Name: immobilization of multi-biocatalysts in alginate beads for cofactor regeneration and improved reusability
Uploaded: 2016-04-22T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immobilization of Multi-biocatalysts in Alginate Beads for Cofactor Regeneration and Improved Reusability at JoVE.com

Это исследование было поддержано Основном программой исследования науки через Национальный исследовательский фонд Кореи (NRF), финансируемой Министерством образования, науки и техники (СРН-2013R1A1A2012159 и NRF-2013R1A1A2007561), Конкук университет и факультет химической инженерии и MCubed Программа в университете штата Мичиган.

1. цельноклеточная биокатализаторы Приготовление Примечание: Рекомбинантный Е. Клетки , несущие палочки pET28a- SpNox 31 или pET28a- HjLAD 28 далее упоминается как E. палочки SpNox и E. палочки HjLAD соответственно. <ol><li> Привить единственная колони?...

Последние технологические достижения позволили всплеск коммерциализации рекомбинантных биотерапевтических, что приводит к постепенному повышению их рыночной стоимости в биотехнологической промышленности. Одним из таких продвижение является появление метаболической инженерии в ?...

Восстановительное цельноклеточная биотрансформацию с использованием микроорганизмов стало распространенным методом для химио-ферментативный синтез коммерчески и терапевтически важных биомолекул 1 - 3. Она представляет ряд преимуществ по сравнению с использованием выделенных ферментов, в частности устранение затратных процессов очистки вниз по течению и демонстрации длительного срока службы 4 - 7. Для биокаталитические путей , где кофакторов необходимы для образования продукта, системы цельноклеточная имеют потенциал , чтобы обеспечить на месте кофактора регенерации в с помощью добавления недорогих донорных сопутствующих субстратов 5,8,9. Тем не менее, эта способность уменьшается для реакций, требующих стехиометрическое концентрации редких и дорогих сопутствующих подложек 10 - 13. Вместе с плохим повторное использование целых клеток, что затрудняет создание масштабируемого и непрерывного продфикция система. Стратегические модификации систем целых клеток для этих кофактора-зависимых биотрансформациях необходимы для преодоления вышеуказанных ограничений. В частности, сочетание целых клеток биокатализаторов , которые работают совместно , как было показано, значительно повысить производительность и стабильность ферментов питали 14. Эти факторы, которые часто имеют решающее значение для обеспечения возможности крупномасштабного производства коммерчески жизнеспособных продуктов, могут быть оптимизированы далее совместно иммобилизации биокаталитические микробов 15. Недавно мы разработали простой и многоразовый целой клетки биокаталитической систему , которая позволяет как кофактора регенерации и биокатализатор иммобилизация для L-ксилоза производства 16. В данном исследовании, эта система была использована в качестве примера, иллюстрирующего экспериментальные методики применения этих двух стратегий для повышения выхода продукции биотрансформации и биокатализатора многократного использования. L-ксилоза относится к CLAсс биологически полезных молекул названы редкие сахара. Редкие сахара являются уникальными моносахариды или производные сахара , которые встречаются очень редко в природе, но играют решающую роль в качестве элементов распознавания в биоактивных молекул 17,18. Они имеют множество применений , начиная от подсластителей, функциональных пищевых продуктов для потенциальных терапевтических средств 19. L-ксилоза может быть использован в качестве потенциального ингибитора нескольких альфа-глюкозидазами, а также может быть использовано в качестве индикатора гепатита или цирроза печени 17,20. Высокая эффективность преобразования ксилита L-ксилулозы в системах целых клеток сообщалось ранее в Pantoea ananatis 21,22, Alcaligenes SP. 701B 23, Bacillus бледного шара Y25 24,25 и кишечная палочка 26. У Е. палочка, тем не менее, это было достигнуто только с использованием низкой (&lt;67 мм) концентрации ксилита 26 из - за потенциальных ингибирующих эффектов начальной концентрации ксилита выше , чем 100 мМ на ксилит-4-дегидрогеназа активности 21,26. Термодинамическое равновесие между ксилулозы и ксилита было показано , что сильно способствует образованию ксилита 25,27. Кроме того, ксилоза выход ограничен количеством дорогих кофакторов , которые должны быть поставлены в случае отсутствия его на месте системы регенерации кофактора. В совокупности эти факторы ограничивают потенциал для масштабирования в устойчивых систем для L-ксилоза биосинтеза. Чтобы преодолеть эти ограничения и улучшить L-ксилоза выход биотрансформации, стратегия регенерации кофактора была использована первая путем создания системы биокаталитической в ​​сочетании целой клетки. В частности, L-арабинитола 4-дегидрогеназа (EC 1.1.1.12) из Hypocrea jecorina (HjLAD), фермент , в L-арабинозы катаболического пути грибов, был выбран , чтобы катализировать превращение L-арабинитола в L-ксилоза 28,29 , Как и многие другие ферменты биосинтетических, главный limitatioп HjLAD является то , что она требует стехиометрического количества дорогих никотинамидадениндинуклеотид кофактора (NAD +, окисленный форма NADH) , чтобы осуществить это преобразование. NADH - оксидазы найдено в Streptococcus Пирролидонилпептидаза (SpNox) было показано , для отображения высокой кофактором-регенерации активности 30,31. Пользуясь этим атрибутом SpNox, E. палочка - клетки , экспрессирующие HjLAD для производства L-ксилулозы были соединены с Е. палочка - клетки , экспрессирующие SpNox для регенерации NAD + , чтобы увеличить L-ксилоза производства , изображаемой спаренной реакции , показанной на рисунке 1А. При оптимальных условиях и с использованием начальной концентрации 150 мМ L-арабинитола, максимальная L-ксилоза выход составил 96%, что делает эту систему гораздо более эффективным, чем сообщалось в литературе. Стратегия целых клеток иммобилизации использовали следующий для дальнейшего повышения многократного использования в сочетании biocatalytСистема IC. Обычно используемые методы цельноклеточная иммобилизации включают адсорбционную / ковалентного связывания с твердыми матрицами сшивание / защемления и капсулирования в полимерных сетях 32. Среди этих подходов, наиболее подходящим методом для клеточной иммобилизации является инкапсуляция в альгината кальция бусин. Их мягкие свойства гелеобразования, инертный водная матрица и высокая пористость помогает сохранить физиологические свойства и функциональность инкапсулированных биопрепаратов 33. Таким образом, связанная система биокатализатор , содержащий как E. Клетки , несущие палочки HjLAD или SpNox иммобилизовали в альгината кальция бусин , чтобы включить несколько циклов L-ксилоза производства (рисунок 2) .The обездвижен система биокатализатор продемонстрировала хорошую стабильность работы, сохраняя 65% конверсионного выхода первого цикла после 7 циклов последовательное повторное использование, в то время как свободная клеточная система почти полностью утратила свою каталитическую активность.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="801">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">LB broth&#160;</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">L3022-6X1KG</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Kanamycin</td>
			<td style="width:200px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP906-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Isopropyl &#946;-D-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">I6758-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Tris base</td>
			<td style="width:200px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP1521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">B-Nicotinamide adenine dinucleotide hydrate</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">N7004-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">L-Arabinitol</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A3506-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">L-Cysteine</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">168149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Sulfuric acid</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">320501-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Carbazole</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C5132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Ethanol&#160;</td>
			<td style="width:200px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP2818-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Sodium alginate</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">W201502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Calcium chloride dihydrate</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">223506-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Excella E24 shaker incubator</td>
			<td style="width:200px;">New Brunswick Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Cary 60 UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td style="width:200px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Centrifuge 5810R</td>
			<td style="width:200px;">Eppendrof</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Beakers</td>
			<td style="width:200px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Syringe</td>
			<td style="width:200px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Needle</td>
			<td style="width:200px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:315px;">Pioneer Analytical and Precision Weighing Balance</td>
			<td style="width:200px;">Ohaus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immobilization of multi-biocatalysts in alginate beads for cofactor regeneration and improved reusability

Недавно мы разработали простой, многоразовые и связанную систему биокаталитической целой клетки с возможностью регенерации кофактора и биокатализатора иммобилизации для повышения выхода продукции и устойчивого синтеза. Описан при этом является экспериментальная процедура для разработки такой системы , состоящей из двух E. штаммы палочки, выражающие функционально комплементарные ферменты. Вместе эти два фермента могут функционировать совместно оперативно опосредовать регенерацию дорогих кофакторов для улучшения выхода продукта из биореакции. Кроме того, способ синтеза иммобилизованной форме спаренных биокаталитическом системы путем инкапсулирования целых клеток в альгинатные гранулы кальция сообщается. В качестве примера, мы представляем улучшенную биосинтез L-ксилулозы из L-арабинитола путем связывания Е. Клетки палочки , выражающие ферменты L-арабинитол дегидрогеназы или NADPH-оксидаза. При оптимальных условиях и с использованием начальной концентрации 150мМ L-арабинитол, максимальная L-ксилоза выход достигал 96%, что выше, чем в литературе. Иммобилизованная форма спаренных биокатализаторов целых клеток продемонстрировали хорошую стабильность работы, поддержание 65% урожая, полученного в первом цикле после 7 циклов последовательного повторного использования, в то время как система свободного клеток почти полностью утратили каталитическую активность. Поэтому методы, описанные здесь, обеспечивает две стратегии, которые могли бы помочь улучшить промышленного производства L-ксилулозы, а также другие соединения, с добавленной стоимостью, требующих использования кофакторов в целом.

Чтобы включить регенерацию кофактора, L-ксилоза Синтез проводили в связанной системе биокаталитическом целых клеток , содержащей E. палочки HjLAD и E. палочки SpNox клетки. После оптимизации различных параметров, возможность многократного ис?...

Watch this Scientific Journal Video about Immobilization of Multi-biocatalysts in Alginate Beads for Cofactor Regeneration and Improved Reusability at JoVE.com

Immobilization of Multi-biocatalysts in Alginate Beads for Cofactor Regeneration and Improved Reusability

Представлен протокол для совместного иммобилизации биокатализаторов целых клеток для регенерации кофактора и улучшенной возможности повторного использования, с использованием производства L-ксилулозу в качестве примера. Регенерация кофактора достигается за счет сочетания двух штаммов кишечной палочки , выражающие функционально комплементарные ферменты; биокатализатор иммобилизация поклеточного достигается за счет клеточного инкапсулирования в альгината кальция бусинок.

Иммобилизация Multi-биокатализаторов в альгинатные гранулы для регенерации кофактора и улучшены возможности повторного использования

We have recently developed a simple, reusable and coupled whole-cell biocatalytic system with the capability of cofactor regeneration and biocatalyst ...

Research

JoVE Journal

Chemistry

Improved In-gel Reductive &#946;-Elimination for Comprehensive O-linked and Sulfo-glycomics by Mass Spectrometry

Improved In-gel Reductive ÃƒÅ½Ã‚Â²-Elimination for Comprehensive O-linked and Sulfo-glycomics by Mass Spectrometry

Улучшенные В-гель восстановительного β-Ликвидация для Комплексная О-связанные и сульфо-glycomics помощью масс-спектрометрии

Separation of proteins by SDS-PAGE followed by in-gel proteolytic digestion of resolved protein bands has produced high-resolution proteomic analysis of ...

Microbubble Fabrication of Concave-porosity PDMS Beads

Микросепаратор Изготовление вогнутая пористости PDMS шариков

Microbubble fabrication (by use of a fine emulsion) provides a means of increasing the surface-area-to-volume (SAV) ratio of polymer materials, which is ...

Improved Heterojunction Quality in Cu2O-based Solar Cells Through the Optimization of Atmospheric Pressure Spatial Atomic Layer Deposited Zn1-xMgxO

Improved Heterojunction Quality in Cu2O-based Solar Cells Through the Optimization of Atmospheric Pressure Spatial Atomic Layer Deposited Zn1-xMgxO

Улучшение качества Гетеропереход в Cu<sub&gt; 2</sub&gt; O на основе солнечных батарей за счет оптимизации атмосферного давления пространственного атомного слоя Деп<br /&gt; Zn<sub&gt; 1-х</sub&gt; Mg<sub&gt; х</sub&gt; O

Atmospheric pressure spatial atomic layer deposition (AP-SALD) was used to deposit n-type ZnO and Zn1-xMgxO thin films onto p-type thermally oxidized Cu2O ...

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Синтез белка биоконъюгатов<em&gt; с помощью</em&gt; Цистеин-малеимид химии

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

Surface Functionalization of Metal-Organic Frameworks for Improved Moisture Resistance

Функционализация поверхности металлоорганических рамок для улучшения влагостойкости

Metal-organic frameworks (MOFs) are a class of porous inorganic materials with promising properties in gas storage and separation, catalysis and sensing. ...

Bio-inspired Polydopamine Surface Modification of Nanodiamonds and Its Reduction of Silver Nanoparticles

Био вдохновил Polydopamine поверхности модификация наноалмазов и его сокращение наночастиц серебра

Surface functionalization of nanodiamonds (NDs) is still challenging due to the diversity of functional groups on the ND surfaces. Here, we demonstrate a ...

Preparation of Poly(pentafluorophenyl acrylate) Functionalized SiO2 Beads for Protein Purification

Preparation of Polypentafluorophenyl acrylate Functionalized SiO2 Beads for Protein Purification

Подготовка Poly(pentafluorophenyl acrylate) функционализированных SiO2 бусины очищение протеина

We demonstrate a simple method to prepare poly(pentafluorophenyl acrylate) (poly(PFPA)) grafted silica beads for antibody immobilization and subsequent ...

Trimethylamine Detection in Animal-Derived Medicine by Headspace GC-MS

An Improved Technique for Trimethylamine Detection in Animal-Derived Medicine by Headspace Gas Chromatography-Tandem Quadrupole Mass Spectrometry

An Improved Technique for Trimethylamine Detection in Animal-Derived Medicine by Headspace Gas Chromatography-Tandem Quadrupole Mass Spectrometry (Video) | JoVE 

Animal-derived medicines have distinctive characteristics and significant curative effects, but most of them have an obvious fishy odor, resulting in the ...

Porphyrin-Modified Beads in Flow Cytometry

Porphyrin-Modified Beads for Use as Compensation Controls in Flow Cytometry

Porphyrin-Modified Beads for Use as Compensation Controls in Flow Cytometry (Video) | JoVE 

Гранулы, модифицированные порфирином, для использования в качестве компенсационного контроля в проточной цитометрии

Flow cytometry can rapidly characterize and quantify diverse cell populations based on fluorescence measurements. The cells are first stained with one or ...

Combining Amine-Functionalized Polystyrene Beads with TCPP Solution

Combining Amine-Functionalized Polystyrene Beads with TCPP Solution (Video) | JoVE 

Сочетание аминофункционализированных полистирольных шариков с раствором TCPP