Name: expression and purification of virus-like particles for vaccination
Uploaded: 2016-06-02T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Expression and Purification of Virus-like Particles for Vaccination at JoVE.com

Vi vill erkänna tidigare medlemmar av Ross lab som har bidragit till att optimera protokollet för maximal effektivitet och avkastning.

1. Mammalian Expression System för generering av influensa H3N2 VLP <ol><li> Subklon viral strukturella glykoproteiner hemagglutinin (HA), neuraminidas (NA), och humant immunbristvirus (HIV) Gag p55 i eukaryota expressionsvektorer, såsom tidigare beskrivits pTR600. 7 </li><li> Amplifiera DNA i kemiskt kompetenta Escherichia coli (t.ex., DH5a) och isolera transfektion-grade plasmid med användning av en plasmid-reningskit enligt tillverkarens instruktioner. Mängden DNA är beroende av avkastninge...

<ol>
	<li>Zeltins, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+characterization+of+virus-like+particles:+a+review.">Construction and characterization of virus-like particles: a review.</a> Mol Biotechnol. 53, 92-107 (2013).</li><li>Jain, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formulation+and+stabilization+of+recombinant+protein+based+virus-like+particle+vaccines.">Formulation and stabilization of recombinant protein based virus-like particle vaccines.</a> Adv Drug Deliv Rev. , (2014).</li><li>Mair, C. M., Ludwig, K., Herrmann, A., Sieben, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+binding+and+pH+stability+-+how+influenza+A+virus+hemagglutinin+affects+host-specific+virus+infection.">Receptor binding and pH stability - how influenza A virus hemagglutinin affects host-specific virus infection.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1838, 1153-1168 (2014).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engerix-B+package+insert.">Engerix-B package insert.</a> GlaxoSmithKline, Research Triangle Park, NC. , (2013).</li><li>Giles, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+computationally+optimized+hemagglutinin+virus-like+particle+vaccine+elicits+broadly+reactive+antibodies+that+protect+nonhuman+primates+from+H5N1+infection.">A computationally optimized hemagglutinin virus-like particle vaccine elicits broadly reactive antibodies that protect nonhuman primates from H5N1 infection.</a> J Infect Dis. 205, 1562-1570 (2012).</li><li>Giles, B. M., Ross, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+computationally+optimized+broadly+reactive+antigen+(COBRA)+based+H5N1+VLP+vaccine+elicits+broadly+reactive+antibodies+in+mice+and+ferrets.">A computationally optimized broadly reactive antigen (COBRA) based H5N1 VLP vaccine elicits broadly reactive antibodies in mice and ferrets.</a> Vaccine. 29, 3043-3054 (2011).</li><li>Green, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C3d+enhancement+of+neutralizing+antibodies+to+measles+hemagglutinin.">C3d enhancement of neutralizing antibodies to measles hemagglutinin.</a> Vaccine. 20, 242-248 (2001).</li><li>Bright, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-Clade+Protective+Immune+Responses+to+Influenza+Viruses+with+H5N1+HA+and+NA+Elicited+by+an+Influenza+Virus-Like+Particle.">Cross-Clade Protective Immune Responses to Influenza Viruses with H5N1 HA and NA Elicited by an Influenza Virus-Like Particle.</a> PLoS ONE. 3, e1501 (2008).</li><li>Yondola, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Budding+Capability+of+the+Influenza+Virus+Neuraminidase+Can+Be+Modulated+by+Tetherin.">Budding Capability of the Influenza Virus Neuraminidase Can Be Modulated by Tetherin.</a> J Virol. 85, 2480-2491 (2011).</li><li>Schneider-Ohrum, K., Ross, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-like+particles+for+antigen+delivery+at+mucosal+surfaces.">Virus-like particles for antigen delivery at mucosal surfaces.</a> Curr Top Microbiol Immunol. 354, 53-73 (2012).</li><li>Murawski, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Newcastle+disease+virus-like+particles+containing+respiratory+syncytial+virus+G+protein+induced+protection+in+BALB/c+mice,+with+no+evidence+of+immunopathology.">Newcastle disease virus-like particles containing respiratory syncytial virus G protein induced protection in BALB/c mice, with no evidence of immunopathology.</a> J Virol. 84, 1110-1123 (2010).</li><li>Quan, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viruslike+particle+vaccine+induces+protection+against+respiratory+syncytial+virus+infection+in+mice.">Viruslike particle vaccine induces protection against respiratory syncytial virus infection in mice.</a> J Infect Dis. 204, 987-995 (2011).</li><li>Ross, T. M., Tang, X., Lu, H. R., Olagnier, D., Kirchenbaum, G. A., Evans, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COBRA-Based+Dengue+Tetravalent+Vaccine+Elicits+Neutralizing+Antibodies+Against+All+Four+Dengue+Serotypes.">COBRA-Based Dengue Tetravalent Vaccine Elicits Neutralizing Antibodies Against All Four Dengue Serotypes.</a> J Vaccine Immunotechnology. 1 (7), (2014).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manual+for+the+Laboratory+Diagnosis+and+Virological+Surveillance+of+Influenza.">Manual for the Laboratory Diagnosis and Virological Surveillance of Influenza.</a> World Health Organization. , (2011).</li><li>Mitnaul, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Balanced+Hemagglutinin+and+Neuraminidase+Activities+Are+Critical+for+Efficient+Replication+of+Influenza+A+Virus.">Balanced Hemagglutinin and Neuraminidase Activities Are Critical for Efficient Replication of Influenza A Virus.</a> J Virol. 74, 6015-6020 (2000).</li><li>Jarvis, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Enzymology. 463, 191-222 (2009).</li><li>Pijlman, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enveloped+virus-like+particles+as+vaccines+against+pathogenic+arboviruses.">Enveloped virus-like particles as vaccines against pathogenic arboviruses.</a> Biotechnol J. 10, 659-670 (2015).</li><li>Park, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+efficacy+of+crude+virus-like+particle+vaccine+against+HPAI+H5N1+in+chickens+and+its+application+on+DIVA+strategy.">Protective efficacy of crude virus-like particle vaccine against HPAI H5N1 in chickens and its application on DIVA strategy.</a> Influenza Other Respir Viruses. 7, 340-348 (2013).</li><li>Gangadharan, D., Smith, J., Weyant, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosafety+Recommendations+for+Work+with+Influenza+Viruses+Containing+a+Hemagglutinin+from+the+A/goose/Guangdong/1/96+Lineage.+MMWR.+Recommendations+and+reports+:+Morbidity+and+mortality+weekly+report.">Biosafety Recommendations for Work with Influenza Viruses Containing a Hemagglutinin from the A/goose/Guangdong/1/96 Lineage. MMWR. Recommendations and reports : Morbidity and mortality weekly report.</a> Recommendations and reports / Centers for Disease Control. 62, 1-7 (2013).</li></ol>

Vi har använt den teknik som beskrivs ovan för att framgångsrikt uttrycka och rena direktörerna och VLP sammansatta av flera strukturella proteiner för olika patogener. I allmänhet använder vi däggdjursexpressionssystem för att generera våra VLP. Men i våra händer, som härrör från däggdjur-cell Chik VLP avkastningen var låg. CHIK VLP Utbytet var mer robust när man använder ett rekombinant baculovirus-insektscellsystem. I allmänhet, baculovirus-insektscellsystem ger större mängder av rekombinanta pr...

Virusliknande partiklar (VLP) är en godkänd teknik för mänsklig vaccination. Faktum är att vissa av de mer contemporarily licensierade vacciner, inklusive humant papillomvirus (HPV) och hepatit Β (HepΒ) vacciner använder detta tillvägagångssätt. VLP bildas av strukturproteiner kan självorganisering. De monterade partiklarna härma virus morfologier, men kan inte infektera eller replikera eftersom de saknar virala genom. VLP kan uttryckas och renas från ett antal prokaryota och eukaryota system. En genomgång av litteraturen visar att olika uttryckssystem används på följande priser: bakterier - 28%, jäst - 20%, växt - 9%, insekt - 28%, och däggdjurs - 15% 1. Notera är HPV-vacciner baserade på L1 kapsidproteinet produceras i jäst (Gardasil) eller i ett insektscellsystem (Cervarix) 2. HepΒ vacciner, Recombivax och Engerix-Β, är också produceras i jäst, och är sammansatta av HepΒ ytantigen 3, 4. Vi använder däggdjurs- och insektscellexpressionssystem för att producera VLP som kräver samexpression av multipla strukturella proteiner för montering. Vårt arbete är inriktat på design, produktion och rening av VLP-baserade vacciner mot humana patogener: influensavirus, respiratoriskt syncytialvirus (RSV), denguevirus (DENV), och chikungunyaen virus (CHIKV). Våra metoder är tillräckligt flexibla för att medge samuttryck av de multipla strukturproteiner från flera expressionsplasmider, eller en enda expressionsplasmid (Figur 1). Tidigare har vi producerat och renat H5N1 VLP sammansatta från samexpression av plasmider som kodar influensa hemagglutinin (HA), neuraminidas (NA), och matrisen (M1) i humana embryonala njur 293T-celler 5,6. Generna kodon-optimerad för uttryck i däggdjursceller och klonades i pTR600, en eukaryot expressionsvektor innehållande de cytomegalovirus omedelbar-tidig promotor plus intron A för att initiera transcription av eukaryota skär och bovint tillväxthormon polyadenyleringssignal för terminering av transkription 7. Ett liknande tillvägagångssätt med hjälp av tre-plasmiden samexpression av HA, NA (figur 1A) och en alternativ viral matrisprotein, HIV Gag p55, användes för generering av mänskligt säsongsinfluensa subtyp H3N2 VLP i denna studie och har visat sig generera VLP av liknande storlek som partiklar influensa 8. Även influensavacciner övervägande framkalla anti-HA-antikroppar, tillsättning av influensa neuraminidas förmedlar sialidasaktivitet att möjliggöra VLP spirande från transfekterade celler 9 och även medföra ytterligare immunogena mål. För att producera RSV VLP, vi valde också den obesläktade kärnan av HIV Gag att utforma prototypiska vacciner som uppvisar uteslutande RSV ytglykoproteiner att ytterligare demonstrera flexibiliteten hos VLP bildning med användning av HIV Gag, såsom tidigare beskrivits, och som kännetecknas av elektronmikroskopi 6,10. andrahar tidigare visat att VLP presenterar RSV glykoproteiner kan monteras med hjälp av olika virala komponenter från Newcastlesjuka-virus (NDV) 11, och influensa matris 12. Fullängds ytglykoprotein sekvenser användes i denna studie att behålla nativa konformationer som kan vara nödvändiga för funktionell receptorbindning och antikroppsanalys erkännande genom enzymkopplad immunosorbentanalys (ELISA). Våra exempel för användning av enstaka plasmid expressionssystem för att generera partiklar är DENV och CHIKV. I fallet med DENV, kan vi producera subvirala partiklar (direktörerna) med ingen kapsid i 293T-celler från en enda plasmid innehållande en prM / E-strukturgenen expressionskassett 13. Termen SVP används för att beteckna att det saknas en kärna eller kapsidprotein vid montering av virala strukturella proteiner. CHIK VLP kan också framställas med användning av en enda plasmid innehållande en CHIKV strukturell gen kassett, som kodar för kapsid-och höljesproteiner, eller i insect celler genom infektering med ett rekombinant baculovirus som kodar för samma strukturella genkassetten optimerad för insektscelluttryck (Figur 1B - C). Slutresultatet av uttrycket tillvägagångssätt diskuteras ovan är frisättningen av VLP in i cellodlingsmedium som sedan kan renas via ultracentrifugering genom en glycerolkudde 20%. I denna rapport presenterar vi metoder för att uttrycka och rena dessa VLP från däggdjurs- och insektscellsystem.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="786">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Plasmid Maxi Kit</td>
			<td style="width:167px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">12163</td>
			<td style="width:247px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">DMEM</td>
			<td style="width:167px;">Cellgro</td>
			<td>10-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Lipofectamine</td>
			<td style="width:167px;">Life Technologies</td>
			<td>L3000075</td>
			<td>Lipofectamine 2000, Lipofectamine 3000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Opti-MEM I</td>
			<td style="width:167px;">Life Technologies</td>
			<td>31985062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Bac-to-Bac Baculovirus Expression System</td>
			<td style="width:167px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">10359-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Cimarec I 6 multipoint stirrer plate</td>
			<td style="width:167px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">50094596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Polyclear ultracentrifuge tubes</td>
			<td style="width:167px;">Seton</td>
			<td style="width:119px;">7025</td>
			<td>Confirm appropriate tubes for ultracentrifuge and bucket size</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Micro BCA Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:167px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">23235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Phosphate citrate buffer</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P4922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">o-phenylenediamine dihydrochloride&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P8287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">0.22 &#956;m vacuum filter top (500 mL)</td>
			<td style="width:167px;">Nalgene</td>
			<td style="width:119px;">569-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Glycerol</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">H2SO4</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">339741&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Sf-900 II SFM</td>
			<td style="width:167px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">10902-096</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression and purification of virus-like particles for vaccination

Virusliknande partiklar (VLP) och subvirala partiklar (direktörerna) är ett alternativ till viralt vaccin design som erbjuder fördelarna med ökad biosäkerhet och stabilitet över användningen av levande patogener. Icke-infektiös och självsamlande, VLP används för att presentera strukturella proteiner som immunogener, förbi behovet av levande patogener eller rekombinanta virusvektorer för antigenleverans. I den här artikeln visar vi de olika stadierna av VLP design och utveckling för framtida tillämpningar inom preklinisk djurförsök. Förfarandet innefattar följande steg: val av antigen, uttryck av antigen i cellinje val, rening av VLP / direktörerna och kvantifiering för antigen dosering. Vi visar användning av både däggdjurs- och insektscellinjer för uttryckning av våra antigener och visa hur metoder skiljer sig i utbyte. Den metod som presenteras kan tillämpas på en mängd olika patogener och kan åstadkommas genom att ersätta antigenerna med immunogen structural proteiner av användarens mikroorganismen av intresse. VLP och direktörerna hjälpa till med antigen karakterisering och urval av de bästa vaccinkandidater.

VLP avkastningen var variabel genom virusantigen konstruktion design. I detta protokoll har vi visat användning av insekts- och däggdjursceller för produktion av SVP eller VLP i supernatanten och rening genom ultracentrifugering. Fyra subtyper av DENV prM / E strukturella genuttryck kassetter användes för att konstruera de versioner av DENV direktörerna (avgränsade som 1-4) i tabell 1 och visar ett område mellan 1,1 till 2,6 mg totalt protein i 0,6 ml volymer. F?...

Watch this Scientific Journal Video about Expression and Purification of Virus-like Particles for Vaccination at JoVE.com

Expression and Purification of Virus-like Particles for Vaccination

Här presenterar vi ett protokoll för syntes av virusliknande partiklar med hjälp av antingen baculovirus eller däggdjursexpressionssystem, och ultracentrifuge rening. Detta mycket anpassningsbar metod används för att identifiera virala antigener som vaccin mål på ett säkert och flexibelt sätt.

Expression och rening av virusliknande partiklar för Vaccination

Virus-like particles (VLPs) and subviral particles (SVPs) are an alternative approach to viral vaccine design that offers the advantages of increased ...

Research

JoVE Journal

Biology

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

Beredningen av primära hematopoietisk cell kulturer från Murine Bone Marrow för elektroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

Färgning av proteinerna i geler med Coomassie G-250 utan organiska lösningsmedel och ättiksyra

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

Hjälp av ett automatiserat celltalsräknare att förenkla Studier Gene Expression: siRNA Knockdown av IL-4 beroende genuttryck i Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Expression, Detergent Solubilization, and Purification of a Membrane Transporter, the MexB Multidrug Resistance Protein

Expression, tvättmedel Lösningsgörande, och rening av ett membran transportören, MexB multidrogresistensgenen Protein

Multidrug resistance (MDR), the ability of a cancer cell or pathogen to be resistant to a wide range of structurally and functionally unrelated ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Paraffininbäddade och frysta snitt av Drosophila Vuxen Muskler

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Beredning av Active T. castaneum Telomeras

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Expression och rening av den cystisk fibros transmembran konduktans-regulator protein i Saccharomyces cerevisiae

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

Rening av Transkript och metaboliter från<em&gt; Drosophila</em&gt; Heads

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Analys av global RNA syntes vid den inre cellnivå efter Hypoxi

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...