Name: immobilization of multi-biocatalysts in alginate beads for cofactor regeneration and improved reusability
Uploaded: 2016-04-22T15:00:00
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Diese Forschung wurde von der Grundlagenforschung Forschungsprogramm durch die National Research Foundation of Korea (NRF) vom Ministerium für Bildung, Wissenschaft und Technologie (NRF-2013R1A1A2012159 und NRF-2013R1A1A2007561), Konkuk University, und dem Department of Chemical Engineering und mcubed finanziert unterstützt Programm an der University of Michigan.

1. Ganzzellbiokatalysatoren Vorbereitung HINWEIS: Das rekombinante E. coli - Zellen pET28a- SpNox 31 oder pET28a- HjLAD 28 werden im folgenden als E. beherberge coli SpNox und E. coli HjLAD, respectively. <ol><li> Impfen eine einzelne Kolonie von E. coli HjLAD in 3 ml Luria-Bertani (LB) Medium mit Kanamycin (50 ug / ml) ergänzt und Inkubation in einem Inkubator - Schüttler O / N bei ...

Neueste technologische Fortschritte haben einen Anstieg in der Kommerzialisierung von rekombinanten Biotherapeutika, was zu einem allmählichen Anstieg in ihrem Marktwert in der Biotechnologie-Industrie ermöglicht. Ein solcher Fortschritt ist das Aufkommen von Metabolic Engineering in rekombinanten Mikroorganismen, die ein großes Versprechen bei der Schaffung skalierbare industrielle Systeme 38 gezeigt hat. Wie bei den meisten Verfahren ist die erfolgreiche Kommerzialisierung von rekombinantem Biomolekülen...

3 - reduktiven Ganzzell - Biotransformation unter Verwendung von Mikroorganismen hat eine weit verbreitete Methode für die chemo-enzymatischen Synthese von kommerziell und therapeutisch wichtigen Biomolekülen 1 geworden. Es stellt mehrere Vorteile gegenüber der Verwendung von isolierten Enzymen, insbesondere die Beseitigung von kostenintensiven nachgeschaltete Reinigungsverfahren und die Demonstration einer verlängerten Lebensdauer von 4 bis 7. Für biokatalytische Wege wo Cofaktoren für die Produktbildung erforderlich sind, haben Ganzzellsysteme das Potential in situ Regeneration Kofaktor über die Zugabe von kostengünstigen elektronenabgebenden Cosubstrate 5,8,9 bereitzustellen. Jedoch ist diese Kapazität für Reaktionen vermindert , die eine stöchiometrische Konzentration von seltenen oder teuren Co-Substrate 10 erfordern - 13. Zusammen mit einer schlechten Wiederverwertbarkeit von ganzen Zellen, erschwert dies die Einrichtung eines skalierbaren und kontinuierlichen production System. Strategische Änderungen von Ganzzellsysteme für diese cofaktorabhängig Biotransformationen sind erforderlich, um die oben genannten Einschränkungen zu überwinden. Die Kombination von Ganzzell - Biokatalysatoren gesagt, die kooperativ arbeiten , wurden 14 gezeigt , erheblich die Produktivität und Stabilität der Enzyme beherbergten verbessern. Diese Faktoren, die oft entscheidend für die Aktivierung groß angelegte Produktion von marktfähige Produkte, kann durch 15 Co-Immobilisierung von biokatalytischen Mikroben optimiert werden. Wir haben vor kurzem eine einfache und wiederverwendbar whole-cell biokatalytische System , das sowohl die Regeneration Cofaktor ermöglicht und Biokatalysator Immobilisierung für die L-Xylulose Produktion 16. In dieser Studie wurde dieses System als Beispiel verwendet, um die experimentellen Verfahren des Anwendens dieser beiden Strategien für eine verbesserte Biotransformation Produktionsausbeute und Biokatalysator Wiederverwertbarkeit zu veranschaulichen. L-Xylulose gehört zu einer class biologisch nützliche Moleküle seltenen Zucker genannt. Seltene Zucker sind einzigartige Monosaccharide oder Zuckerderivate , die sehr selten in der Natur vorkommen, sondern spielen eine entscheidende Rolle als Erkennungselemente in bioaktiven Molekülen 17,18. Sie haben eine Vielzahl von Anwendungen , von Süßstoffen hin, funktionelle Lebensmittel , um potenzielle Therapeutika 19. L-Xylulose kann als potentieller Inhibitor der mehreren α-Glucosidasen verwendet werden und auch als ein Indikator von Hepatitis oder Leberzirrhose 17,20 verwendet werden. Hoher Wirkungsgrad Umwandlung von Xylit zu L-Xylulose in Ganzzellsystemen wurde bereits berichtet , in Pantoea ananatis 21,22, sp Alcaligenes. 701B 23, Bacillus pallidus Y25 24,25 und Escherichia coli 26. In E. coli wurde jedoch nur unter Verwendung von niedrig (&lt;67 mM) Konzentrationen Xylit 26 aufgrund möglicher inhibitorischen Wirkungen von einem Anfangs Xylit Konzentration höher als 1 erreicht00 mM auf Xylit-4-Dehydrogenase - Aktivität 21,26. Das thermodynamische Gleichgewicht zwischen Xylulose und Xylitol hat sich gezeigt, stark die Bildung von Xylit 25,27 begünstigen. Zusätzlich wird Xylulose Ausbeute durch die Menge der teuren Cofaktoren beschränkt , die in der Abwesenheit eines in situ - Cofaktor - Regenerationssystem zugeführt werden müssen. Zusammen begrenzen diese Faktoren das Potenzial für in nachhaltige Systeme für die L-Xylulose Biosynthese Skalierung. Um diese Einschränkungen zu überwinden und die L-Xylulose Biotransformation Ausbeute zu verbessern, wurde die Strategie der Cofaktorregenerierung eingesetzt zuerst durch eine gekoppelte Ganzzell biokatalytischen Systems. Genauer gesagt, L-Arabinitol-4 - Dehydrogenase (EC 1.1.1.12) aus Hypocrea jecorina (HjLAD), ein Enzym in den L-Arabinose - Abbauweg von Pilzen, wurde die Umwandlung von L-arabinitol in L-Xylulose 28,29 katalysieren ausgewählte . Wie viele biosynthetischen Enzyme, eine große limitation von HjLAD ist , daß es eine stöchiometrische Menge des teuren Cofaktors Nicotinamidadenindinucleotid (NAD +, die oxidierte Form von NADH) erfordert , um diese Umwandlung durchzuführen. NADH - Oxidase in Streptococcus pyogenes (SpNox) gefunden wurde , 30,31 hohe Cofaktor-Regeneration Aktivität gezeigt angezeigt werden soll . Unter Ausnutzung dieser Eigenschaft von SpNox, E. coli - Zellen HjLAD zur Herstellung von L-Xylulose exprimieren , wurden mit E. gekoppelt coli - Zellen SpNox für die Regeneration von NAD + Exprimieren der L-Xylulose - Produktion durch die gekoppelte Reaktion in 1A gezeigt dargestellt zu steigern. Unter optimalen Bedingungen und mit einer Anfangskonzentration von 150 mM L-Arabinit, die maximale L-Xylulose-Ausbeute erreicht 96%, so dass dieses System viel effizienter als die in der Literatur berichtet. Die Strategie der whole-cell Immobilisierung wurde als nächstes verwendet, um die Wiederverwertbarkeit des gekoppelten biocatalyt verbessernic-System. Häufig verwendete Methoden für die Ganzzell - Immobilisierung umfassen Adsorption / kovalente feste Matrices Verknüpfung Vernetzung / Mitreißen und Verkapselung in polymere Netzwerke 32. Unter diesen Ansätzen ist die am besten geeignete Methode zur Zellimmobilisierung Einkapselung in Calciumalginat-Kügelchen. Ihre milde Geliereigenschaften, inerte wässrigen Matrix und hoher Porosität helfen , die physiologischen Eigenschaften und Funktionalität der eingekapselten Biologicals 33 erhalten. Daher enthält das gekoppelte Biokatalysator System sowohl E. coli - Zellen HjLAD oder SpNox beherbergen , wurde in Calciumalginat Kügelchen immobilisiert auf mehrere Zyklen von L-Xylulose Produktion (Abbildung 2) .Die immobilisiert Biokatalysator System zeigte eine gute Betriebsstabilität, die Aufrechterhaltung 65% der Umwandlungsausbeute des ersten Zyklus nach 7 Zyklen ermöglichen sukzessive Wiederverwendung, während das freie Zellsystem fast vollständig seine katalytische Aktivität verloren.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="801">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">LB broth&#160;</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">L3022-6X1KG</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Kanamycin</td>
			<td style="width:200px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP906-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Isopropyl &#946;-D-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">I6758-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Tris base</td>
			<td style="width:200px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP1521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">B-Nicotinamide adenine dinucleotide hydrate</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">N7004-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">L-Arabinitol</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A3506-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">L-Cysteine</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">168149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Sulfuric acid</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">320501-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Carbazole</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C5132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Ethanol&#160;</td>
			<td style="width:200px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP2818-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Sodium alginate</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">W201502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Calcium chloride dihydrate</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">223506-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Excella E24 shaker incubator</td>
			<td style="width:200px;">New Brunswick Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Cary 60 UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td style="width:200px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Centrifuge 5810R</td>
			<td style="width:200px;">Eppendrof</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Beakers</td>
			<td style="width:200px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Syringe</td>
			<td style="width:200px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Needle</td>
			<td style="width:200px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:315px;">Pioneer Analytical and Precision Weighing Balance</td>
			<td style="width:200px;">Ohaus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immobilization of multi-biocatalysts in alginate beads for cofactor regeneration and improved reusability

Wir haben vor kurzem eine einfache, wiederverwendbare und gekoppelt whole-cell biokatalytischen System mit der Fähigkeit zur Cofaktor-Regenerierung und Biokatalysator Immobilisierung für eine verbesserte Produktionsausbeute und anhalt Synthese. Beschrieben hiermit ist das experimentelle Verfahren für die Entwicklung eines solchen Systems , bestehend aus zwei E. coli - Stämme , die funktionell komplementäre Enzyme exprimieren. Zusammen können diese beiden Enzyme wirken kooperativ die Regeneration von teuren Cofaktoren für die Verbesserung der Produktausbeute der Bioreaktion zu vermitteln. Darüber hinaus wird berichtet, das Verfahren zur Herstellung einer immobilisierten Form des gekoppelten Systems biokatalytischen durch Einkapselung von ganzen Zellen in Calciumalginat-Kügelchen synthetisiert wird. Als Beispiel stellen wir die verbesserte Biosynthese von L-Xylulose aus L-arabinitol durch E. Kupplung coli - Zellen , die die Enzyme L-Arabinit - Dehydrogenase oder NADH - Oxidase exprimiert. Unter optimalen Bedingungen und mit einer Anfangskonzentration von 150mM L-Arabinit, die maximale L-Xylulose-Ausbeute erreichte 96%, was in der Literatur berichtet höher als jene ist. Die immobilisierte Form der gekoppelten Ganzzellbiokatalysatoren zeigte eine gute Betriebsstabilität, 65% der im ersten Zyklus nach 7 Zyklen von aufeinanderfolgenden Wiederverwertung erhalten Ausbeute aufrechterhalten wird, während das freie Zellsystem fast vollständig die katalytische Aktivität verloren. Daher sind die hier beschriebenen Verfahren liefert zwei Strategien, die die industrielle Produktion von L-Xylulose verbessern helfen könnten, sowie andere Mehrwert-Verbindungen, die die Verwendung von Co-Faktoren in der Regel erforderlich ist.

Damit wurde Cofactorregenerierung, L-Xylulose - Synthese durchgeführt in einer gekoppelten whole-cell biokatalytische System enthält E. coli HjLAD und E. coli SpNox Zellen. Nach der Optimierung der verschiedenen Parameter wurde die Wiederverwendbarkeit dieses Systems verbessert , indem es in Calciumalginat - Kügelchen zu immobilisieren (Abbildung 2). ...

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Immobilization of Multi-biocatalysts in Alginate Beads for Cofactor Regeneration and Improved Reusability

Dargestellt ist das Protokoll für die Co-immobilisierenden Ganzzellbiokatalysatoren für Cofactorregenerierung und eine verbesserte Wiederverwertbarkeit, mit der Produktion von L-Xylulose als Beispiel. Die Cofactorregenerierung wird durch Kopplung von zwei Escherichia coli - Stämme exprimieren funktionell komplementären Enzymen erreicht; die Ganzzellbiokatalysator Immobilisierung durch Zellverkapselung in Calciumalginatperlen erreicht.

Immobilisierung von Multi-Biokatalysatoren in Alginatbeads für Kofaktorregenerierung und verbesserte Reusability

We have recently developed a simple, reusable and coupled whole-cell biocatalytic system with the capability of cofactor regeneration and biocatalyst ...

Research

JoVE Journal

Chemistry

Improved In-gel Reductive &#946;-Elimination for Comprehensive O-linked and Sulfo-glycomics by Mass Spectrometry

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Verbesserte In-Gel-reduktive β-Elimination für umfassende O-gebundene und Sulfo-Glykomik durch Massenspektrometrie

Separation of proteins by SDS-PAGE followed by in-gel proteolytic digestion of resolved protein bands has produced high-resolution proteomic analysis of ...

Forschung

Chemie

Microbubble Fabrication of Concave-porosity PDMS Beads

Mikroblasen Herstellung von Konkav-Porosität PDMS Beads

Microbubble fabrication (by use of a fine emulsion) provides a means of increasing the surface-area-to-volume (SAV) ratio of polymer materials, which is ...

Improved Heterojunction Quality in Cu2O-based Solar Cells Through the Optimization of Atmospheric Pressure Spatial Atomic Layer Deposited Zn1-xMgxO

Improved Heterojunction Quality in Cu2O-based Solar Cells Through the Optimization of Atmospheric Pressure Spatial Atomic Layer Deposited Zn1-xMgxO

Verbesserte Qualität Hetero in Cu<sub&gt; 2</subSolarzellen durch die Optimierung der Atmosphärendruck Spatial Atomic Layer&gt; O-basierte Hinterlegt<br /&gt; Zn<sub&gt; 1-x</sub&gt; Mg<sub&gt; x</sub&gt; O

Atmospheric pressure spatial atomic layer deposition (AP-SALD) was used to deposit n-type ZnO and Zn1-xMgxO thin films onto p-type thermally oxidized Cu2O ...

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Synthese von Protein Biokonjugate<em&gt; über</em&gt; Cystein-maleimid Chemie

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

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