Name: isolation and profiling of microrna-containing exosomes from human bile
Uploaded: 2016-06-13T14:00:00
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This study was supported by a K08 Award (DK090154-01) from the National Institutes of Health (NIH; to F.M.S.).

내시경 역행 췌담 관 조영술에 의한 환자에서 담즙을 취득 (ERCP)는 임상 시험 심사위원회에 의해 인간 대상 연구 프로토콜의 승인을 필요로한다. 여기에 제시된 모든 작업은 존스 홉킨스 대학의 임상 시험 심사위원회의 승인을했다. 담즙 1. 엑소 좀 격리 <ol><li> 내시경 역행 췌담 관 조영술 (ERCP)을 수행합니다. 앙와위에서 환자를 놓고 삽관. <ol><li> 환자의 구강을 통해 십이지...

<ol>
	<li>Admyre, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+with+immune+modulatory+features+are+present+in+human+breast+milk.">Exosomes with immune modulatory features are present in human breast milk.</a> J. Immunol. 179 (3), 1969-1978 (2007).</li><li>Aushev, V. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparisons+of+microRNA+patterns+in+plasma+before+and+after+tumor+removal+reveal+new+biomarkers+of+lung+squamous+cell+carcinoma.">Comparisons of microRNA patterns in plasma before and after tumor removal reveal new biomarkers of lung squamous cell carcinoma.</a> PLoS One. 8 (10), e78649 (2013).</li><li>Ben-Dov, I. 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Acta. 1820 (7), 940-948 (2012).</li><li>Kosaka, N., Iguchi, H., Yoshioka, Y., Takeshita, F., Matsuki, Y., Ochiya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretory+mechanisms+and+intercellular+transfer+of+microRNAs+in+living+cells.">Secretory mechanisms and intercellular transfer of microRNAs in living cells.</a> J. Biol. Chem. 285 (23), 17442-17452 (2010).</li><li>Mittelbrunn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unidirectional+transfer+of+microRNA-loaded+exosomes+from+T+cells+to+antigen-presenting+cells.">Unidirectional transfer of microRNA-loaded exosomes from T cells to antigen-presenting cells.</a> Nat. Commun. 2, 282 (2011).</li><li>Pegtel, D. M., van de Garde, M. D., Middeldorp, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+miRNAs+exploiting+the+endosomal-exosomal+pathway+for+intercellular+cross-talk+and+immune+evasion.">Viral miRNAs exploiting the endosomal-exosomal pathway for intercellular cross-talk and immune evasion.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1809 (11-12), 715-721 (2011).</li><li>Peinado, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanoma+exosomes+educate+bone+marrow+progenitor+cells+toward+a+pro-metastatic+phenotype+through+MET.">Melanoma exosomes educate bone marrow progenitor cells toward a pro-metastatic phenotype through MET.</a> Nat. Med. 18 (6), 883-891 (2012).</li><li>Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+vesicles+as+conveyors+of+immune+responses.">Membrane vesicles as conveyors of immune responses.</a> Nat. Rev. Immunol. 9 (8), 581-593 (2009).</li><li>Valadi, H., Ekstrom, K., Bossios, A., Sjostrand, M., Lee, J. J., Lotvall, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome-mediated+transfer+of+mRNAs+and+microRNAs+is+a+novel+mechanism+of+genetic+exchange+between+cells.">Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells.</a> Nat. Cell Biol. 9 (6), 654-659 (2007).</li><li>Bessho, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+genomics+identifies+candidate+microRNAs+for+pathogenesis+of+experimental+biliary+atresia.">Integrative genomics identifies candidate microRNAs for pathogenesis of experimental biliary atresia.</a> BMC Syst. Biol. 7, (2013).</li><li>Calin, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+profiling+reveals+distinct+signatures+in+B+cell+chronic+lymphocytic+leukemias.">MicroRNA profiling reveals distinct signatures in B cell chronic lymphocytic leukemias.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (32), 11755-11760 (2004).</li><li>Collins, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+differential+microRNA+profile+distinguishes+cholangiocarcinoma+from+pancreatic+adenocarcinoma.">A differential microRNA profile distinguishes cholangiocarcinoma from pancreatic adenocarcinoma.</a> Ann. Surg. Oncol. 21 (1), 133-138 (2014).</li><li>He, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microRNA+polycistron+as+a+potential+human+oncogene.">A microRNA polycistron as a potential human oncogene.</a> Nature. 435 (7043), 828-833 (2005).</li><li>Taylor, D. D., Gercel-Taylor, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+signatures+of+tumor-derived+exosomes+as+diagnostic+biomarkers+of+ovarian+cancer.">MicroRNA signatures of tumor-derived exosomes as diagnostic biomarkers of ovarian cancer.</a> Gynecol. Oncol. 110 (1), 13-21 (2008).</li><li>Rabinowits, G., Gercel-Taylor, C., Day, J. M., Taylor, D. D., Kloecker, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomal+microRNA:+a+diagnostic+marker+for+lung+cancer.">Exosomal microRNA: a diagnostic marker for lung cancer.</a> Clin. Lung Cancer. 10 (1), 42-46 (2009).</li><li>Skog, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioblastoma+microvesicles+transport+RNA+and+proteins+that+promote+tumour+growth+and+provide+diagnostic+biomarkers.">Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers.</a> Nat.Cell Biol. 10 (12), 1470-1476 (2008).</li><li>Lance, R. S., Drake, R. R., Troyer, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+recognition+assay+reveals+prostasomes+as+promising+plasma+biomarkers+for+prostate+cancer.">Multiple recognition assay reveals prostasomes as promising plasma biomarkers for prostate cancer.</a> Expert Rev. Anticancer Ther. 11 (9), 1341-1343 (2011).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+bile+contains+microRNA-laden+extracellular+vesicles+that+can+be+used+for+cholangiocarcinoma+diagnosis.">Human bile contains microRNA-laden extracellular vesicles that can be used for cholangiocarcinoma diagnosis.</a> Hepatology. 60 (3), 896-907 (2014).</li><li>Gabriel, D. A., Giordano, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microparticle+sizing+and+counting+using+light+scattering+methods.">Microparticle sizing and counting using light scattering methods.</a> Semin. Thromb. Hemost. 36 (8), 824-832 (2010).</li><li>Colombo, M., Raposo, G., Thery, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis,+secretion,+and+intercellular+interactions+of+exosomes+and+other+extracellular+vesicles.">Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 30, 255-289 (2014).</li></ol>

확실 담즙 분리 엑소 좀을 이용하기 위해, 창에 고품질의 샘플을 얻기 위해 일관된 고품질의 분리 방법을 채용하는 것이 중요하다. 이 논문에 정의 된 방법론은 인간의 담즙에서 엑소 좀과의 miRNA를 분리하는 잘 확립 된 방법입니다. 그것은 최소한 전자 현미경이나 나노 입자의 광학 분석 및 웨스턴 블롯을 포함한다 고립 엑소 좀의 특성 몇 가지 중요한 단계를 강조한다. 이 mi...

다른 생물 즉, 유체, 모유, 플라즈마 또는 소변과 마찬가지로, 담즙은 엑소 좀, 지질이 풍부한 소포 1-4가 포함되어 있습니다. 엑소 좀을 유도하거나받는 셀 (5), (6), 정상 기능 (4), 7-9의 일부일 수도 세포 간 통신의 형태 생물학적 기능을 변경할 수있다. 엑소 좀 진단 (10)에 대한 바이오 마커의 가치있는 소스를 제공 할 수 miRNA의 종을 포함 할 수 있습니다. miRNAs의 프로파일 질환 11-14의 다양한 진단 및 예후 표지자로서 최근에 상당한 관심을 얻고있다. miRNA의 자체는 생물학적 유체, 아마도 죽은 세포에 의해 발표 및 창고 세포의 양이 크게 기저 질환에 의해 영향을받을 수에서 찾을 수 있습니다. 엑소 좀의 miRNA의 프로필은 반드시 원래 셀 6, 10, 15 ~ 17의 miRNA의 프로파일을 반영하지 않는, 아직 엑소 좀은 부모 가전에 대한 특성 수 있습니다 miRNA의 서명을 수행 할 수있다종양 세포를 원하는 것이다. 종양 유래 엑소 좀은 폐 선암, 전립선 암 등의 종양이 8, 16, 18을 가진 환자의 혈장에서 발견되었다. 이 방법의 목적은 자신의 이전 처리 절차의 대부분 독립적 인 인간의 담즙 시료에서 엑소 좀의 안정적이고 강력한 격리입니다. 그것은 이러한 담관암 (19) 담관 질환의 전위 진단의 miRNA의 신뢰성있는 소스로서 담즙을 이용하기 위해 개발되었다. 이 엑소 좀을 분리 속도가 증가함에 따라 원심 여러 단계로 구성되며, 다른 생물학적 유체에 적용 할 수있다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="752">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:305px;">0.2&#181;m Polyethersulfone (PES) membrane filter</td>
			<td style="width:161px;">Corning</td>
			<td align="right" style="width:119px;">431229</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">thinwall polyallomer ultracentrifuge tubes&#160;</td>
			<td style="width:161px;">Beckman Coulter</td>
			<td align="right" style="width:119px;">331374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">SW40Ti rotor</td>
			<td style="width:161px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">LM10-HS&#160;</td>
			<td style="width:161px;">Nanosight</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:305px;">Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) software&#160;</td>
			<td style="width:161px;">Nanosight</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">mirVANA</td>
			<td style="width:161px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">AM1560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:305px;">cOmplete Protease Inhibitor</td>
			<td style="width:161px;">Roche distributed by Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4693116001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Immobilon PSQ</td>
			<td style="width:161px;">Millipore, Bedford MA</td>
			<td style="width:119px;">ISEQ00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Anti-CD63 antibody</td>
			<td style="width:161px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab59479</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Anti-Tsg101</td>
			<td style="width:161px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab30871</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and profiling of microrna-containing exosomes from human bile

지난 3 년간의 엑소 좀 연구는 크게 바이오 마커 및 치료 용도의 식별 및 특성으로 범위를 확장했다. 엑소 좀 최근 마이크로 RNA (미르)을 함유하는 것으로 나타났다. 미르 자체 진단을 위해 가치있는 바이오 마커로 제기했다. 진료소와 병원에서 표본 수집이 매우 변수이기 때문에, 전체 담즙에서 miRNA의 분리가 실질적으로 변화한다. 간단하게 수집 담즙 샘플들로부터 강력한 정확하고 재현성 miRNA의 프로파일을 달성하기 위해서 분리 담즙에서 엑소 좀을 특징 고품질 프로토콜의 개발이 필요했다. 이 방법은 몇 회 원심 분리 및 엑소 좀 펠렛 최종 초 원심 분리 공정과 여과 단계를 필요로한다. 전자 현미경, 웨스턴 블랏은 유동 세포 계측법 및 다중 파라미터 나노 광학 분석이 가능하며, 전자의 품질을 확인하는 것이 중요 특성화 단계는xosomes. 즉, 예쁜 꼬마 선충, 같은 종에서 비특이적, 합성의 miRNA와 해물을 급상승 이러한 엑소 좀에서의 miRNA의 분리를 위해, CEL-은 miR-39, RNA 추출 효율의 정상화를 위해 중요하다. 이 방법에 따라 담즙 액에서 엑소 좀의 분리는 성공의 miRNA는 -80 ° C에서 몇 년 동안 저장된 담즙 샘플에서 프로파일 링 할 수 있습니다.

엑소 좀 일반 현미경에 의해 검출 또는 유세포하기에는 너무 작기 때문에, 전자 현미경 또는 나노 입자의 광학 분석이 수행되어야한다. 나노 입자의 광학 분석은 또한 정량적이고 크기 분포 및 농도를 제공하는 전자 현미경 위에 이점을 갖는다. 장비는 시료에 유리 프리즘을 통해 정밀하게 초점을 맞춘 레이저 빔을 소개합니다. 격리 소포 브라운 운동은 EMCCD 고감도 카메?...

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Isolation and Profiling of MicroRNA-containing Exosomes from Human Bile

Bile fluid is a valuable source of extracellular vesicles/exosomes that contain potentially important biomarkers. This protocol represents a robust method to isolate exosomes from human bile for further analyses including miRNA profiling.

격리 및 프로파일 링 마이크로 RNA-포함하는 인간의 담즙에서 엑소 좀을

Exosome research in the last three years has greatly extended the scope towards identification and characterization of biomarkers and their therapeutic ...

Research

JoVE Journal

Medicine

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부분 Pancreatectomized 환자에서 인간 아일 레츠의 분리

Investigations into the pathogenesis of type 2 diabetes and islets of Langerhans malfunction 1 have been hampered by the limited availability of type 2 ...

연구

의학

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인간의 태아 췌장 세포 클러스터의 분리, 문화, 및 이미징

For almost 30 years, scientists have demonstrated that human fetal ICCs transplanted under the kidney capsule of nude mice matured into functioning ...

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신선한 수술 샘플에서 분리 및 인간의 심실 심근 기능 특성

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and ...

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The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly ...

Collection, Isolation, and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Samples

컬렉션, 격리, 인간 자궁 경부 샘플의 유세포 분석

Despite the public health importance of mucosal pathogens (including HIV), relatively little is known about mucosal immunity, particularly at the female ...

Quantitative Mass Spectrometric Profiling of Cancer-cell Proteomes Derived From Liquid and Solid Tumors

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In-depth analyses of cancer cell proteomes are needed to elucidate oncogenic pathomechanisms, as well as to identify potential drug targets and diagnostic ...

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