Name: expression and purification of virus-like particles for vaccination
Uploaded: 2016-06-02T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Expression and Purification of Virus-like Particles for Vaccination at JoVE.com

Vi ønsker å erkjenne de tidligere medlemmene av Ross lab som har hjulpet optimalisere protokoll for maksimal effektivitet og avkastning.

1. Pattedyr Expression System for generasjon av influensa H3N2 VLP <ol><li> Subklon viralt strukturelt glykoproteiner hemagglutinin (HA), neuraminidase (NA) og humant immunsviktvirus (HIV) Gag p55 inn i eukaryote ekspresjonsvektorer, slik som tidligere beskrevet pTR600. 7 </li><li> Forsterke DNA i kjemisk kompetente Escherichia coli (f.eks DH5a) og isolere transfeksjon-grade plasmid ved hjelp av et plasmid rensing kit i henhold til produsentens anvisninger. Mengde DNA er avhengig av avkastning og b...

<ol>
	<li>Zeltins, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+characterization+of+virus-like+particles:+a+review.">Construction and characterization of virus-like particles: a review.</a> Mol Biotechnol. 53, 92-107 (2013).</li><li>Jain, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formulation+and+stabilization+of+recombinant+protein+based+virus-like+particle+vaccines.">Formulation and stabilization of recombinant protein based virus-like particle vaccines.</a> Adv Drug Deliv Rev. , (2014).</li><li>Mair, C. M., Ludwig, K., Herrmann, A., Sieben, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+binding+and+pH+stability+-+how+influenza+A+virus+hemagglutinin+affects+host-specific+virus+infection.">Receptor binding and pH stability - how influenza A virus hemagglutinin affects host-specific virus infection.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1838, 1153-1168 (2014).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engerix-B+package+insert.">Engerix-B package insert.</a> GlaxoSmithKline, Research Triangle Park, NC. , (2013).</li><li>Giles, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+computationally+optimized+hemagglutinin+virus-like+particle+vaccine+elicits+broadly+reactive+antibodies+that+protect+nonhuman+primates+from+H5N1+infection.">A computationally optimized hemagglutinin virus-like particle vaccine elicits broadly reactive antibodies that protect nonhuman primates from H5N1 infection.</a> J Infect Dis. 205, 1562-1570 (2012).</li><li>Giles, B. M., Ross, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+computationally+optimized+broadly+reactive+antigen+(COBRA)+based+H5N1+VLP+vaccine+elicits+broadly+reactive+antibodies+in+mice+and+ferrets.">A computationally optimized broadly reactive antigen (COBRA) based H5N1 VLP vaccine elicits broadly reactive antibodies in mice and ferrets.</a> Vaccine. 29, 3043-3054 (2011).</li><li>Green, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C3d+enhancement+of+neutralizing+antibodies+to+measles+hemagglutinin.">C3d enhancement of neutralizing antibodies to measles hemagglutinin.</a> Vaccine. 20, 242-248 (2001).</li><li>Bright, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-Clade+Protective+Immune+Responses+to+Influenza+Viruses+with+H5N1+HA+and+NA+Elicited+by+an+Influenza+Virus-Like+Particle.">Cross-Clade Protective Immune Responses to Influenza Viruses with H5N1 HA and NA Elicited by an Influenza Virus-Like Particle.</a> PLoS ONE. 3, e1501 (2008).</li><li>Yondola, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Budding+Capability+of+the+Influenza+Virus+Neuraminidase+Can+Be+Modulated+by+Tetherin.">Budding Capability of the Influenza Virus Neuraminidase Can Be Modulated by Tetherin.</a> J Virol. 85, 2480-2491 (2011).</li><li>Schneider-Ohrum, K., Ross, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-like+particles+for+antigen+delivery+at+mucosal+surfaces.">Virus-like particles for antigen delivery at mucosal surfaces.</a> Curr Top Microbiol Immunol. 354, 53-73 (2012).</li><li>Murawski, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Newcastle+disease+virus-like+particles+containing+respiratory+syncytial+virus+G+protein+induced+protection+in+BALB/c+mice,+with+no+evidence+of+immunopathology.">Newcastle disease virus-like particles containing respiratory syncytial virus G protein induced protection in BALB/c mice, with no evidence of immunopathology.</a> J Virol. 84, 1110-1123 (2010).</li><li>Quan, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viruslike+particle+vaccine+induces+protection+against+respiratory+syncytial+virus+infection+in+mice.">Viruslike particle vaccine induces protection against respiratory syncytial virus infection in mice.</a> J Infect Dis. 204, 987-995 (2011).</li><li>Ross, T. M., Tang, X., Lu, H. R., Olagnier, D., Kirchenbaum, G. A., Evans, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COBRA-Based+Dengue+Tetravalent+Vaccine+Elicits+Neutralizing+Antibodies+Against+All+Four+Dengue+Serotypes.">COBRA-Based Dengue Tetravalent Vaccine Elicits Neutralizing Antibodies Against All Four Dengue Serotypes.</a> J Vaccine Immunotechnology. 1 (7), (2014).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manual+for+the+Laboratory+Diagnosis+and+Virological+Surveillance+of+Influenza.">Manual for the Laboratory Diagnosis and Virological Surveillance of Influenza.</a> World Health Organization. , (2011).</li><li>Mitnaul, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Balanced+Hemagglutinin+and+Neuraminidase+Activities+Are+Critical+for+Efficient+Replication+of+Influenza+A+Virus.">Balanced Hemagglutinin and Neuraminidase Activities Are Critical for Efficient Replication of Influenza A Virus.</a> J Virol. 74, 6015-6020 (2000).</li><li>Jarvis, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Enzymology. 463, 191-222 (2009).</li><li>Pijlman, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enveloped+virus-like+particles+as+vaccines+against+pathogenic+arboviruses.">Enveloped virus-like particles as vaccines against pathogenic arboviruses.</a> Biotechnol J. 10, 659-670 (2015).</li><li>Park, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+efficacy+of+crude+virus-like+particle+vaccine+against+HPAI+H5N1+in+chickens+and+its+application+on+DIVA+strategy.">Protective efficacy of crude virus-like particle vaccine against HPAI H5N1 in chickens and its application on DIVA strategy.</a> Influenza Other Respir Viruses. 7, 340-348 (2013).</li><li>Gangadharan, D., Smith, J., Weyant, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosafety+Recommendations+for+Work+with+Influenza+Viruses+Containing+a+Hemagglutinin+from+the+A/goose/Guangdong/1/96+Lineage.+MMWR.+Recommendations+and+reports+:+Morbidity+and+mortality+weekly+report.">Biosafety Recommendations for Work with Influenza Viruses Containing a Hemagglutinin from the A/goose/Guangdong/1/96 Lineage. MMWR. Recommendations and reports : Morbidity and mortality weekly report.</a> Recommendations and reports / Centers for Disease Control. 62, 1-7 (2013).</li></ol>

Vi har brukt de teknikkene som er beskrevet ovenfor for å lykkes uttrykke og rense SVPs og VLP sammensatt av flere strukturelle proteiner av ulike patogener. Vanligvis bruker vi pattedyrekspresjonssystemer å generere våre VLP. Men i våre hender, pattedyr-celle avledet Chik VLP rentene var lave. Chik VLP utbyttet var mer robust når du bruker en rekombinant baculovirus-insektcellesystem. Generelt baculovirus-insektcellesystemer gir høyere mengder av rekombinante proteiner, noe som kan resultere fra de høyere cellet...

Viruslignende partikler (VLP) er en godkjent teknologi for humant vaksinasjon. Faktisk, noen av de mer moderne design lisensierte vaksiner, inkludert humant papillomavirus (HPV) og hepatitt Β (HepΒ) vaksiner benytter denne tilnærmingen. VLP-er dannet av strukturelle proteiner som er i stand til selv-sammenstillingen. De sammensatte partikler ligne virale morfologi, men kan ikke infisere eller reprodusere fordi de mangler virale genomer. VLP kan uttrykkes og renses fra en rekke prokaryote og eukaryote systemer. En gjennomgang av litteraturen viser at ulike uttrykks systemer er ansatt med følgende satser: bakterier - 28%, gjær - 20%, anlegg - 9%, insekt - 28%, og pattedyr - 15% en. Av notatet, er HPV-vaksiner basert på L1 kapsid protein som produseres i gjær (Gardasil) eller i et insekt celle system (Cervarix) 2. HepΒ vaksiner, Recombivax og Engerix-Β, blir også produsert i gjær, og er sammensatt av HepΒ overflateantigen 3, 4. Vi bruker pattedyr- og insektcelle-ekspresjonssystemer for å produsere VLP som krever ko-ekspresjon av flere strukturelle proteiner for montering. Vårt arbeid fokuserer på å designe, produsere og rensende VLP-baserte vaksiner mot menneskelige patogener: influensavirus, respiratorisk syncytialt virus (RSV), dengue virus (DENV), og chikungunya virus (CHIKV). Våre metoder er fleksibel nok til å tillate ko-ekspresjon av de flere strukturelle proteiner fra multiple ekspresjonsplasmider, eller et enkelt ekspresjonsplasmid (figur 1). Tidligere har vi produsert og renset H5N1 VLP samlet fra co-uttrykk av plasmider som koder influensa hemagglutinin (HA), neuraminidase (NA), og matrise (M1) i humane embryonale nyre 293T celler 5,6. Genene ble kodon-optimalisert for ekspresjon i pattedyrceller og klonet inn i pTR600, en eukaryot ekspresjonsvektor som inneholder cytomegalovirus-umiddelbar-tidlig promotor, pluss intron A for å initiere transcription av eukaryote innsatser og bovint veksthormon polyadenylering signal for terminering av transkripsjon 7. En lignende tilnærming ved hjelp av tre-plasmidet ko-ekspresjon av HA, NA (figur 1A) og en annen viral matriks-protein, HIV gag p55, ble benyttet for generering av human sesonginfluensa subtype H3N2 VLP i denne studien, og har vist seg å generere VLP av tilsvarende størrelse som influensa partikler 8. Selv om influensavaksiner overveiende fremkalle anti-HA-antistoffer, tilsetning av influensa-neuraminidase formidler sialidase-aktivitet for å muliggjøre VLP spirende fra transfekterte celler 9 og også presentere ytterligere immunogene mål. For å fremstille RSV-VLP, vi også valgt urelaterte kjerne av HIV Gag å utforme prototypiske vaksiner som presenterer utelukkende RSV overflate glykoproteiner for å ytterligere demonstrere fleksibilitet av VLP i formasjonen ved hjelp av HIV gag, som tidligere beskrevet og karakterisert ved elektronmikroskopi 6,10. andrehar tidligere vist at VLP presentere RSV-glykoproteiner kan settes sammen ved bruk av forskjellige virale komponenter fra Newcastle Disease Virus (NDV) 11, og influensa matrise 12. Full-lengde overflate-glykoprotein sekvenser ble anvendt i denne studien er å beholde innfødte konformasjoner som kan være nødvendige for funksjonell reseptor-binding og antistoffgjenkjenning assay ved enzymbundet immunosorbent assay (ELISA). Våre eksempler på bruk av enkle plasmid ekspresjonssystemer å generere partikler er DENV og CHIKV. I tilfelle av DENV, kan vi produsere subviral partikler (SVPs) uten kapsid i 293T-celler fra et enkelt plasmid inneholdende et PRM / E-strukturgenet ekspresjonskassett 13. Uttrykket SVP brukes til å betegne mangelen på en kjerne eller kapsidprotein i monteringen av virale strukturelle proteiner. Chik VLP kan også produseres ved hjelp av et enkelt plasmid som inneholder et CHIKV strukturgenet kassett, koding kapsidbindende og konvolutt proteiner, eller jegnsect celler ved å infisere med et rekombinant baculovirus som koder for den samme strukturelle gen kassett som er optimalisert for insektcelle uttrykket (figur 1 B - C). Sluttresultatet av uttrykket tilnærminger som er diskutert ovenfor er frigjøring av VLP inn i cellekulturmedium som kan deretter bli renset ved ultrasentrifugering gjennom en 20% glycerol pute. I denne rapporten presenterer vi metoder for å uttrykke og rense disse VLP fra pattedyr og insektcellesystemer.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="786">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Plasmid Maxi Kit</td>
			<td style="width:167px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">12163</td>
			<td style="width:247px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">DMEM</td>
			<td style="width:167px;">Cellgro</td>
			<td>10-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Lipofectamine</td>
			<td style="width:167px;">Life Technologies</td>
			<td>L3000075</td>
			<td>Lipofectamine 2000, Lipofectamine 3000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Opti-MEM I</td>
			<td style="width:167px;">Life Technologies</td>
			<td>31985062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Bac-to-Bac Baculovirus Expression System</td>
			<td style="width:167px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">10359-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Cimarec I 6 multipoint stirrer plate</td>
			<td style="width:167px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">50094596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Polyclear ultracentrifuge tubes</td>
			<td style="width:167px;">Seton</td>
			<td style="width:119px;">7025</td>
			<td>Confirm appropriate tubes for ultracentrifuge and bucket size</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Micro BCA Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:167px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">23235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Phosphate citrate buffer</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P4922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">o-phenylenediamine dihydrochloride&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P8287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">0.22 &#956;m vacuum filter top (500 mL)</td>
			<td style="width:167px;">Nalgene</td>
			<td style="width:119px;">569-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Glycerol</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">H2SO4</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">339741&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Sf-900 II SFM</td>
			<td style="width:167px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">10902-096</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression and purification of virus-like particles for vaccination

Viruslignende partikler (VLP) og subviral partikler (SVPs) er en alternativ tilnærming til virusvaksine design som gir fordelene av økt biosikkerhet og stabilitet over bruk av levende patogener. Ikke-smittsomme og selvsammen er VLP brukes til å presentere strukturelle proteiner som immunogener, utenom behovet for live patogener eller rekombinante virale vektorer for antigen levering. I denne artikkelen viser vi de ulike stadier av VLP design og utvikling for fremtidige applikasjoner i prekliniske dyreforsøk. Fremgangsmåten omfatter følgende trinn: valg av antigen, ekspresjon av antigenet på cellelinjen av valg, rensing av VLP / SVPs, og kvantifisering for antigen dosering. Vi demonstrerer bruk av både pattedyr- og insektcellelinjer for ekspresjon av de antigenene og vise hvordan metoder varierer i utbytte. Metodikken present kan gjelde for en rekke forskjellige patogener, og kan oppnås ved å erstatte de antigener med immunogent structural proteiner av brukerens mikroorganismen av interesse. VLP og SVPs bistå med antigen karakterisering og utvalg av de beste vaksinekandidater.

VLP rentene var variabel ved virusantigen konstruere design. I denne protokoll har vi demonstrert bruk av insekt og pattedyrceller for produksjon av SVP eller VLP i supernatanten og rensing ved hjelp av ultrasentrifugering. Fire undertyper av DENV PRM / E-strukturgenet ekspresjonskassetter ble anvendt for å konstruere versjonene av DENV SVPs (avgrenset som 1-4) i tabell 1, og viser et område mellom 1,1 til 2,6 mg av totalt protein i 0,6 ml volumer. For VLP som krever e...

Watch this Scientific Journal Video about Expression and Purification of Virus-like Particles for Vaccination at JoVE.com

Expression and Purification of Virus-like Particles for Vaccination

Her presenterer vi en protokoll for syntetisering av viruslignende partikler ved bruk av enten baculovirus eller pattedyrekspresjonssystemer, og ultrasentrifugering rensing. Denne meget tilpass tilnærming blir brukt til å identifisere virale antigener som vaksine mål på en sikker og fleksibel måte.

Uttrykk og rensing av viruslignende partikler for vaksinasjon

Virus-like particles (VLPs) and subviral particles (SVPs) are an alternative approach to viral vaccine design that offers the advantages of increased ...

Research

JoVE Journal

Biology

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Expression, Detergent Solubilization, and Purification of a Membrane Transporter, the MexB Multidrug Resistance Protein

Multidrug resistance (MDR), the ability of a cancer cell or pathogen to be resistant to a wide range of structurally and functionally unrelated ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Uttrykk og rensing av Cystisk fibrose transmembrane Conduktans Regulator Protein i Saccharomyces cerevisiae

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

Rensing av vitnemål og metabolitter fra<em&gt; Drosophila</em&gt; Heads

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Analyse av global RNA syntese på celle-nivå etter Hypoksi

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...