Name: immobilization of multi-biocatalysts in alginate beads for cofactor regeneration and improved reusability
Uploaded: 2016-04-22T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immobilization of Multi-biocatalysts in Alginate Beads for Cofactor Regeneration and Improved Reusability at JoVE.com

Denne forskningen ble støttet av Basic Science Research Program gjennom National Research Foundation of Korea (NRF) finansiert av departementet for utdanning, vitenskap og teknologi (NRF-2013R1A1A2012159 og NRF-2013R1A1A2007561), Konkuk University, og Institutt for kjemisk prosessteknologi og mCubed program ved University of Michigan.

1. Hel-celle Biocatalysts Forberedelse MERK: rekombinant E. coli-celler som pET28a- SpNox 31 eller pET28a- HjLAD 28 blir heretter referert til som E. coli SpNox og E. coli HjLAD hhv. <ol><li> Vaksinere en enkelt koloni av E. coli HjLAD i 3 ml Luria-Bertani (LB) medium supplementert med kanamycin (50 ug / ml) og inkuberes i en risteinkubator O / N ved 37 ° C, 250 rpm. </li><li> Forty...

Nyere teknologiske fremskritt har aktivert en bølge i kommersialisering av rekombinante biotherapeutics, noe som resulterer i en gradvis økning i markedsverdi i bioteknologisk industri. En slik utvikling er det advent av metabolsk ingeniør i rekombinante mikroorganismer, som har vist et stort løfte i å etablere skalerbare industrielle systemer 38. Som med de fleste prosesser, er det en vellykket kommersialisering av rekombinante biomolekyler som er produsert av genetisk modifiserte mikroorganismer svært...

Reduktiv hel-celle biotransformasjon ved hjelp av mikroorganismer er blitt en utbredt metode for chemo-enzymatisk syntese av kommersielt og terapeutisk viktige biomolekyler 1 - 3. Den presenterer flere fordeler i forhold til bruken av isolerte enzymer, spesielt eliminering av kostnadskrevende nedstrøms renseprosesser, og påvisning av forlenget levetid 4 - 7. For biokatalytiske veier hvor kofaktorer som er nødvendige for produktdannelse, hel-celle-systemer har potensial til å gi in situ kofaktor regenerering ved tilsetning av billige elektrondonerende ko-substrater 5,8,9. Imidlertid er denne kapasiteten redusert for reaksjoner som krever en støkiometrisk konsentrasjon av sjeldne eller kostbare ko-substrat 10 - 13. Sammen med dårlig gjenbruk av hele celler, hindrer dette etablering av en skalerbar og kontinuerlig proDette skjer system. Strategiske modifikasjoner av hel-celle-systemer for disse kofaktor-avhengige biotransformasjoner er nødvendig for å overvinne de ovennevnte begrensninger. Nærmere bestemt, er kombinasjonen av hel-celle-biokatalysatorer som samarbeider har vist seg å betydelig forbedre produktivitet og stabilitet av de næret enzymene 14. Disse faktorene, som ofte er avgjørende for å muliggjøre storskala produksjon av kommersielt levedyktige produkter, kan optimaliseres ytterligere ved co-immobilisere biokatalytiske mikrober 15. Vi har nylig utviklet en enkel og gjenbruk hel-celle biokatalytisk system som gjør at både kofaktor regenerering og biocatalyst immobilisering for L-xylulose produksjon 16. I denne studien ble dette systemet brukt som et eksempel for å illustrere de eksperimentelle prosedyrer for å bruke disse to strategiene for økt biotransformasjon utbyttet og biocatalyst gjenbruk. L-xylulose tilhører en CLAss av biologisk nyttige molekyler kalt sjeldne sukker. Sjeldne sukker er unike monosakkarider eller sukkerderivater som skjer svært sjelden i naturen, men spille viktige roller som anerkjennelse elementer i bioaktive molekyler 17,18. De har en rekke bruksområder fra søtningsmidler, funksjonell mat til potensielle legemiddel 19. L-xylulose kan brukes som en potensiell inhibitor av flere a-glukosidaser, og kan også brukes som en indikator for hepatitt eller skrumplever 17,20. Høy virkningsgrad konvertering av xylitol til L-xylulose i hel-cellesystemer er blitt rapportert tidligere i Pantoea ananatis 21,22, Alcaligenes sp. 701B 23, Bacillus pallidus Y25 24,25 og Escherichia coli 26. I E. coli, ble det imidlertid oppnådd bare ved hjelp lav (&lt;67 mm) xylitol konsentrasjoner 26 på grunn av potensielle inhiberende virkninger av en initial xylitol konsentrasjon høyere enn 100 mm på xylitol-4-dehydrogenase aktivitet 21,26. Den termodynamiske likevekt mellom xylulose og xylitol har vist seg å sterkt favorisere dannelsen av xylitol 25,27. I tillegg er xylulose utbytte begrenset av mengden av dyre kofaktorer som må tilføres i fravær av en in situ-kofaktor regenerering system. Sammen utgjør disse faktorene begrenser mulighetene for skalering i bærekraftige systemer for L-xylulose biosyntese. For å overvinne disse begrensningene og forbedre L-xylulose biotransformasjon yield, var det strategiske kofaktor regenerering ansatt først ved å etablere en kombinert hel-celle biokatalytisk system. Nærmere bestemt, L-arabinitol 4-dehydrogenase (EC 1.1.1.12) fra Hypocrea jecorina (HjLAD), et enzym som er i L-arabinose katabolismen av sopp, ble valgt for å katalysere omdannelsen av L-arabinitol inn i L-xylulose 28,29 . Som mange biosyntetiske enzymer, en stor limitation HjLAD er at det krever en støkiometrisk mengde av den kostbare nikotinamidadenindinukleotid kofaktor (NAD +, den oksyderte form av NADH) for å utføre denne omdannelsen. NADH oxidase funnet i Streptococcus pyogenes (SpNox) har vist seg å vise høy kofaktor-regenerering aktivitet 30,31. Benytte seg av denne egenskap av SpNox, E. coli-celler som uttrykker HjLAD for fremstilling av L-xylulose ble koblet med E. coli-celler som uttrykker SpNox for regenereringen av NAD + for å øke den L-xylulose produksjon avbildet ved den koblede reaksjonen vist i Figur 1A. Under optimale forhold og ved hjelp av en initial konsentrasjon på 150 mM L-arabinitol, den maksimale L-xylulose utbytte nådde 96%, noe som gjør dette system mye mer effektiv enn de som er rapportert i litteraturen. Strategien for hel-celle immobilisering ble ansatt ved ytterligere styrke gjenbruk av kombinert biocatalytic system. Vanlig brukte metoder for hel-celle immobilisering inkluderer adsorpsjon / kovalent kobling til faste matriser, kryssbinding / entrapment og innkapsling i polymere nettverk 32. Blant disse metodene, er den mest egnede metode for celle immobilisering er innkapsling i kalsium alginatkuler. Deres milde gel-egenskapene, inert vandig matrise og høy porøsitet bidra til å bevare de fysiologiske egenskaper og funksjonalitet av de innkapslede biologiske 33. Derfor er koplet biokatalysator system inneholdende både E. coli-celler som HjLAD eller SpNox ble immobilisert på kalsium alginat perler til å aktivere flere sykluser av L-xylulose produksjon (figur 2) sikret immobilisert biocatalyst systemet demonstrert god driftsstabilitet, opprettholde 65% av konverterings utbyttet av den første syklusen etter 7 runder med påfølgende gjenbruk, mens den frie cellesystemet nesten helt mistet sin katalytiske aktivitet.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="801">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">LB broth&#160;</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">L3022-6X1KG</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Kanamycin</td>
			<td style="width:200px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP906-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Isopropyl &#946;-D-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">I6758-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Tris base</td>
			<td style="width:200px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP1521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">B-Nicotinamide adenine dinucleotide hydrate</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">N7004-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">L-Arabinitol</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A3506-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">L-Cysteine</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">168149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Sulfuric acid</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">320501-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Carbazole</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C5132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Ethanol&#160;</td>
			<td style="width:200px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP2818-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Sodium alginate</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">W201502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Calcium chloride dihydrate</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">223506-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Excella E24 shaker incubator</td>
			<td style="width:200px;">New Brunswick Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Cary 60 UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td style="width:200px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Centrifuge 5810R</td>
			<td style="width:200px;">Eppendrof</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Beakers</td>
			<td style="width:200px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Syringe</td>
			<td style="width:200px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Needle</td>
			<td style="width:200px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:315px;">Pioneer Analytical and Precision Weighing Balance</td>
			<td style="width:200px;">Ohaus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immobilization of multi-biocatalysts in alginate beads for cofactor regeneration and improved reusability

Vi har nylig utviklet en enkel, gjenbrukbar og koplet hel-celle biokatalytisk system med mulighet for kofaktor regenerering og biokatalysator immobilisering for økt produksjonsutbytte og vedvarende syntese. Beskrevet herved er den eksperimentelle fremgangsmåte for utvikling av et slikt system som består av to E. coli-stammer som uttrykker funksjonelt utfyllende enzymer. Til sammen kan disse to enzymer fungere samarbeide for å megle regenerering av dyre kofaktorer for å forbedre produktutbytte av bioreaction. I tillegg er rapportert fremgangsmåte for å syntetisere en immobilisert form av det koblede system biokatalytisk ved innkapsling av hele celler i kalsium alginatkuler. Som et eksempel presenterer vi den forbedrede biosyntesen av L-xylulose fra L-arabinitol ved kobling E. coli-celler som uttrykker enzymene L-arabinitol dehydrogenase eller NADH-oksidase. Under optimale betingelser og ved hjelp av en initial konsentrasjon på 150mM L-arabinitol, den maksimale L-xylulose utbytte nådde 96%, som er høyere enn de som er rapportert i litteraturen. Den immobiliserte formen av de sammenkoblede hel-celle biokatalysatorer vist god driftsstabilitet, opprettholde 65% av utbyttet oppnådd i den første syklusen etter 7 sykluser av påfølgende gjenbruk, mens det frie cellesystemet nesten helt mistet den katalytiske aktivitet. Derfor metodene som presenteres her, har to strategier som kan bidra til å forbedre den industrielle produksjon av L-xylose, samt andre verdiøkende forbindelser som krever bruk av kofaktorer generelt.

For å aktivere kofaktor regenerering, ble L-xylulose-syntese utført i en koplet hel-celle biokatalytisk system inneholdende E. coli HjLAD og E. coli SpNox celler. Etter optimaliseringen av forskjellige parametere, ble gjenbruk av dette systemet forbedres ved å immobilisere den i kalsium alginatkuler (figur 2). L-xylulose produksjon med kofakt...

Watch this Scientific Journal Video about Immobilization of Multi-biocatalysts in Alginate Beads for Cofactor Regeneration and Improved Reusability at JoVE.com

Immobilization of Multi-biocatalysts in Alginate Beads for Cofactor Regeneration and Improved Reusability (Video) | JoVE

Presentert er protokollen for ko-immobiliserte biokatalysatorer hel-celle for regenerering kofaktor og forbedret gjenbruk, ved hjelp av produksjon av L-xylulose som et eksempel. Kofaktor regenereringen oppnås ved kobling av to Escherichia coli-stammer som uttrykker funksjonelt komplementære enzymer; hel-celle biokatalysator immobilisering oppnås ved celle innkapsling i kalsium alginatkuler.

Immobilisering av Multi-biocatalysts i alginatkuler for kofaktor Regeneration og forbedret Reusability

We have recently developed a simple, reusable and coupled whole-cell biocatalytic system with the capability of cofactor regeneration and biocatalyst ...

Research

JoVE Journal

Chemistry

Immobilization of Multi-biocatalysts in Alginate Beads for Cofactor Regeneration and Improved Reusability

Improved In-gel Reductive &#946;-Elimination for Comprehensive O-linked and Sulfo-glycomics by Mass Spectrometry

Improved In-gel Reductive ÃŽÂ²-Elimination for Comprehensive O-linked and Sulfo-glycomics by Mass Spectrometry (Video) | JoVE

Forbedret i-gel reduktiv β-eliminering for Comprehensive O-forbundet og sulfo-glycomics ved massespektrometri

Separation of proteins by SDS-PAGE followed by in-gel proteolytic digestion of resolved protein bands has produced high-resolution proteomic analysis of ...

Microbubble Fabrication of Concave-porosity PDMS Beads

Microbubble Fabrication of Concave-porosity PDMS Beads (Video) | JoVE

Mikrobobleutskillere Fabrikasjon av Konkav-porøsitet PDMS Perler

Microbubble fabrication (by use of a fine emulsion) provides a means of increasing the surface-area-to-volume (SAV) ratio of polymer materials, which is ...

Improved Heterojunction Quality in Cu2O-based Solar Cells Through the Optimization of Atmospheric Pressure Spatial Atomic Layer Deposited Zn1-xMgxO

Improved Heterojunction Quality in Cu2O-based Solar Cells Through the Optimization of Atmospheric Pressure Spatial Atomic Layer Deposited Zn1-xMgxO (Video) | JoVE

Forbedret hetero Kvalitet i Cu<sub&gt; 2</sub&gt; O-baserte solceller gjennom optimalisering av Atmosfærisk trykk Spatial Atomic Layer Deponert<br /&gt; Zn<sub&gt; 1-x</sub&gt; Mg<sub&gt; x</sub&gt; O

Atmospheric pressure spatial atomic layer deposition (AP-SALD) was used to deposit n-type ZnO and Zn1-xMgxO thin films onto p-type thermally oxidized Cu2O ...

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry (Video) | JoVE

Syntese av Protein Bioconjugates<em&gt; via</em&gt; Cystein-maleimide kjemi

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

Surface Functionalization of Metal-Organic Frameworks for Improved Moisture Resistance

Surface Functionalization of Metal-Organic Frameworks for Improved Moisture Resistance (Video) | JoVE

Overflate Functionalization av metall-organisk rammeverk for forbedret fukt motstand

Metal-organic frameworks (MOFs) are a class of porous inorganic materials with promising properties in gas storage and separation, catalysis and sensing. ...

Bio-inspired Polydopamine Surface Modification of Nanodiamonds and Its Reduction of Silver Nanoparticles

Bio-inspired Polydopamine Surface Modification of Nanodiamonds and Its Reduction of Silver Nanoparticles (Video) | JoVE

Bio-inspirert Polydopamine overflaten modifikasjon av Nanodiamonds og dens reduksjon av Silver nanopartikler

Surface functionalization of nanodiamonds (NDs) is still challenging due to the diversity of functional groups on the ND surfaces. Here, we demonstrate a ...

Preparation of Poly(pentafluorophenyl acrylate) Functionalized SiO2 Beads for Protein Purification

Preparation of Polypentafluorophenyl acrylate Functionalized SiO2 Beads for Protein Purification (Video) | JoVE

Utarbeidelse av Poly(pentafluorophenyl acrylate) Functionalized SiO2 perler for Protein rensing

We demonstrate a simple method to prepare poly(pentafluorophenyl acrylate) (poly(PFPA)) grafted silica beads for antibody immobilization and subsequent ...

An Intestine/Liver Microphysiological System for Drug Pharmacokinetic and Toxicological Assessment

An Intestine/Liver Microphysiological System for Drug Pharmacokinetic and Toxicological Assessment (Video) | JoVE

Et mikrofysiologisk system for farmakokinetisk og toksikologisk vurdering av tarmen/leveren

The recently introduced microphysiological systems (MPS) cultivating human organoids are expected to perform better than animals in the preclinical tests ...

Trimethylamine Detection in Animal-Derived Medicine by Headspace GC-MS

An Improved Technique for Trimethylamine Detection in Animal-Derived Medicine by Headspace Gas Chromatography-Tandem Quadrupole Mass Spectrometry

An Improved Technique for Trimethylamine Detection in Animal-Derived Medicine by Headspace Gas Chromatography-Tandem Quadrupole Mass Spectrometry (Video) | JoVE 

Animal-derived medicines have distinctive characteristics and significant curative effects, but most of them have an obvious fishy odor, resulting in the ...

Porphyrin-Modified Beads in Flow Cytometry

Porphyrin-Modified Beads for Use as Compensation Controls in Flow Cytometry

Porphyrin-Modified Beads for Use as Compensation Controls in Flow Cytometry (Video) | JoVE 

Porfyrinmodifiserte perler til bruk som kompensasjonskontroll i flowcytometri

Flow cytometry can rapidly characterize and quantify diverse cell populations based on fluorescence measurements. The cells are first stained with one or ...