Name: generation of microtumors using 3d human biogel culture system and patient-derived glioblastoma cells for kinomic profiling and drug response testing
Uploaded: 2016-06-09T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Microtumors Using 3D Human Biogel Culture System and Patient-derived Glioblastoma Cells for Kinomic Profiling and Drug Response Testing at JoVE.

بدعم من منحة المعاهد الوطنية للصحة R21 (PI: C. ويلي، CA185712-01)، الدماغ جائزة ورم بوغ (PD: غراي غيليسبي، P20CA 151129-03) وعقد SBIR (PI: R. سينغ، N43CO-2013-00026).

ملاحظة: تم إنجاز جميع التقييمات العلاج طعم أجنبي باستخدام نموذج ورم مثلي لورم أرومي على بروتوكول افقت عليها لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي. 1. عزل خلايا GBM طعم أجنبي المستمدة من المريض <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:righ...

<ol>
	<li>Ohgaki, H., Kleihues, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population-based+studies+on+incidence,+survival+rates,+and+genetic+alterations+in+astrocytic+and+oligodendroglial+gliomas.">Population-based studies on incidence, survival rates, and genetic alterations in astrocytic and oligodendroglial gliomas.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 64 (6), 479-489 (2005).</li><li>Wen, P. Y., Kesari, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malignant+gliomas+in+adults.">Malignant gliomas in adults.</a> N Engl J Med. 359 (5), 492-507 (2008).</li><li>Thumma, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+pretreatment+clinical+factors+on+overall+survival+in+glioblastoma+multiforme:+a+Surveillance+Epidemiology+and+End+Results+(SEER)+population+analysis.">Effect of pretreatment clinical factors on overall survival in glioblastoma multiforme: a Surveillance Epidemiology and End Results (SEER) population analysis.</a> World J Surg Oncol. 10 (75), (2012).</li><li>Furnari, F. B., Cloughesy, T. F., Cavenee, W. K., Mischel, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+epidermal+growth+factor+receptor+signalling+networks+in+glioblastoma.">Heterogeneity of epidermal growth factor receptor signalling networks in glioblastoma.</a> Nat Rev Cancer. 15 (5), 302-310 (2015).</li><li>Mischel, P. S., Cloughesy, T. F., Nelson, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-microarray+analysis+of+brain+cancer:+molecular+classification+for+therapy.">DNA-microarray analysis of brain cancer: molecular classification for therapy.</a> Nat Rev Neurosci. 5 (10), 782-792 (2004).</li><li>Verhaak, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+genomic+analysis+identifies+clinically+relevant+subtypes+of+glioblastoma+characterized+by+abnormalities+in+PDGFRA,+IDH1,+EGFR,+and+NF1.">Integrated genomic analysis identifies clinically relevant subtypes of glioblastoma characterized by abnormalities in PDGFRA, IDH1, EGFR, and NF1.</a> Cancer Cell. 17 (1), 98-110 (2010).</li><li>De Witt Hamer, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genomic+profile+of+human+malignant+glioma+is+altered+early+in+primary+cell+culture+and+preserved+in+spheroids.">The genomic profile of human malignant glioma is altered early in primary cell culture and preserved in spheroids.</a> Oncogene. 27 (14), 2091-2096 (2008).</li><li>Shankavaram, U. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+profiling+indicates+orthotopic+xenograft+of+glioma+cell+lines+simulate+a+subclass+of+human+glioblastoma.">Molecular profiling indicates orthotopic xenograft of glioma cell lines simulate a subclass of human glioblastoma.</a> J Cell Mol Med. 16 (3), 545-554 (2012).</li><li>Abbott, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+culture:+biology's+new+dimension.">Cell culture: biology's new dimension.</a> Nature. 424 (6951), 870-872 (2003).</li><li>Rao, S. S., Lannutti, J. J., Viapiano, M. S., Sarkar, A., Winter, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+3D+biomimetic+models+to+understand+the+behavior+of+glioblastoma+multiforme+cells.">Toward 3D biomimetic models to understand the behavior of glioblastoma multiforme cells.</a> Tissue Eng Part B Rev. 20 (4), 314-327 (2014).</li><li>Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+third+dimension+bridges+the+gap+between+cell+culture+and+live+tissue.">The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (10), 839-845 (2007).</li><li>Hollister, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porous+scaffold+design+for+tissue+engineering.">Porous scaffold design for tissue engineering.</a> Nat Mater. 4 (7), 518-524 (2005).</li><li>Rowley, J. A., Madlambayan, G., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alginate+hydrogels+as+synthetic+extracellular+matrix+materials.">Alginate hydrogels as synthetic extracellular matrix materials.</a> Biomaterials. 20 (1), 45-53 (1999).</li><li>Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrigel:+a+complex+protein+mixture+required+for+optimal+growth+of+cell+culture.">Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture.</a> Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).</li><li>Yoshino, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation+and+differentiation+of+a+transfected+Schwann+cell+line+is+altered+by+an+artificial+basement+membrane.">Proliferation and differentiation of a transfected Schwann cell line is altered by an artificial basement membrane.</a> Glia. 3 (5), 315-321 (1990).</li><li>Siegal, G. P., Singh, R., Foundation, T. U. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biologically+active+native+biomatrix+composition.">Biologically active native biomatrix composition.</a> US patent. , (2010).</li><li>Sarkaria, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+an+orthotopic+xenograft+model+for+assessing+the+effect+of+epidermal+growth+factor+receptor+amplification+on+glioblastoma+radiation+response.">Use of an orthotopic xenograft model for assessing the effect of epidermal growth factor receptor amplification on glioblastoma radiation response.</a> Clin Cancer Res. 12 (7), 2264-2271 (2006).</li><li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypan+Blue+Exclusion+Test+of+Cell+Viability.">Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability.</a> Curr Protoc Immunol. 111, 1-3 (2015).</li><li>Anderson, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinomic+exploration+of+temozolomide+and+radiation+resistance+in+Glioblastoma+multiforme+xenolines.">Kinomic exploration of temozolomide and radiation resistance in Glioblastoma multiforme xenolines.</a> Radiother Oncol. 111 (3), 468-474 (2014).</li><li>Anderson, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinomic+profiling+of+electromagnetic+navigational+bronchoscopy+specimens:+a+new+approach+for+personalized+medicine.">Kinomic profiling of electromagnetic navigational bronchoscopy specimens: a new approach for personalized medicine.</a> PLoS One. 9 (12), 116388 (2014).</li><li>Jarboe, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinomic+profiling+approach+identifies+Trk+as+a+novel+radiation+modulator.">Kinomic profiling approach identifies Trk as a novel radiation modulator.</a> Radiother Oncol. 103 (3), 380-387 (2012).</li><li>Anderson, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Throughput+Kinomic+Profiling+of+Human+Clear+Cell+Renal+Cell+Carcinoma+Identifies+Kinase+Activity+Dependent+Molecular+Subtypes.">High Throughput Kinomic Profiling of Human Clear Cell Renal Cell Carcinoma Identifies Kinase Activity Dependent Molecular Subtypes.</a> PLoS One. 10 (9), 0139267 (2015).</li><li>Anderson, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinomic+Alterations+in+Atypical+Meningioma.">Kinomic Alterations in Atypical Meningioma.</a> Medical Research Archives. 3, (2015).</li><li>Hothi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+chemical+screens+identify+disulfiram+as+an+inhibitor+of+human+glioblastoma+stem+cells.">High-throughput chemical screens identify disulfiram as an inhibitor of human glioblastoma stem cells.</a> Oncotarget. 3 (10), 1124-1136 (2012).</li><li>Quartararo, C. E., Reznik, E., deCarvalho, A. C., Mikkelsen, T., Stockwell, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+Screening+of+Patient-Derived+Cultures+Reveals+Potential+for+Precision+Medicine+in+Glioblastoma.">High-Throughput Screening of Patient-Derived Cultures Reveals Potential for Precision Medicine in Glioblastoma.</a> ACS Med Chem Lett. 6 (8), 948-952 (2015).</li><li>Ma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+personalized+medicine+with+a+three-dimensional+micro-scale+perfusion-based+two-chamber+tissue+model+system.">Towards personalized medicine with a three-dimensional micro-scale perfusion-based two-chamber tissue model system.</a> Biomaterials. 33 (17), 4353-4361 (2012).</li><li>Pedron, S., Becka, E., Harley, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+glioma+cell+phenotype+in+3D+matrices+by+hyaluronic+acid.">Regulation of glioma cell phenotype in 3D matrices by hyaluronic acid.</a> Biomaterials. 34 (30), 7408-7417 (2013).</li><li>Rape, A., Ananthanarayanan, B., Kumar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+strategies+to+mimic+the+glioblastoma+microenvironment.">Engineering strategies to mimic the glioblastoma microenvironment.</a> Adv Drug Deliv Rev. 79-90, 172-183 (2014).</li><li>Willey, C. D., Gilbert, A. N., Anderson, J. C., Gillespie, G. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-Derived+Xenografts+as+a+Model+System+for+Radiation+Research.">Patient-Derived Xenografts as a Model System for Radiation Research.</a> Semin Radiat Oncol. 25 (4), 273-280 (2015).</li></ol>

الخطوات الحاسمة ضمن بروتوكول تتصل أساسا microtumor جيل، وكذلك الجرعات المخدرات والصيانة. لأن حبات microtumor هشة وممزقة بسهولة، لا بد من الحذر الشديد في كل مراحل النمو لفحص وصيانة. إذا حدث خطأ أثناء أي من هذه العمليات، والتفسير التجريبي يمكن أن يتعرض للخطر، مما تسبب في تمديد أ...

وداخل الجمجمة أورام المخ الخبيثة الأولية الأكثر شيوعا هي الصف الثالث astrocytomas والصف الرابع ورم أرومي الأشكال (ورم أرومي أو GBM). هذه الأورام تقدم التكهنات الفقيرة مع متوسط ​​البقاء على قيد الحياة لمدة عام بين 12-15 شهرا مع العلاجات الحالية للGBM في 1-3 الولايات المتحدة. وتشمل العلاجات Multimodality الجراحة والإشعاع والعلاج الكيميائي بما في ذلك temozolomide (TMZ) وكلاء المستهدفة كيناز. وكثيرا ما dysregulated إشارات كيناز في الخليج للحاسبات الآلية، بما في ذلك مجموعات فرعية من الأورام مع التضخيم أو الطفرات تفعيل في البشرة عامل النمو مستقبلات (EGFR)، ويزيد في صفائح الدم المستمدة عامل النمو مستقبلات (PDGFR) يشير، وزيادة الفوسفاتيديل-اينوزيتول 3 كيناز (PI3K) و ورم دعم إشارات عائية من خلال الأوعية الدموية غشائي عامل نمو مستقبلات (VEGFR) فضلا عن غيرها من كيناز مدفوعة مسارات 4-6. الحالي في التجارب المختبرية والنماذج الحية تفقد كثيرا هذه التعديلات النيابية &lt;سوب&gt; 7. بالإضافة إلى ذلك، لم تقدم التنميط الجيني الفوائد المتوقعة التي قد تعكس حقيقة أن التغيرات الجينية وجينية لا يتوقع دائما التغيرات في مستوى نشاط البروتين، حيث معظم كيناز تستهدف وكلاء تعمل مباشرة، وحيث العلاجات مع آليات أخرى للعمل قد تعمل بشكل غير مباشر. وكان خط الخلية خلد التقليدية التي يمكن passaged لا نهاية لفترة طويلة معيارا لاختبار المخدرات نظرا لسهولة الصيانة والتكاثر. ومع ذلك، هذا النموذج يعاني من بيئة نمو عالية من المغذيات (و الاصطناعي) أن يختار لسريعة النمو الخلايا التي تختلف اختلافا كبيرا عن الورم الأصلي. على هذا النحو، كان هناك اهتمام كبير في تطوير نظم نموذج أكثر واقعية تعكس نظام بيولوجي الورم أكثر تعقيدا كما هي موجودة في المريض. xenografts الورم وضعت مباشرة من الورم الرئيسي نمت في الفئران ( &quot;xenoline،&quot; طعم أجنبي المستمدة من المريض أو PDX). نحن نتعاملدي نظام نموذجي أكثر تعبيرا، وخاصة في تحديد علاجات السرطان، كما انهم شعروا التنبؤ بشكل موثوق النجاح السريري. 8 وعلى الرغم من علم الأحياء أكثر تعبيرا، وهذه النماذج هي مكلفة وصعبة لإنشاء وصيانة. وعلاوة على ذلك، فهي ليست قابلة للدراسات عالية الإنتاجية. الحاجة إلى تطوير أفضل النماذج البيولوجية التي تعكس بشكل أدق التغيرات الجزيئية في الأورام الأولية، والبيانات الشخصية واختبار هذه النماذج باستخدام تدابير مباشرة النشاط كيناز، لا بديل علامات وراثية، هو واضح. ومن المعروف جيدا أن خلاف ثنائي الأبعاد (2D) الثقافات أحادي الطبقة، 3D أو نماذج الفحص المتعددة الخلايا يمكن أن توفر أكثر من الناحية الفسيولوجية النهاية ذات الصلة 9-11. نهج ثقافة 3D مشتركة تشمل ناقل دقيق المغلفة المصفوفة وتشكيل خلية كروي. يمكن أن تتولد الكروية الورم عن طريق تجميع الخلوي باستخدام قارورة الدوار، لوحة pHEMA ومعلقة تقنيات الهبوط. القيود لروتشمل النهج ذات المناظر: عدم قدرة بعض الخلايا لتشكيل الأجسام الشبه الكروية مستقرة، وتقلب في النمو والتحديات مع أنواع الخلايا المختلطة. بدلا من ذلك، فإن العديد من الاصطناعية (هيدروجيل البوليمر) والحيوانات تستمد Engelbreth-هولم-سرب (الصحة والسلامة) مصفوفة من الأورام اللحمية الماوس، والكولاجين البقري) تم وضع مصفوفات للثقافة 3D يدرس 12-14. يستخدم الماوس الصحة والسلامة مصفوفة على نطاق واسع ولكن المعروف لتعزيز نمو الخلايا والتمايز في المختبر والمجراة 15. من أجل تكرار بيولوجية الورم 3D، تم وضع نظام بايوماتريكس الإنسان الدكتور راج سينغ وآخرون. 16. والطبيعي، والنمو خالية من عامل biogel البشري يسمح السقالات الثقافة 3D (الخرز، وأقراص)، والتي تدعم زراعة طويل الأجل من أنواع خلايا متعددة. وتنشأ سلسلة من 3D التصاميم الثقافة biogel البشري لدراسة نمو الورم، التصاق، الأوعية الدموية والغزو خصائص. مزايا وخصائص biogel البشري بالمقارنة مع شيوعا<html> وتتلخص المواد الهلامية الماوس الصحة والسلامة في الجدول 1 والجدول 2. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> مصدر: </td><td> Amnions الإنسان (الأنسجة المجمعة) خالية من مسببات الأمراض، الاتحاد الدولي للرجبي معفاة / وافق </td></tr><tr><td> طبيعة ECM: </td><td> غير التشويه والتحريف Biogel (GLP-الإنتاج) </td></tr><tr><td> مفتاح المكونات: </td><td> العقيد-I (38٪)، Laminin (22٪)، العقيد-IV (20٪)، العقيد-III (7٪)، Entactin وHSPG (&lt;3٪) </td></tr><tr><td> خالية من GF: </td><td> غير قابل للكشف EGF، جمعية جيل المستقبل، TGF، VEGF، PDGF (غير للعائية، غير سامة) </td></tr></tbody></table> الجدول 1: خصائص Biogel الإنسان بالمقارنة مع الصحة والسلامة هلام المشتركة. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-wi</html style=";text-align:right;direction:rtl">TH-next.within صفحة = &quot;دائما&quot;&gt; <tbody><tr><td> Biogel البشري </td><td> المواد الهلامية الصحة والسلامة </td></tr><tr><td> مصفوفة الإنسان الطبيعية </td><td> إعادة تشكيل مصفوفة الماوس </td></tr><tr><td> نمو الخلايا التي تسيطر عليها والتمايز </td><td> يمكن أن تعزز نمو الخلايا والتمايز </td></tr><tr><td> التعبير الجيني فيزيولوجي </td><td> التعبير الجيني متغير </td></tr><tr><td> نموذج الثقافة مثل الأنسجة 3D </td><td> نموذج الثقافة القائمة على لوحة </td></tr></tbody></table> الجدول 2: مزايا Biogel الإنسان بالمقارنة مع الصحة والسلامة هلام المشتركة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1142">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Collagenase-I&#160;</td>
			<td style="width:184px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">CO130</td>
			<td style="width:496px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Trypsin EDTA (10X)</td>
			<td style="width:184px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">15400-054&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Neurobasal-A</td>
			<td style="width:184px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">10888-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">N-2 Supplement</td>
			<td style="width:184px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">17502-048</td>
			<td>1x final concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">B-27 Supplement w/o Vitamin A</td>
			<td style="width:184px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">12587-010</td>
			<td>1x final concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Recombinant Human FGF-basic</td>
			<td style="width:184px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">PHG0266</td>
			<td>10 ng/mL final concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Recombinant Human EGF</td>
			<td style="width:184px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">PGH0315</td>
			<td>10 ng/mL final concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:184px;">Corning Cellgro Mediatech</td>
			<td style="width:119px;">25-005-CI</td>
			<td>2 mM final concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Fungizone</td>
			<td style="width:184px;">Omega Scientific</td>
			<td style="width:119px;">FG-70</td>
			<td>2.5 ug/mL final concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Penicillin Streptomycin</td>
			<td style="width:184px;">Omega Scientific</td>
			<td style="width:119px;">PS-20</td>
			<td>100 U/mL Penicillin G, 100 ug/mL Streptomycin final concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Gentamicin</td>
			<td style="width:184px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15750-060</td>
			<td>50 ng/mL final concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">MTT</td>
			<td style="width:184px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">M6494</td>
			<td>prepared to 5 mg/mL in PBS and sterile filtered, 1 mg/mL in well</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">SDS</td>
			<td style="width:184px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP166</td>
			<td>for MTT lysis buffer, prepared to 10% in 0.01M HCL, 5% in well</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">HCl</td>
			<td style="width:184px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">A144SI-212</td>
			<td>for MTT lysis buffer, prepared to 0.01M with SDS, 5 mM in well</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Calcein AM</td>
			<td style="width:184px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">C1430</td>
			<td>1 mM in DMSO stock, 2 uM in PBS staining solution, 1 uM in well</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Halt&#8217;s Protein Phosphatase Inhibitor cocktail&#160;</td>
			<td style="width:184px;">Pierce ThermoScientific</td>
			<td style="width:119px;">78420</td>
			<td>1:100 ratio in MPER&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Halt&#39;s Protein Protease Inhibitor&#160;</td>
			<td style="width:184px;">Pierce ThermoScientific</td>
			<td style="width:119px;">87786</td>
			<td>1:100 ratio in MPER</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Mammalian Protein Extraction Reagent (MPER)</td>
			<td style="width:184px;">Pierce ThermoScientific</td>
			<td style="width:119px;">PI78501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Trypan Blue</td>
			<td style="width:184px;">Pierce ThermoScientific</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">DMSO</td>
			<td style="width:184px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP231</td>
			<td>for dissolution of calcein AM &#38; compounds</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Phosphate-Buffered Saline without Ca/Mg</td>
			<td style="width:184px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">17-517Q</td>
			<td>diluted to 1X with MiliQ ultrapure water and sterile filtered (for cell culture)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline with Ca/Mg</td>
			<td style="width:184px;">Corning Cellgro Mediatech</td>
			<td style="width:119px;">20-030-CV</td>
			<td>diluted to 1X with MiliQ ultrapure water (for pre-fixation wash)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">10% Neutral Buffered Formalin</td>
			<td style="width:184px;">Protocol</td>
			<td style="width:119px;">032-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Trypan Blue</td>
			<td style="width:184px;">Pierce ThermoScientific</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">High Density Hubiogel</td>
			<td style="width:184px;">Vivo Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">HDHG-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Halt&#39;s Protein Phosphatase Inhibitor</td>
			<td style="width:184px;">Pierce</td>
			<td style="width:119px;">78420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Halt&#39;s Protein Protease Inhibitor</td>
			<td style="width:184px;">Pierce</td>
			<td style="width:119px;">87786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Mammalian Protein Extraction Reagent (MPER)</td>
			<td style="width:184px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">78501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Protein Tyrosine Kinase (PTK) Array Profiling chip</td>
			<td style="width:184px;">PamGene</td>
			<td style="width:119px;">86312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">PTK kinase buffer</td>
			<td style="width:184px;">PamGene</td>
			<td style="width:119px;">36000</td>
			<td>300 &#181;l 10X PK buffer stock in 2.7 ml dH20, catalog number for PTK reagent kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">ATP</td>
			<td style="width:184px;">PamGene</td>
			<td style="width:119px;">36000</td>
			<td>catalog number for PTK reagent kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PY20- FITC-conjugated antibody</td>
			<td style="width:184px;">PamGene</td>
			<td style="width:119px;">36000</td>
			<td>catalog number for PTK reagent kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PTK Additive</td>
			<td style="width:184px;">PamGene</td>
			<td style="width:119px;">32114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PTK-MM1 tube (10X BSA)</td>
			<td style="width:184px;">PamGene</td>
			<td style="width:119px;">36000</td>
			<td>catalog number for PTK reagent kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Serine/Threonine Kinase (STK) Array Profiling chip</td>
			<td style="width:184px;">PamGene</td>
			<td>87102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">STK kinase buffer</td>
			<td style="width:184px;">PamGene</td>
			<td style="width:119px;">32205</td>
			<td>catalog number for STK reagent kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">STK Primary Antibody Mix (DMAB tube)</td>
			<td style="width:184px;">PamGene</td>
			<td style="width:119px;">32205</td>
			<td>catalog number for STK reagent kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">FITC-conjugated Secondary Antibody</td>
			<td style="width:184px;">PamGene</td>
			<td style="width:119px;">32203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">STK-MM1 tube (100X BSA)</td>
			<td style="width:184px;">PamGene</td>
			<td style="width:119px;">32205</td>
			<td>catalog number for STK reagent kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">STK Antibody Buffer</td>
			<td style="width:184px;">PamGene</td>
			<td style="width:119px;">32205</td>
			<td>catalog number for STK reagent kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Equipment</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">#11 Blades, sterile</td>
			<td style="width:184px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">3120030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">#3 scalpel handles, sterile</td>
			<td style="width:184px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">08-913-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">100mm glass Petri dishes</td>
			<td style="width:184px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">08-748D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Semicurved forceps</td>
			<td style="width:184px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">12-460-318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Trypsinizing flask</td>
			<td style="width:184px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">10-042-12B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Magnetic stirrer</td>
			<td style="width:184px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">14-490-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">3/4&#34; stir bar</td>
			<td style="width:184px;">Fisher</td>
			<td>14-512-125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">B-D cell strainer&#160;</td>
			<td style="width:184px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">#352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">B-D 50ml Centrifuge tube</td>
			<td style="width:184px;">Fisher</td>
			<td>#352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">PamStation 12</td>
			<td style="width:184px;">PamGene</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">BioNavigator 6.0 kinomic analysis software&#160;</td>
			<td style="width:184px;">PamGene</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Evolve Kinase Assay Software</td>
			<td style="width:184px;">PamGene</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">UpKin App software (upstream kinase prediction)</td>
			<td style="width:184px;">PamGene</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">gentleMACS Dissociator</td>
			<td style="width:184px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-093-235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Rotary Cell Culture System (RCCS)</td>
			<td style="width:184px;">Synthecon</td>
			<td style="width:119px;">RCCS-D</td>
			<td>with 10 mL disposable HARV</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of microtumors using 3d human biogel culture system and patient-derived glioblastoma cells for kinomic profiling and drug response testing

The use of patient-derived xenografts for modeling cancers has provided important insight into cancer biology and drug responsiveness. However, they are time consuming, expensive, and labor intensive. To overcome these obstacles, many research groups have turned to spheroid cultures of cancer cells. While useful, tumor spheroids or aggregates do not replicate cell-matrix interactions as found in vivo. As such, three-dimensional (3D) culture approaches utilizing an extracellular matrix scaffold provide a more realistic model system for investigation. Starting from subcutaneous or intracranial xenografts, tumor tissue is dissociated into a single cell suspension akin to cancer stem cell neurospheres. These cells are then embedded into a human-derived extracellular matrix, 3D human biogel, to generate a large number of microtumors. Interestingly, microtumors can be cultured for about a month with high viability and can be used for drug response testing using standard cytotoxicity assays such as 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) and live cell imaging using Calcein-AM. Moreover, they can be analyzed via immunohistochemistry or harvested for molecular profiling, such as array-based high-throughput kinomic profiling, which is detailed here as well. 3D microtumors, thus, represent a versatile high-throughput model system that can more closely replicate in vivo tumor biology than traditional approaches.

لقد أثبتنا أن نظام الثقافة biogel 3D يدعم النمو على المدى الطويل وظيفة من أنواع خلايا متعددة. في هذا المشروع التعاوني، وتستخدم xenolines GBM المشتقة من المريض (PDX) لإنتاج مئات microtumors. كانت جزءا لا يتجزأ من الخرز biogel (2 مم) وبعد دبق سريع أنهم مثقف في مفاعل حيوي مخص?...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Microtumors Using 3D Human Biogel Culture System and Patient-derived Glioblastoma Cells for Kinomic Profiling and Drug Response Testing at JoVE.

Generation of Microtumors Using 3D Human Biogel Culture System and Patient-derived Glioblastoma Cells for Kinomic Profiling and Drug Response Testing

Patient-derived xenografts of glioblastoma multiforme can be miniaturized into living microtumors using 3D human biogel culture system. This in vivo-like 3D tumor assay is suitable for drug response testing and molecular profiling, including kinomic analysis.

جيل من Microtumors عن طريق نظام الثقافة 3D Biogel الإنسان وخلايا ورم أرومي دبقي المستمدة من المريض لKinomic التنميط والدواء استجابة اختبار

The use of patient-derived xenografts for modeling cancers has provided important insight into cancer biology and drug responsiveness. However, they are ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Identification and Isolation of Slow-Dividing Cells in Human Glioblastoma Using Carboxy Fluorescein Succinimidyl Ester (CFSE)

Identification and Isolation of Slow-Dividing Cells in Human Glioblastoma Using Carboxy Fluorescein Succinimidyl Ester CFSE

تحديد وعزل بطيئة تقسيم الخلايا في الإنسان عن طريق ورم أرومي دبقي كربوكسي فلوريسئين Succinimidyl استر (CFSE)

Tumor heterogeneity represents a fundamental feature supporting tumor robustness and presents a central obstacle to the development of therapeutic ...

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

العزلة، وتوصيف المقارن التمييز بين الخلايا الجذعية البشرية الأسنان اللب المستمدة من الأسنان الدائمة باستخدام طريقتين مختلفتين

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

زراعة الخلايا المشتقة المريض وعزل CD133<sup&gt; +</sup&gt; خلايا الجذعية السرطانية المزعومين من الميلانوما

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

العزلة، والحفظ بالتبريد والثقافة من الخلايا الظهارية البشرية السلى للتطبيقات السريرية

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

Generation of Prostate Cancer Patient Derived Xenograft Models from Circulating Tumor Cells

جيل من سرطان البروستاتا المريض المشتقة نماذج طعم أجنبي من تعميم الخلايا السرطانية

Patient derived xenograft (PDX) models are gaining popularity in cancer research and are used for preclinical drug evaluation, biomarker identification, ...

A Brain Tumor/Organotypic Slice Co-culture System for Studying Tumor Microenvironment and Targeted Drug Therapies

ورم في المخ / شريحة عضوي النمط المشارك ثقافة النظام لدراسة ورم المكروية والمستهدفة المخدرات العلاجات

Brain tumors are a major cause of cancer-related morbidity and mortality. Developing new therapeutics for these cancers is difficult, as many of these ...

A Human Glioblastoma Organotypic Slice Culture Model for Study of Tumor Cell Migration and Patient-specific Effects of Anti-Invasive Drugs

A غليوبلاستوما الإنسان أورغانوتيبيك نموذج شريحة شريحة لدراسة هجرة الخلايا السرطانية والآثار الخاصة بالمريض من الأدوية المضادة للغزو

Glioblastoma (GBM) continues to carry an extremely poor clinical prognosis despite surgical, chemotherapeutic, and radiation therapy. Progressive tumor ...

Three-dimensional Alginate-bead Culture of Human Pituitary Adenoma Cells

ثلاثي الأبعاد الثقافة الجيني حبة من خلايا الإنسان ورم الغدة النخامية

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from ...

Generation of a Humanized Mouse Liver Using Human Hepatic Stem Cells

جيل من كبد الفأر أنسنة طريق كبد الإنسان خلايا الجذعية

A novel animal model involving chimeric mice with humanized livers established via human hepatocyte transplantation has been developed. These mice, in ...

Drug Repurposing Hypothesis Generation Using the "RE:fine Drugs" System

المخدرات تطويعها لأغراض أخرى فرضية الجيل باستخدام &quot;RE: المخدرات بخير&quot; النظام

The promise of drug repurposing is that existing drugs may be used for new disease indications in order to curb the high costs and time for approval. The ...