Name: immobilization of multi-biocatalysts in alginate beads for cofactor regeneration and improved reusability
Uploaded: 2016-04-22T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immobilization of Multi-biocatalysts in Alginate Beads for Cofactor Regeneration and Improved Reusability at JoVE.com

מחקר זה מומן על ידי תוכנית המחקר למדע בסיסי באמצעות קרן המחקר הלאומית של קוריאה (NRF) במימון משרד החינוך, המדע והטכנולוגיה (NRF-2013R1A1A2012159 ו NRF-2013R1A1A2007561), Konkuk האוניברסיטה, המחלקה להנדסה כימית MCubed תוכנית באוניברסיטת מישיגן.

1. Whole-cell biocatalysts הכנה הערה: א רקומביננטי קולי תאים מחסה pET28a- SpNox 31 או pET28a- HjLAD 28 להלן מכונים E. coli SpNox וא coli HjLAD, בהתאמה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן מושבה אחת של E. coli</...

פיתוחים טכנולוגיים אחרונים אפשרו התפרצות של המסחור של Biotherapeutics רקומביננטי, וכתוצאה מכך עלייה הדרגתית בשווי השוק שלהן בתעשיית הביוטכנולוגיה. קידום אחת כזו הוא כניסתו של הנדסת מטבולית מיקרואורגניזמים רקומביננטי, אשר הוכיחה הבטחה גדולה בהקמת 38 מערכות תעשייתיות...

Biotransformation כל תא רדוקטיבי באמצעות מיקרואורגניזמים הפך שיטה נפוצה לסינתזת האנזימטית הכימותרפיה של ביומולקולות בעלי חשיבות המסחרית טיפולי 1 - 3. היא מציגה מספר יתרונות על פני השימוש של אנזימים מבודדים, בעיקר החיסול של תהליכי טיהור במורד זרם עתיר עלות לבין ההפגנה של חיים מורחבים 4 - 7. לקבלת מסלולים biocatalytic שבו קו-פקטורים נדרשים ליצירת מוצר, מערכות תא כולו יש פוטנציאל לספק בהתחדשות פקטור באתרו באמצעות התוספת של 5,8,9 שיתוף מצעים לתרום אלקטרונים זולים. עם זאת, היכולת הזו היא פחתה לתגובות הדורשות ריכוז stoichiometric של מצעי שיתוף נדירים או יקרים 10 - 13. יחד עם שימוש חוזר עני של תאים שלמים, זה מקשה על הקמת produ מדרגי הרציףמערכת ction. שינויים אסטרטגיים של מערכות שלמות תאים עבור biotransformations פקטור תלויי אלה נדרשים להתגבר על המגבלות הנ&quot;ל. באופן ספציפי, שילוב של biocatalysts כל התא שפועלים בשיתוף פעולה הוכח באופן משמעותי כדי לשפר את הפרודוקטיביות ואת היציבות של האנזימים טפחו 14. גורמים אלו, אשר לעתים קריטיים המאפשרים ייצור בקנה מידה הגדולה של מוצרים בכמות מסחרית, יכולים להיות מותאמים יותר על ידי חיידקי biocatalytic משתק שיתוף 15. פיתחנו לאחרונה מערכת biocatalytic פשוט לשימוש חוזר כל תא המאפשר גם התחדשות פקטור וקיבוע biocatalyst לייצור L-xylulose 16. במחקר זה, מערכת זו נוצלה כדוגמה כדי להמחיש את הפרוצדורות של במסגרתו קיימות שתי אסטרטגיות אלה תשואה ייצור biotransformation משופרת ויכולת השימוש החוזר biocatalyst. L-xylulose שייך CLAss של מולקולות ביולוגיות שימושיות בשם סוכרים נדירים. סוכרים נדירים הם מונוסכרידים ייחודיים או נגזרי סוכר המתרחשים לעתים נדירות מאוד בטבע, אבל לשחק תפקידים מכריעים כאלמנטי הכרה במולקולות ביו 17,18. יש להם מגוון של יישומים החל ממתיקים, מזון פונקציונלי ל -19 רפויות פוטנציאלי. L-xylulose יכול לשמש מעכב פוטנציאל של α-glucosidases המרובה, עשוי לשמש גם כאינדיקטור של שחמת כבד או דלקת כבד 17,20. המרה יעילות גבוהה של קסיליטול כדי L-xylulose במערכות כל תא דווחה בעבר Pantoea ananatis 21,22, Alcaligenes sp. 23 701B, pallidus Bacillus 24,25 Y25 ו Escherichia coli 26. בתוך א &#39; coli, לעומת זאת, הושג אותו באמצעות נמוכים בלבד (&lt;67 מ&quot;מ) ריכוזים קסיליטול 26 בשל השפעתו מעכבת פוטנציאל של ריכוז קסיליטול ראשוני גבוה יותר מ 100 מ&quot;מ על פעילות קסיליטול-4-דהידרוגנז 21,26. שיווי המשקל התרמודינמי בין xylulose ו קסיליטול הוכח בחום להעדיף היווצרות של קסיליטול 25,27. בנוסף, תשואת xylulose מוגבלת על ידי הכמות של קו-פקטורים יקרים כי צריך להיות מסופקים בהעדר במערכת התחדשות הפקטור באתרו. יחד, גורמים אלה מצמצמים את פוטנציאל ההתרחבות לתוך מערכות קיימא עבור ביוסינתזה L-xylulose. כדי להתגבר על המגבלות האלה ולשפר את תשואת biotransformation L-xylulose, האסטרטגיה של התחדשות פקטור הועסקה לראשונה על ידי הקמת מערך biocatalytic כל תא מצמיד. באופן ספציפי, L-Arabinitol 4-dehydrogenase (EC 1.1.1.12) מ Hypocrea jecorina (HjLAD), אנזים במסלול קטבולי L-arabinose של פטריות, נבחרה לזרז את ההמרה של L-arabinitol לתוך L-xylulose 28,29 . כמו אנזימי biosynthetic רבים, limitatio גדולהn של HjLAD הוא שזה דורש כמות stoichiometric של פקטור אדנין dinucleotide nicotinamide היקר (NAD +, בצורת החמצון של NADH) לבצע המרה זו. מונואמין מצאו NADH ב pyogenes סטרפטוקוקוס (SpNox) הוכח להציג-התחדשות-פקטור גבוה פעילות 30,31. ניצול של תכונה זו של SpNox, E. קולי תאים המבטאים HjLAD לייצור-xylulose L היו מצמידים עם E. קולי תאי מבטאי SpNox להתחדשות של NAD + כדי להגביר את ייצור L-xylulose מתואר על ידי התגובה המצמידה מוצגת באיור 1 א. בתנאים אופטימליים ושימוש בריכוז ההתחלתי של 150 מ&quot;מ L- arabinitol, התשואה L-xylulose מקסימלי הגיעו 96%, מה שהופך את המערכת הרבה יותר יעיל מאלו שדווחו בספרות. האסטרטגיה של חוסר תנועה כל התא הועסקה הבאה לשפר עוד יותר את השימוש החוזר של biocatalyt מצמידמערכת IC. בדרך כלל שיטות המשמשות וקיבוע כל תא כוללות ספיחה / קוולנטיים מקשרים מטריצות מוצקות, cross-linking / מלכוד אנקפסולציה ברשתות פולימריים 32. בין גישות אלה, בשיטה המתאימה ביותר עבור קיבוע התא הוא אנקפסולציה בחרוזים אלגינט סידן. נכסי gelation הקלים שלהם, מטריקס מימית אינרטי נקבובית גבוה לעזור לשמר את המאפיינים פיסיולוגיים ופונקציונלית של הביולוגיות במארז 33. לכן, מערכת biocatalyst מצמידים המכילה הוא E. קולי תאים מחסה HjLAD או SpNox היה משותק חרוזים אלגינט סידן לאפשר מחזורים רבים של ייצור L-xylulose (איור 2) .the מערכת biocatalyst משותקת הפגינו יציבות תפעולית טובה, שמירה 65% מהתשואה המרה של המחזור הראשון אחרי 7 מחזורים של שימוש חוזר רצוף, בעוד מערכת תא חינם כמעט לחלוטין אבדה הפעילות הקטליטית שלו.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="801">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">LB broth&#160;</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">L3022-6X1KG</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Kanamycin</td>
			<td style="width:200px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP906-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Isopropyl &#946;-D-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">I6758-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Tris base</td>
			<td style="width:200px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP1521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">B-Nicotinamide adenine dinucleotide hydrate</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">N7004-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">L-Arabinitol</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A3506-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">L-Cysteine</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">168149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Sulfuric acid</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">320501-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Carbazole</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C5132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Ethanol&#160;</td>
			<td style="width:200px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP2818-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Sodium alginate</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">W201502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Calcium chloride dihydrate</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">223506-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Excella E24 shaker incubator</td>
			<td style="width:200px;">New Brunswick Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Cary 60 UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td style="width:200px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Centrifuge 5810R</td>
			<td style="width:200px;">Eppendrof</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Beakers</td>
			<td style="width:200px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Syringe</td>
			<td style="width:200px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Needle</td>
			<td style="width:200px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:315px;">Pioneer Analytical and Precision Weighing Balance</td>
			<td style="width:200px;">Ohaus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immobilization of multi-biocatalysts in alginate beads for cofactor regeneration and improved reusability

פתחנו לאחרונה מערכת biocatalytic פשוט, לשימוש חוזר ו מצמידה כל תא עם יכולת התחדשות פקטור וקיבוע biocatalyst תשואת ייצור משופרת וסינתזה מתמשכת. בזאת הוא תאר את הליך הניסויים לפיתוח של מערכת כזו מורכב משני E. קולי זני המבטאים אנזימים משלימים מבחינה תפקודית. יחד, שני אנזימים אלה יכולים לתפקד שיתוף ניתוח לתווך ההתחדשות של קו-פקטורים יקרים לשיפור תפוקת התוצר של bioreaction. בנוסף, השיטה של ​​סינתזת צורה משותקת של מערכת biocatalytic מצמידה ידי אנקפסולציה של תאים שלמים בחרוזי אלגינט סידן מדווחת. כדוגמא, אנו מציגים את ביוסינתזה המשופרת של L-xylulose מ L-arabinitol ידי צימוד E. קולי תאים המבטאים את האנזימים dehydrogenase L-arabinitol או מונואמין NADH. בתנאים אופטימליים ושימוש בריכוז ההתחלתי של 150המ&quot;מ L- arabinitol, תשואת L-xylulose המקסימאלי הגיעה 96%, שהוא גבוה יותר מאשר אלו המדווחים בספרות. הצורה המשותקת של biocatalysts כל תא המצמידים הפגינה יציבות תפעולית טובה, שמירת 65% מהתשואה שהושגה במחזור הראשון אחרי 7 מחזורים של שימוש חוזר רצוף, בעוד מערכת תא חינם כמעט לחלוטין אבדה את הפעילות הקטליטית. לכן, שיטות דיווח כאן מספק שתי אסטרטגיות שיכול לעזור לשפר את הייצור התעשייתי של L-xylulose, וכן תרכובות ערך מוסף אחרים המחייבים את השימוש קו-פקטורים בכלל.

כדי לאפשר התחדשות פקטור, סינתזת L-xylulose בוצעה במערכת biocatalytic כל תא מצמידים המכילה E. coli HjLAD וא תאי SpNox coli. בעקבות אופטימיזציה של פרמטרים שונים, השימוש החוזר של מערכת זו שופר על ידי משתק אותו חרוזי אלגינט סידן (איור ...

Watch this Scientific Journal Video about Immobilization of Multi-biocatalysts in Alginate Beads for Cofactor Regeneration and Improved Reusability at JoVE.com

Immobilization of Multi-biocatalysts in Alginate Beads for Cofactor Regeneration and Improved Reusability

מוצג פרוטוקול biocatalysts כל תא שיתוף משתק להתחדשות פקטור ויכולת שימוש חוזרת משופר, באמצעות הייצור של L-xylulose כדוגמא. התחדשות פקטור מושגת על ידי צימוד שני זני Escherichia coli להביע אנזימים משלימים מבחינה תפקודית; וקיבוע biocatalyst כל תא מושגת על ידי אנקפסולציה תא חרוזים אלגינט סידן.

קיבוע של biocatalysts רב בחרוזים אלגינט עבור פקטור רגנרציה Reusability משופר

We have recently developed a simple, reusable and coupled whole-cell biocatalytic system with the capability of cofactor regeneration and biocatalyst ...

Research

JoVE Journal

Chemistry

Improved In-gel Reductive &#946;-Elimination for Comprehensive O-linked and Sulfo-glycomics by Mass Spectrometry

Improved In-gel Reductive ÃƒÅ½Ã‚Â²-Elimination for Comprehensive O-linked and Sulfo-glycomics by Mass Spectrometry

השתפר בג&#39;ל Sulfo-glycomics β-ביעור עבור מקיף O צמוד וReductive ידי ספקטרומטריית מסה

Separation of proteins by SDS-PAGE followed by in-gel proteolytic digestion of resolved protein bands has produced high-resolution proteomic analysis of ...

Microbubble Fabrication of Concave-porosity PDMS Beads

ייצור Microbubble של חרוזים PDMS קעור-נקבוביות

Microbubble fabrication (by use of a fine emulsion) provides a means of increasing the surface-area-to-volume (SAV) ratio of polymer materials, which is ...

Improved Heterojunction Quality in Cu2O-based Solar Cells Through the Optimization of Atmospheric Pressure Spatial Atomic Layer Deposited Zn1-xMgxO

Improved Heterojunction Quality in Cu2O-based Solar Cells Through the Optimization of Atmospheric Pressure Spatial Atomic Layer Deposited Zn1-xMgxO

איכות heterojunction משופר ב Cu<sub&gt; 2</sub&gt; O מבוסס תאים סולריים באמצעות אופטימיזציה של לחץ האטמוספרה אטומי שכבת מרחבים שהופקדה<br /&gt; Zn<sub&gt; 1-x</sub&gt; Mg<sub&gt; x</sub&gt; O

Atmospheric pressure spatial atomic layer deposition (AP-SALD) was used to deposit n-type ZnO and Zn1-xMgxO thin films onto p-type thermally oxidized Cu2O ...

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

סינתזה של חלבון Bioconjugates<em&gt; דרך</em&gt; כימיה ציסטאין-maleimide

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

Surface Functionalization of Metal-Organic Frameworks for Improved Moisture Resistance

Functionalization פני השטח של מסגרות מתכת-אורגנית להתנגדות לחות משופר

Metal-organic frameworks (MOFs) are a class of porous inorganic materials with promising properties in gas storage and separation, catalysis and sensing. ...

Bio-inspired Polydopamine Surface Modification of Nanodiamonds and Its Reduction of Silver Nanoparticles

שינוי בהשראה ביו השטח Polydopamine של Nanodiamonds והצמצום שלה של סילבר חלקיקים

Surface functionalization of nanodiamonds (NDs) is still challenging due to the diversity of functional groups on the ND surfaces. Here, we demonstrate a ...

Preparation of Poly(pentafluorophenyl acrylate) Functionalized SiO2 Beads for Protein Purification

Preparation of Polypentafluorophenyl acrylate Functionalized SiO2 Beads for Protein Purification

הכנת חרוזים2 Poly(pentafluorophenyl acrylate) Functionalized SiO לטיהור חלבון

We demonstrate a simple method to prepare poly(pentafluorophenyl acrylate) (poly(PFPA)) grafted silica beads for antibody immobilization and subsequent ...

Trimethylamine Detection in Animal-Derived Medicine by Headspace GC-MS

An Improved Technique for Trimethylamine Detection in Animal-Derived Medicine by Headspace Gas Chromatography-Tandem Quadrupole Mass Spectrometry

An Improved Technique for Trimethylamine Detection in Animal-Derived Medicine by Headspace Gas Chromatography-Tandem Quadrupole Mass Spectrometry (Video) | JoVE 

Animal-derived medicines have distinctive characteristics and significant curative effects, but most of them have an obvious fishy odor, resulting in the ...

Porphyrin-Modified Beads in Flow Cytometry

Porphyrin-Modified Beads for Use as Compensation Controls in Flow Cytometry

Porphyrin-Modified Beads for Use as Compensation Controls in Flow Cytometry (Video) | JoVE 

חרוזים מהונדסים בפורפירין לשימוש כבקרות פיצוי בציטומטריית זרימה

Flow cytometry can rapidly characterize and quantify diverse cell populations based on fluorescence measurements. The cells are first stained with one or ...

Combining Amine-Functionalized Polystyrene Beads with TCPP Solution

Combining Amine-Functionalized Polystyrene Beads with TCPP Solution (Video) | JoVE 

שילוב חרוזי פוליסטירן פונקציונליים עם פתרון TCPP