related oncogenic pathways.</a> Oncogene. 30, 3489-3501 (2011).</li><li>McGuire, A., Brown, J. A., Kerin, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metastatic+breast+cancer:+the+potential+of+miRNA+for+diagnosis+and+treatment+monitoring.">Metastatic breast cancer: the potential of miRNA for diagnosis and treatment monitoring.</a> Cancer Metastasis Rev. 34, 145-155 (2015).</li><li>Quesne, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+and+prognostic+associations+of+miR-205+and+let-7b+in+breast+cancer+revealed+by+in+situ+hybridization+analysis+of+micro-RNA+expression+in+arrays+of+archival+tumour+tissue.">Biological and prognostic associations of miR-205 and let-7b in breast cancer revealed by in situ hybridization analysis of micro-RNA expression in arrays of archival tumour tissue.</a> J Pathol. 227, 306-314 (2012).</li><li>Fernandez, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-340+inhibits+tumor+cell+proliferation+and+induces+apoptosis+by+targeting+multiple+negative+regulators+of+p27+in+non-small+cell+lung+cancer.">miR-340 inhibits tumor cell proliferation and induces apoptosis by targeting multiple negative regulators of p27 in non-small cell lung cancer.</a> Oncogene. 34, 3240-3250 (2015).</li><li>Yu, L., Zhang, J., Guo, X., Li, Z., Zhang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-224+upregulation+and+AKT+activation+synergistically+predict+poor+prognosis+in+patients+with+hepatocellular+carcinoma.">MicroRNA-224 upregulation and AKT activation synergistically predict poor prognosis in patients with hepatocellular carcinoma.</a> Cancer Epidemiol. 38, 408-413 (2014).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=microRNA-146+up-regulation+predicts+the+prognosis+of+non-small+cell+lung+cancer+by+miRNA+in+situ+hybridization.">microRNA-146 up-regulation predicts the prognosis of non-small cell lung cancer by miRNA in situ hybridization.</a> Exp Mol Pathol. 96, 195-199 (2014).</li><li>Kriegel, A. J., Liang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+in+situ+hybridization+for+formalin+fixed+kidney+tissues.">MicroRNA in situ hybridization for formalin fixed kidney tissues.</a> J Vis Exp. , e50785 (2013).</li><li>Ucar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-212+and+miR-132+are+required+for+epithelial+stromal+interactions+necessary+for+mouse+mammary+gland+development.">miR-212 and miR-132 are required for epithelial stromal interactions necessary for mouse mammary gland development.</a> Nat Genet. 42, 1101-1108 (2010).</li><li>Nuovo, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+detection+of+microRNAs+in+paraffin+embedded,+formalin+fixed+tissues+and+the+co-localization+of+their+putative+targets.">In situ detection of microRNAs in paraffin embedded, formalin fixed tissues and the co-localization of their putative targets.</a> Methods. 52, 307-315 (2010).</li><li>Kierzek, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+locked+nucleic+acid+residues+on+the+thermodynamic+properties+of+2'-O-methyl+RNA/RNA+heteroduplexes.">The influence of locked nucleic acid residues on the thermodynamic properties of 2'-O-methyl RNA/RNA heteroduplexes.</a> Nucleic Acids Res. 33, 5082-5093 (2005).</li><li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paraffin+embedding+tissue+samples+for+sectioning.">Paraffin embedding tissue samples for sectioning.</a> CSH Protoc. 2008, (2008).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+expression+of+miR-182+and+miR-503+cooperatively+targets+FBXW7,+contributing+to+the+malignant+transformation+of+colon+adenoma+to+adenocarcinoma.">Sequential expression of miR-182 and miR-503 cooperatively targets FBXW7, contributing to the malignant transformation of colon adenoma to adenocarcinoma.</a> J Pathol. 234, 488-501 (2014).</li></ol>

この研究の目的は、in situハイブリダイゼーションのmiRNAを用いた乳癌組織におけるmiRNA発現のレベルを決定することでした。なお、この実験では、全ての条件が乳癌組織のために最適化されたことに注意しなければなりません。さらなる最適化は、他の組織タイプのために必要になることがあります。全ての溶液は、DEPC水で行う必要があり、使用されるすべての容器はDEPC処理水ですす...

乳がんは世界中の女性人口に影響を与える最も一般的な悪性腫瘍の一つです。乳癌の130万以上の例は世界的に毎年1,2報告されています。腫瘍細胞は、伝統的に、生物学的に均一で高い増殖性とみなされてきたが、乳癌は遺伝的および臨床的に不均一であることが明らかになってきています。流行している抗がん剤に対する耐性は、癌の進行と距離転移3のその促進を通じ、大多数の患者の死亡率につながる、先進的な乳癌の特徴です。 マイクロRNA（miRNA）はmRNAの翻訳を遮断またはmRNA分解4を媒介することにより遺伝子発現を調節する約22ヌクレオチド長の小RNA分子のクラスです。 2,000人以上の異なるmiRNAは、これまでヒト疾患5にリンクされている人間、で同定されています。研究の増加アレイは、肝炎Eは、miRNAが癌遺伝子及び腫瘍抑制因子として機能することができ、多くの場合、腫瘍6の異常調節されていることを実証しました。 miRNAは強く腫瘍細胞の運動性、浸潤および転移7のものと一緒に、細胞周期の進行、老化、アポトーシスおよびオートファジーの主要な調節因子を制御することにより、一次腫瘍形成のすべてに影響を与えます。 異常なmiRNA発現はまた、ステージ、分化、予後およびアジュバント療法8に対する応答として臨床的意義と関連しています。具体的には、のmiR-146の発現が、 ​​肺癌患者9における予後不良と相関して増加しました。別の研究では、miRNA-let7bの失われた式は、悪性の表現型にリンクされていると、結果的に、低い生存率6されていることを実証しました。 miRNAを発現する細胞と構造の種類を理解することは、miRNAの発現に影響を​​与える細胞の変化、それを通して力学を理解することの重要な部分であり、組織は10を表現型。間質細胞で分泌されることがわかっ特定のmiRNAは、上皮細胞によって取り込まれ、具体的にその標的に作用しています。同じ静脈では、のmiR-212およびmiR-132は、間質から分泌され、乳腺発達11時の乳管伸長に必要な上皮-間質相互作用を調節しています。この論文の全体的な目的は、in situハイブリダイゼーションにおける miRNAを介して乳癌組織におけるmiRNAの発現を検出するための詳細なプロトコルを説明することです。我々は、乳癌患者サンプル中のmiRNA-489の発現のレベルをアッセイするために、すべての条件を最適化しました。この目的のために、我々は、DIGがロックされた核酸（LNA）、我々の実験でプローブを標識しました。そのヌクレオチドのいくつかは、それは、2 &#39;酸素原子と4&#39;は、ハイブリダイゼーション後の「適所にロックされた」ままになるようにヌクレオチドを​​固定リボース骨格の炭素原子を連結するメチレン架橋であり、LNA修飾を有していました。結果として、それははるかに困難ですハイブリダイズした複合体は、12,13を変性するために。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="661">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">ELF-97</td>
			<td style="width:159px;">Life technology&#160;</td>
			<td style="width:119px;">E6604</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">50X Denhard&#39;t&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Life technology&#160;</td>
			<td align="right" style="width:119px;">750018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">t-RNA</td>
			<td style="width:159px;">Roche</td>
			<td align="right" style="width:119px;">109541</td>
			<td>Reconstitute in DEPC water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Herring Sperm DNA</td>
			<td style="width:159px;">Promega&#160;</td>
			<td style="width:119px;">D1815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Roche Blocking&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Roche</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11096176001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">RVC</td>
			<td style="width:159px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">50-812-650</td>
			<td>Before use spin down it at 16.1 RCF and take supernatant&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">miR-489 probe&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Exiqon</td>
			<td style="width:119px;">38599-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nuclease free BSA</td>
			<td style="width:159px;">Roche&#160;</td>
			<td align="right" style="width:119px;">711454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Primary antibody-anti DIG</td>
			<td style="width:159px;">Roche&#160;</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11093274910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Diethyl Pyrocarbonate&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:119px;">1609478</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

clinicopathological analysis of mirna expression in breast cancer tissues by using mirna in situ hybridization

In this article, we describe a detailed protocol for miRNA detection in breast cancer tissue using in situ hybridization with a digoxigenin-labelled LNA (Locked Nucleic Acid) probe. The probe was recognized by anti-DIG alkaline phosphatase antibodies and later developed using alkaline phosphatase substrate producing fluorescence signals. Here we utilized miRNA in situ hybridization (MISH) technique to analyze expression of miR-489 in tissues from breast cancer patients. This technique can detect the localization of miRNA of interest in individual tissue samples. This technique can be used to compare the expression of desired miRNA in tumor tissue with that in adjacent normal tissue and to identify the specific structures responsible for expressing this miRNA. This technique can be very useful in answering certain clinical questions, such as role of specific miRNA in the development of cancer. Our results indicate that mammary epithelial cells express significantly higher levels of miR-489 than adjacent tumor cells.

ヒト乳癌組織のmiRNA-489の発現を決定しました。乳腺管上皮細胞は、隣接する二人の患者における腫瘍組織（ 図1Aおよび1B）よりも有意に高かったmiRNA-489レベルを発現することが見出されました。これは明らかなmiRNA-489の発現がmiRNA-489の腫瘍抑制活性を示唆し、腫瘍組織では失われていることを示しています。さらに、これらの結果を確認する?...

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Clinicopathological Analysis of miRNA Expression in Breast Cancer Tissues by Using miRNA In Situ Hybridization

Here we present a protocol to detect miRNA expression in breast cancer patient samples using miRNA in situ hybridization.

miRNAを用いた乳がん組織におけるmiRNA発現の臨床病理学的解析<em&gt;その場で</em&gt;ハイブリダイゼーション

In this article, we describe a detailed protocol for miRNA detection in breast cancer tissue using in situ hybridization with a digoxigenin-labelled LNA ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Clinicopathological Analysis of miRNA Expression in Breast Cancer Tissues by Using miRNA In Situ Hybridization

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