Name: immobilization of multi-biocatalysts in alginate beads for cofactor regeneration and improved reusability
Uploaded: 2016-04-22T15:00:00
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Questa ricerca è stata sostenuta dal Programma di ricerca di scienza di base attraverso il National Research Foundation di Corea (NRF) finanziato dal Ministero dell&#39;Istruzione, della Scienza e della Tecnologia (NRF-2013R1A1A2012159 e NRF-2013R1A1A2007561), Konkuk University e il Dipartimento di Ingegneria Chimica e mCubed Program presso l&#39;Università del Michigan.

1. Whole-cell biocatalizzatori Preparazione NOTA: Il ricombinante E. coli che ospitano pET28a- SpNox 31 o pET28a- HjLAD 28 sono di seguito indicati come E. coli SpNox ed E. coli HjLAD rispettivamente. <ol><li> Inoculare una singola colonia di E. coli HjLAD in 3 ml di Luria-Bertani (LB) medium supplementato con kanamicina (50 ug / ml) e incubare in un incubatore shaker O / N a 37 ° C...

I recenti progressi tecnologici hanno permesso un aumento nella commercializzazione di bioterapie ricombinanti, con un conseguente aumento graduale nel loro valore di mercato nel settore della biotecnologia. Un tale progresso è l&#39;avvento dell&#39;ingegneria metabolica nei microrganismi ricombinanti, che ha mostrato una grande promessa nella creazione di sistemi industriali scalabili 38. Come con la maggior parte dei processi, il successo della commercializzazione di biomolecole ricombinanti prodotte da m...

Riduttiva biotrasformazione cellula intera utilizzando microrganismi è diventato un metodo molto diffuso per la sintesi chemo-enzimatica di vista commerciale che terapeutico biomolecole importanti 1 - 3. Esso presenta diversi vantaggi rispetto all&#39;uso di enzimi isolati, in particolare l&#39;eliminazione dei processi di purificazione a valle costose e la dimostrazione di una maggiore durata 4 - 7. Per i percorsi biocatalitici in cui sono richiesti cofattori per la formazione del prodotto, sistemi di cellule intere hanno il potenziale di fornire la rigenerazione del cofattore situ tramite l&#39;aggiunta di poco costoso donatori di elettroni co-substrati 5,8,9. Tuttavia, questa capacità è diminuita per le reazioni che richiedono una concentrazione stechiometrica di rare o costose co-substrati 10 - 13. Insieme con scarsa riutilizzabilità di cellule intere, questo impedisce la creazione di un produ scalabile e continuoSistema ction. sono richieste modifiche strategica dei sistemi di cellule intere per queste biotrasformazioni cofattore-dipendente di superare i limiti di cui sopra. In particolare, la combinazione di biocatalizzatori cellule intere che lavorano insieme hanno dimostrato di migliorare notevolmente la produttività e la stabilità degli enzimi nutriti 14. Questi fattori, che sono spesso critici per consentire la produzione su larga scala di prodotti commercialmente validi, possono essere ottimizzati ulteriormente da microbi biocatalitici co-immobilizzare 15. Abbiamo recentemente sviluppato un sistema biocatalitico cellula intera semplice e riutilizzabile che consente sia la rigenerazione del cofattore e biocatalizzatore immobilizzazione per la produzione di L-xilulosio 16. In questo studio, questo sistema è stato utilizzato come esempio per illustrare le procedure sperimentali di applicazione di queste due strategie per una migliore resa produttiva biotrasformazione e biocatalizzatore riutilizzabilità. L-xilulosio appartiene ad una classiss di molecole biologicamente utili denominato zuccheri rare. Zuccheri rare sono monosaccaridi unici o derivati ​​di zucchero che si verificano molto raramente in natura, ma giocano un ruolo cruciale come elementi di riconoscimento di molecole bioattive 17,18. Hanno una varietà di applicazioni che vanno da dolcificanti, alimenti funzionali a potenziali terapie 19. L-xilulosio può essere utilizzato come potenziale inibitore di più alfa-glucosidasi, e può anche essere utilizzato come indicatore di epatite o cirrosi epatica 17,20. Conversione Alta efficienza di xilitolo a L-xylulose nei sistemi di cellule intere stato segnalato in precedenza in Pantoea ananatis 21,22, Alcaligenes sp. 701B 23, Bacillus pallido Y25 24,25 ed Escherichia coli 26. In E. coli, tuttavia, è stato raggiunto solo usando (&lt;67 mM) basse concentrazioni di xilitolo 26 a causa di potenziali effetti inibitori di una concentrazione iniziale xilitolo superiori all&#39;100 mm su attività xilitolo-4-deidrogenasi 21,26. L&#39;equilibrio termodinamico tra xylulose e xilitolo ha dimostrato di favorire fortemente la formazione di xilitolo 25,27. Inoltre, la resa xylulose è limitata dalla quantità di cofattori costosi che devono essere fornite in assenza di un sistema di rigenerazione cofattore situ. Insieme, questi fattori limitano la possibilità di scalare in sistemi sostenibili per la biosintesi L-xylulose. Per superare queste limitazioni e migliorare la resa biotrasformazione L-xylulose, la strategia di rigenerazione del cofattore è stato impiegato dapprima attraverso la definizione di un sistema di biocatalitico cellula intera accoppiato. Specificamente, L-Arabinitol 4-deidrogenasi (EC 1.1.1.12) da Hypocrea jecorina (HjLAD), un enzima del catabolismo L-arabinosio di funghi, è stato selezionato per catalizzare la conversione di L-arabinitol in L-xilulosio 28,29 . Come molti enzimi biosintetici, un importante limitation di HjLAD è che richiede una quantità stechiometrica del costoso nicotinamide adenina dinucleotide cofattore (NAD +, la forma ossidata di NADH) per eseguire questa conversione. NADH ossidasi trovato in Streptococcus pyogenes (SpNox) ha dimostrato di visualizzare l&#39;attività di alta cofattore-rigenerazione 30,31. Approfittando di questo attributo di SpNox, E. coli che esprimono HjLAD per la produzione di L-xilulosio stati accoppiati con E. coli che esprimono SpNox per la rigenerazione di NAD + per aumentare la produzione di L-xilulosio rappresentato dalla reazione accoppiata mostrato nella Figura 1A. In condizioni ottimali e con una concentrazione iniziale di 150 mM L-arabinitol, il massimo rendimento L-xilulosio raggiunto 96%, rendendo questo sistema molto più efficiente di quelli riportati in letteratura. La strategia di immobilizzazione a cellule intere è stato impiegato vicino per migliorare ulteriormente la riusabilità del biocatalyt accoppiatosistema IC. Metodi comunemente usati per l&#39;immobilizzazione a cellula intera includono adsorbimento / covalente collegamento a matrici solide, cross-linking / intrappolamento e l&#39;incapsulamento nelle reti polimeriche 32. Tra questi approcci, il metodo più adatto per l&#39;immobilizzazione di cellule è incapsulamento in perle di alginato di calcio. Le loro proprietà di gelificazione mite, matrice acquosa inerte e ad alta porosità aiutare a preservare le proprietà fisiologiche e le funzionalità dei prodotti biologici incapsulati 33. Pertanto, il sistema biocatalizzatore accoppiato contenente sia E. coli che ospitano HjLAD o SpNox è stato immobilizzato in perline di alginato di calcio per consentire a più cicli di produzione L-xilulosio (Figura 2) .Il sistema biocatalizzatore immobilizzato dimostrato una buona stabilità operativa, mantenendo il 65% della resa di conversione del primo ciclo dopo 7 cicli di successivo riutilizzo, mentre il sistema cella libera quasi completamente perso la sua attività catalitica.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="801">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">LB broth&#160;</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">L3022-6X1KG</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Kanamycin</td>
			<td style="width:200px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP906-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Isopropyl &#946;-D-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">I6758-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Tris base</td>
			<td style="width:200px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP1521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">B-Nicotinamide adenine dinucleotide hydrate</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">N7004-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">L-Arabinitol</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A3506-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">L-Cysteine</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">168149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Sulfuric acid</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">320501-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Carbazole</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C5132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Ethanol&#160;</td>
			<td style="width:200px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP2818-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Sodium alginate</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">W201502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Calcium chloride dihydrate</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">223506-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Excella E24 shaker incubator</td>
			<td style="width:200px;">New Brunswick Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Cary 60 UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td style="width:200px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Centrifuge 5810R</td>
			<td style="width:200px;">Eppendrof</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Beakers</td>
			<td style="width:200px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Syringe</td>
			<td style="width:200px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Needle</td>
			<td style="width:200px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:315px;">Pioneer Analytical and Precision Weighing Balance</td>
			<td style="width:200px;">Ohaus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immobilization of multi-biocatalysts in alginate beads for cofactor regeneration and improved reusability

Abbiamo recentemente sviluppato un sistema semplice, riutilizzabile ed accoppiato biocatalitico whole-cell con la capacità di rigenerazione del cofattore e biocatalizzatore immobilizzazione per una migliore resa produttiva e sintesi sostenuta. Qui descritta è la procedura sperimentale per lo sviluppo di un sistema costituito da due E. ceppi coli che esprimono gli enzimi funzionalmente complementari. Insieme, questi due enzimi possono funzionare co-operativamente per mediare la rigenerazione di cofattori costosi per migliorare la resa del prodotto del bioreaction. Inoltre, è riportato il metodo di sintetizzare una forma immobilizzata del sistema biocatalitico accoppiato per incapsulamento di cellule intere in perline di alginato di calcio. Come esempio, presentiamo i migliorata biosintesi di L-xilulosio da L-arabinitol accoppiando E. coli che esprimono gli enzimi L-arabinitol deidrogenasi o NADH ossidasi. In condizioni ottimali tramite una concentrazione iniziale di 150mM L-arabinitol, il massimo rendimento L-xilulosio raggiunto 96%, che è superiore a quelli riportati in letteratura. La forma immobilizzata dei biocatalizzatori cellule intere accoppiati dimostrato una buona stabilità operativa, mantenendo il 65% della resa ottenuto nel primo ciclo dopo 7 cicli di successive riutilizzo, mentre il sistema cella libera perso quasi completamente l&#39;attività catalitica. Pertanto, i metodi qui riportati fornisce due strategie che potrebbero favorire la produzione industriale di L-xilulosio, così come altri composti a valore aggiunto che richiedono l&#39;uso di cofattori in generale.

Per attivare la rigenerazione del cofattore, sintesi L-xilulosio è stata effettuata in un sistema biocatalitico cellula intera accoppiato contenente E. coli HjLAD ed E. cellule coli SpNox. Dopo l&#39;ottimizzazione dei vari parametri, la riutilizzabilità di questo sistema è stato migliorato immobilizzando in perline di alginato di calcio (Figura 2). <p class="jove_content" fo:keep-together.within-p...

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Immobilization of Multi-biocatalysts in Alginate Beads for Cofactor Regeneration and Improved Reusability

Presentato è il protocollo per biocatalizzatori cellule intere co-immobilizzazione per la rigenerazione del cofattore perfezionata riutilizzabilità, utilizzando la produzione di L-xilulosio come esempio. La rigenerazione cofattore è ottenuta accoppiando due ceppi di Escherichia coli che esprimono gli enzimi funzionalmente complementari; il biocatalizzatore immobilizzazione whole-cell si ottiene incapsulamento delle cellule in perline alginato di calcio.

L&#39;immobilizzazione di Multi-biocatalizzatori in perline alginato per cofattore Rigenerazione e migliorata Riusabilità

We have recently developed a simple, reusable and coupled whole-cell biocatalytic system with the capability of cofactor regeneration and biocatalyst ...

Research

JoVE Journal

Chemistry

Improved In-gel Reductive &#946;-Elimination for Comprehensive O-linked and Sulfo-glycomics by Mass Spectrometry

Improved In-gel Reductive ÃƒÅ½Ã‚Â²-Elimination for Comprehensive O-linked and Sulfo-glycomics by Mass Spectrometry

Miglioramento in gel riduttive solfo-glycomics β-eliminazione completa per O-linked e di spettrometria di massa

Separation of proteins by SDS-PAGE followed by in-gel proteolytic digestion of resolved protein bands has produced high-resolution proteomic analysis of ...

Ricerca

Chimica

Microbubble Fabrication of Concave-porosity PDMS Beads

Fabbricazione microbolle di Perline PDMS Concavo-porosità

Microbubble fabrication (by use of a fine emulsion) provides a means of increasing the surface-area-to-volume (SAV) ratio of polymer materials, which is ...

Improved Heterojunction Quality in Cu2O-based Solar Cells Through the Optimization of Atmospheric Pressure Spatial Atomic Layer Deposited Zn1-xMgxO

Improved Heterojunction Quality in Cu2O-based Solar Cells Through the Optimization of Atmospheric Pressure Spatial Atomic Layer Deposited Zn1-xMgxO

Qualità Heterojunction migliorata in Cu<sub&gt; 2</sub&gt; O basati su celle solari attraverso l&#39;ottimizzazione della pressione atmosferica spaziale atomica strato depositato<br /&gt; Zn<sub&gt; 1-x</sub&gt; Mg<sub&gt; x</sub&gt; O

Atmospheric pressure spatial atomic layer deposition (AP-SALD) was used to deposit n-type ZnO and Zn1-xMgxO thin films onto p-type thermally oxidized Cu2O ...

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Sintesi di proteine ​​bioconiugati<em&gt; via</em&gt; Chimica cisteina-maleimmide

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

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Metal-organic frameworks (MOFs) are a class of porous inorganic materials with promising properties in gas storage and separation, catalysis and sensing. ...

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Modifica di bio-ispirati Polydopamine superficie di nanodiamanti e sua riduzione delle nanoparticelle d'argento

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