Name: one-step negative chromatographic purification of helicobacter pylori neutrophil-activating protein overexpressed in escherichia coli in batch mode
Uploaded: 2016-06-18T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode at JoVE.co

We thank Dr. Chao-Sheng Cheng at National Tsing Hua University, Taiwan, for performing the circular dichroism measurement. We also thank Drs. Evanthia Galanis and Ianko D. Iankov at Mayo Clinic, USA, for providing the anti-HP-NAP monoclonal antibody. We appreciate Drs. Han-Wen Chang and Chung-Chu Chen at Mackay Memorial Hospital, Hsinchu, Taiwan, for providing advice for IRB application, Mr. Te-Lung Tsai at the Mackay Memorial Hospital, Hsinchu, Taiwan, for supervising the analysis of isolated neutrophils, and Ms. Ju-Chen Weng at National Tsing Hua University, Taiwan, for her technical assistance. This work was supported by grants from the Ministry of Science and Technology of Taiwan (MOST 104-2311-B-007-003, NSC101-2311-B-007-007 and NSC98-2311-B-007-006-MY3), the Joint Research Program of National Tsing Hua University and Mackay Memorial Hospital (100N7727E1, 101N2727E1, 103N2773E1), and the research program of National Tsing Hua University (104N2052E1).

मानव रक्त पूर्व लिखित सूचित सहमति और राष्ट्रीय Tsing हुआ विश्वविद्यालय की संस्थागत समीक्षा बोर्ड, सिंचु, ताइवान से अनुमोदन के साथ स्वस्थ स्वयंसेवकों से एकत्र किया गया था। 1. ई में संयोजक एचपी झपकी क?...

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	<li>Brunette, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+3,+Infectious+diseases+related+to+travel.">Chapter 3, Infectious diseases related to travel.</a> CDC Health Information for International Travel 2016. , (2015).</li><li>Bauer, B., Meyer, T. 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यहाँ प्रस्तुत DEAE आयनों विनिमय रेजिन के साथ नकारात्मक मोड बैच क्रोमैटोग्राफी पुनः संयोजक एचपी झपकी ई कोलाई में overexpressed की शुद्धि के लिए उपयुक्त है। सेल और शुद्धि के चरणों में इस्तेमाल किया बफ़र्स का प?...

हेलिकोबेक्टर (एच पाइलोरी) gastritis और पेप्टिक अल्सर का एक प्रमुख कारण है। यह जीवाणु भी कर्क, विश्व स्वास्थ्य संगठन की ओर से अनुसंधान के लिए अंतरराष्ट्रीय एजेंसी से मानव में एक कैसरजन के रूप में वर्गीकृत किया गया है, 1994 में यह अनुमान लगाया गया है कि एच के प्रसार पाइलोरी संक्रमण विकासशील देशों में 70% और औद्योगिक देशों 1 में 30-40% है। हालांकि एच के संक्रमण की दर पाइलोरी औद्योगिक देशों में कम हो रही है, एच के संक्रमण की दर विकासशील देशों में पाइलोरी अभी भी उच्च 2 है। मानक उपचार एच उन्मूलन के लिए पाइलोरी संक्रमण एक प्रोटॉन पंप अवरोध, पल्स पोलियो टीकाकरण, और दो ​​एंटीबायोटिक दवाओं, clarithromycin प्लस amoxicillin या metronidazole 3 के प्रशासन के होते हैं। हालांकि, एच में एंटीबायोटिक प्रतिरोध का उदय पाइलोरी संबंधित अल्सर चिकित्सा नई रणनीति ओ को रोकने के लिए के विकास का आग्रहआर संक्रमण का इलाज। एच के खिलाफ निवारक और / या चिकित्सीय टीकाकरण का विकास पाइलोरी एक वैकल्पिक दृष्टिकोण एच नियंत्रित करने के लिए प्रदान कर सकता है पाइलोरी संक्रमण। हेलिकोबेक्टर न्यूट्रोफिल सक्रिय प्रोटीन (एचपी-एनएपी), एच पायलोरी का एक प्रमुख कारक डाह, पहले एच के पानी के अर्क में पहचान की गई थी कोशिकाओं endothelial और प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) 4 का उत्पादन करने के लिए पालन करने के लिए न्यूट्रोफिल को सक्रिय करने की क्षमता के साथ पाइलोरी। आमाशय mucosa की न्युट्रोफिल घुसपैठ एच में पाया pylori- सक्रिय gastritis के साथ संक्रमित रोगियों पेट की सूजन और ऊतकों को नुकसान हो सकता है। इस प्रकार, हिमाचल प्रदेश झपकी गैस्ट्रिक सूजन है, जो आगे अल्सर या एच कारण बनता प्रेरित करने के लिए न्यूट्रोफिल सक्रिय द्वारा एक रोग भूमिका निभा सकते हैं पाइलोरी गैस्ट्रिक रोगों -associated। फिर भी, हिमाचल प्रदेश झपकी नैदानिक ​​अनुप्रयोगों 5,6 के लिए एक संभावित उम्मीदवार हैं। immunogenic और इम्यूनोमॉड्यूलेटरी समर्थक के कारणहिमाचल प्रदेश झपकी के perties, इस प्रोटीन टीकों, चिकित्सकीय एजेंटों, और नैदानिक ​​उपकरण विकसित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। एक चिकित्सीय परीक्षण एच के खिलाफ एक प्रोटीन वैक्सीन के घटकों में से एक के रूप में पुनः संयोजक एचपी झपकी प्रयोग करने के लिए आयोजित किया गया है पाइलोरी। यह टीका पुनः संयोजक एचपी-झपकी, cytotoxin जुड़े जीन एक (CagA), और vacuolating cytotoxin एक (Vaca) प्रोटीन एल्यूमीनियम हीड्राकसीड के साथ तैयार होते हैं और आगे सुरक्षित और मनुष्यों 7 में immunogenic होने का प्रदर्शन किया गया है। इसके अलावा, हिमाचल प्रदेश झपकी (Th1) टी सहायक टाइप 1 को गति प्रदान करने के लिए एक शक्तिशाली immunomodulator रूप में कार्य करता कैंसर के उपचार के लिए 8 प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया -polarized और नीचे Th2 की मध्यस्थता प्रतिरक्षा एलर्जी और परजीवी के संक्रमण 9,10 द्वारा हासिल प्रतिक्रियाओं को विनियमित करने के लिए। निदान के लिए के रूप में, पुनः संयोजक एचपी झपकी आधारित एलिसा एच में हिमाचल प्रदेश झपकी के खिलाफ सीरम एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए लागू किया गया है पाइलोरी रोगियों 11 -infected। एक अध्ययन में पता चला है कि एच से सीरा में हिमाचल प्रदेश झपकी विशिष्ट एंटीबॉडी का स्तर PYलोरी -infected गैस्ट्रिक कैंसर के रोगियों क्रोनिक gastritis के साथ 12 रोगियों से तुलना में काफी अधिक था। एक अन्य अध्ययन में यह भी पता चला है कि हिमाचल प्रदेश झपकी के खिलाफ सीरम एंटीबॉडी गैर हृदय गैस्ट्रिक ग्रंथिकर्कटता 13 की उपस्थिति के साथ जुड़े रहे हैं। इस प्रकार, पुनः संयोजक एचपी झपकी आधारित एलिसा एच में गैस्ट्रिक कैंसर के रोग का निदान के लिए हिमाचल प्रदेश झपकी के खिलाफ सीरम एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए लागू किया जा सकता है पाइलोरी रोगियों -infected। साथ में ले ली, शुद्ध हिमाचल प्रदेश झपकी आगे की रोकथाम, इलाज के लिए उपयोग किया जा सकता है, और एच के रोग का निदान पाइलोरी रोगों के साथ ही कैंसर के उपचार -associated। कई पुनः संयोजक एचपी झपकी की शुद्धि के लिए इस्तेमाल किया तरीकों के अलावा अपने मूल रूप में कोलाई (ई कोलाई) में व्यक्त अब तक की सूचना दी, एक दूसरे शुद्धि कदम से जुड़े जेल निस्पंदन क्रोमैटोग्राफी अत्यधिक शुद्ध हिमाचल प्रदेश झपकी 14-16 प्राप्त करने के लिए की जरूरत है । इधर, एक विधि के साथ नकारात्मक मोड बैच क्रोमैटोग्राफी का उपयोगdiethylaminoethyl (DEAE) आयन एक्सचेंज रेजिन हिमाचल प्रदेश झपकी की शुद्धि ई में overexpressed के लिए वर्णित है उच्च उपज और उच्च शुद्धता के साथ कोलाई। यह शोधन तकनीक मेजबान कोशिका प्रोटीन और / या राल के लिए हिमाचल प्रदेश झपकी के अलावा अन्य अशुद्धियों के बंधन पर आधारित था। पीएच 8.0 से कम, हिमाचल प्रदेश झपकी को छोड़कर लगभग कोई अन्य प्रोटीन अपार अंश से बरामद कर रहे हैं। इस शुद्धि नकारात्मक मोड में DEAE आयन एक्सचेंज क्रोमैटोग्राफी का उपयोग दृष्टिकोण सरल और समय अनबाउंड अंश का संग्रह के माध्यम से एक कदम क्रोमैटोग्राफी के माध्यम से पुनः संयोजक एचपी झपकी की शुद्धि की अनुमति देकर की बचत है। HP-झपकी, कई अन्य biomolecules, इस तरह के 17, immunoglobulin जी (आईजीजी) 18, हीमोग्लोबिन 19, प्रोटीन फॉस्फेट 20, और डाह कारक flagellin 21 वायरस के रूप में, यह भी नकारात्मक आयन एक्सचेंज क्रोमैटोग्राफी द्वारा शुद्ध किया जा करने के लिए सूचित किया गया है के अलावा मोड। नकारात्मक मोड आयन एक्सचेंज क्रोमैटोग्राफी के लिए पसंद किया जाता है, तो दोष छोटे हैंनमूना अधीन में मौजूद घटक 22 शुद्ध किया जा सके। प्राकृतिक या पुनः संयोजक biomolecules की शुद्धि में नकारात्मक क्रोमैटोग्राफी के आवेदन हाल ही में 23 की समीक्षा की गई है। वर्तमान रिपोर्ट ई में पुनः संयोजक एचपी झपकी की अभिव्यक्ति के लिए कदम प्रोटोकॉल के द्वारा एक कदम प्रदान करता है कोलाई, हिमाचल प्रदेश झपकी DEAE आयन एक्सचेंज रेजिन के साथ नकारात्मक मोड बैच क्रोमैटोग्राफी का उपयोग करने की कोशिकाओं की सेल, और शुद्धि। एक प्रोटीन शुद्धि के लिए वांछित नकारात्मक मोड में आयन एक्सचेंज क्रोमैटोग्राफी के लिए उपयुक्त है, तो वर्णित प्रोटोकॉल भी एक शुद्धिकरण की प्रक्रिया के विकास के लिए एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में रूपांतरित किया जा सकता है।

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET42a-NAP&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>prepared as described in Supplementary data of Refernce 15&#160; 
			http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0006291X08018317</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli BL21 (DE3)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc</td>
			<td>C6000-03</td>
			<td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/C600003</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>25389-94-0</td>
			<td>http://www.amresco-inc.com/KANAMYCIN-SULFATE-0408.cmsx</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>MD Biomedical Inc</td>
			<td>101-367-93-1</td>
			<td>http://www.antibody-antibodies.com/product_det.php?id=238064&#38;supplier=search&#38;name =IPTG%20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10837091001</td>
			<td>protease inhibitor 
			http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/PMSFRO?lang=en&#38;region=TW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-alpha-tosyl-L-lysinyl-chloromethylketone (TLCK)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7254</td>
			<td>protease inhibitor 
			http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t7254?lang=en&#38;region=TW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-tosyl-L-phenylalaninyl-chloromethylketone (TPCK)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4376</td>
			<td>protease inhibitor 
			http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t4376?lang=en&#38;region=TW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad protein assay dye reagent concentrate</td>
			<td>Bio&#8208;Rad</td>
			<td>500-0006</td>
			<td>for protein quantitation 
			http://www.bio-rad.com/en-us/sku/5000006-bio-rad-protein-assay-dye-reagent-concentrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein standard (bovine serum albumin)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5619&#160;</td>
			<td>a standard protein for Bio-Rad Protein Assay 
			http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/p5619?lang=en&#38;region=TW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEAE&#8211;Sephadex &#160;A-25 chloride form</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A25120</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a25120?lang=en&#38;region=TW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrum/Por dialysis tubing</td>
			<td>Spectrum Laboratories</td>
			<td>132720</td>
			<td>with molecular weight cutoff of 14 kDa 
			http://www.spectrumlabs.com/dialysis/RCtubing.html?Pn=132720;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrodisc&#174; units with Mustang&#174; E membrane</td>
			<td>Pall</td>
			<td>MSTG25E3</td>
			<td>for endotoxin removal; operated at flow rates ranging from 1 to 4 ml/min 
			http://www.pall.com/main/laboratory/product.page?id=19992</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse monoclonal antibody MAb 16F4</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>raised against the purified HP-NAP of H. pylori strain NCTC 11637 as described in Refernce 23;&#160; A gift from Drs. Evanthia Galanis and Ianko D. Iankov at Mayo Clinic, USA 
			http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0264410X10017585</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiLoad 16/600 Superdex 200 pg</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>28989335</td>
			<td>for gel filtration chromatography 
			http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/28989335</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PlusOne silver staining kit, protein</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17-1150-01</td>
			<td>http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/17115001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque PLUS</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17-1440-02</td>
			<td>for density gradient centrifugation to purify human neutrophils 
			http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences-tw/products/AlternativeProductStructure _16963/17144002</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat bottom 96-well white plate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc</td>
			<td>236108</td>
			<td>http://www.thermoscientific.com/en/product/nunc-f96-microwell-black-white-polystyrene-plate.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8511</td>
			<td>protected from light 
			http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a8511?lang=en&#38;region=TW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Expand &#160;long template PCR system</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11681834001</td>
			<td>source of High Fidelity PCR enzyme mix 
			http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/elongro?lang=en&#38;region=TW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dpn I</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0176S</td>
			<td>https://www.neb.com/products/r0176-dpni</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xho I</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0146S</td>
			<td>https://www.neb.com/products/r0146-xhoi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli DH5&#945;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc</td>
			<td>18265-017</td>
			<td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/18265017</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Product Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td> 
			&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-2800 double beam UV/VIS spectrophotometer</td>
			<td>Hitachi&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td>out of market and upgraded to a new model 
			http://hitachi-hta.com/products/life-sciences-chemical-analysis/uvvisible-spectrophotometers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EmulsiFlex-C3 high pressure homogenizer</td>
			<td>Avestin Inc</td>
			<td>C315320</td>
			<td>http://www.avestin.com/English/c3page.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hitachi Koki himac CP80WX general ultracentrifuge</td>
			<td>Hitachi Koki Co</td>
			<td>90106401</td>
			<td>for separation of the soluble and insoluble protein fractions from E. coli lysates 
			http://centrifuges.hitachi-koki.com/products/ultra/cp_wx/cp_wx.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;KTA FPLC</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>18-1900-26</td>
			<td>for gel filtration chromatography 
			http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/18190026</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aviv model 62ADS CD spectrophotometer</td>
			<td>Aviv Biomedical</td>
			<td>N/A</td>
			<td>out of market and upgraded to a new model 
			http://www.avivbiomedical.com/circular.php</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS-3000 imaging system</td>
			<td>Fujifilm</td>
			<td>N/A</td>
			<td>discontinued and replaced 
			http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/28955810</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wallac 1420 (Victor2) multilabel counter</td>
			<td>Perkin-Elmer</td>
			<td>1420-018</td>
			<td>for chemiluminescence detection 
			http://www.perkinelmer.com/catalog/product/id/1420-018</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

one-step negative chromatographic purification of helicobacter pylori neutrophil-activating protein overexpressed in escherichia coli in batch mode

हेलिकोबेक्टर न्यूट्रोफिल सक्रिय प्रोटीन (एचपी-एनएपी) हेलिकोबेक्टर (एच पाइलोरी) के एक प्रमुख विषैलापन कारक है। यह एच में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है पाइलोरी न्यूट्रोफिल, monocytes, और मस्तूल कोशिकाओं सहित कई जन्मजात ल्यूकोसाइट्स को सक्रिय करने से आमाशय सूजन प्रेरित। हिमाचल प्रदेश झपकी के immunogenic और इम्यूनोमॉड्यूलेटरी गुण यह एच के लिए एक संभावित निदान और टीका उम्मीदवार बनाना पाइलोरी और कैंसर के उपचार के लिए एक नई दवा उम्मीदवार। आदेश शुद्ध हिमाचल प्रदेश झपकी अपनी नैदानिक ​​अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल की पर्याप्त मात्रा में प्राप्त करने के लिए, एक कारगर तरीका शुद्ध करने के लिए उच्च उपज और पवित्रता के साथ इस प्रोटीन की स्थापना की जानी चाहिए। इस प्रोटोकॉल में, हम diethylaminoethyl (DEAE) आयन एक्सचेंज रेजिन का उपयोग करके पुनः संयोजक एचपी झपकी कोलाई (ई कोलाई) में overexpressed से एक कदम नकारात्मक chromatographic शुद्धि के लिए एक विधि का वर्णन किया है (जैसे।, Sephadex) मैंn बैच मोड। संयोजक एचपी झपकी ई में कुल प्रोटीन का लगभग 70% का गठन किया कोलाई और लगभग पूरी तरह से पीएच 9.0 पर सेल पर घुलनशील अंश में बरामद किया है। पीएच 8.0 पर इष्टतम स्थिति के अंतर्गत, हिमाचल प्रदेश झपकी के बहुमत अनबाउंड अंश में बरामद किया है, जबकि ई से अंतर्जात प्रोटीन कोलाई कुशलता राल से हटा रहे हैं। DEAE आयन एक्सचेंज रेजिन के साथ नकारात्मक मोड बैच क्रोमैटोग्राफी का उपयोग इस शोधन विधि पैदावार ई से कार्यात्मक हिमाचल प्रदेश झपकी उच्च उपज और पवित्रता के साथ अपने मूल रूप में कोलाई। शुद्ध हिमाचल प्रदेश झपकी आगे की रोकथाम, इलाज के लिए उपयोग किया जा सकता है, और एच के रोग का निदान पाइलोरी रोगों के साथ ही कैंसर के उपचार -associated।

पुनः संयोजक एचपी झपकी के नकारात्मक शुद्धि की प्रयोगात्मक प्रक्रिया के योजनाबद्ध आरेख ई में व्यक्त किया कोलाई बैच मोड में DEAE आयन एक्सचेंज रेजिन का उपयोग करके चित्र 1 में दिखाय?...

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One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

पुनः संयोजक हेलिकोबैक्टर से एक कदम नकारात्मक शुद्धि के लिए एक उच्च उपज विधि बैच मोड में diethylaminoethyl रेजिन का उपयोग वर्णित है के द्वारा न्यूट्रोफिल सक्रिय प्रोटीन (एचपी-एनएपी) कोलाई में overexpressed पाइलोरी। हिमाचल प्रदेश झपकी इस विधि द्वारा शुद्ध टीके, दवाओं, या एच के लिए निदान के विकास के लिए फायदेमंद है पाइलोरी रोगों -associated।

एक कदम की नकारात्मक Chromatographic शोधन<em&gt; हेलिकोबेक्टर</em&gt; न्युट्रोफिल सक्रिय प्रोटीन में overexpressed<em&gt; कोलाई</em&gt; बैच मोड में

Helicobacter pylori neutrophil-activating protein (HP-NAP) is a major virulence factor of Helicobacter pylori (H. pylori). It plays a critical role in H. ...

The overall goal of this purification is to yield functional Helicobacter pylori Neutrophil-activating protein or HP-NAP in its native form with high purity and high yield using negative mode batch chromatography with di-ethyl amino-ethyl ion exchange resin. The main advantage of this technique is that HP-NAP can be purified in its native form in one step with high purity and high yield. Negative purification of HP-NAP starts with a batch binding procedure in which the soluble protein fraction from bacterial lysates is added to DEAE resin.The mixture is incubated to allow wholesale proteins to bind to the resin. HP-NAP present in the unbound fraction is then obtained by centrifugation of gravity flow. The implications of this technique is 10:1 prevention treatment and prognostic of Helicobacter pylori associated diseases as well as cancer therapy.Because of the immunogenic and immunomodulatory properties of HP-NAP. Generally, individuals new to this method will struggle. Because HP-NAP easily aggregates during the sterilization.Demonstrating the procedure will be Zhi-Wei Hong, a graduate student from our lab. Working at four degrees Celsius, we suspend 50 milliliters of the cell palate prepared as described in the text protocol in 20 milliliters of low salt, tris-buffer at pH 9.0 with protease inhibitor mixture. It's critical to keep sample at the four degrees Celsius to allow the procedure to prevent the protein aggregation.Disrupt the bacterial cells by passing the bacterial suspension through a high-pressure homogenizer operated at a range of 15, 000 to 20, 000 PSI for seven times at four degrees Celsius. After lysates baterializes, it should be centrifuged immediately. Transfer homogenized samples to a centrifuge tube.Immediately centrifuge the cell-lysate at 30, 000 times G at four degrees Celsius for one hour to separate the soluble and insoluble protein fractions by using an ultra-centrifuge. Following centrifugation, transfer the supernatant as the soluble protein fraction to a beaker. Measure the protein concentration of the soluble protein fraction by the Bradford method using a commercial kit with bovine serum albumin as the standard according to the manufacturer's instructions.Then add 177.6 microliters of one normal HCl into 20 milliliters of the soluble protein fraction to adjust its pH value from pH 9.0 to pH 8.0. Add 20 millimeter Tris-HCl, pH 8.0, 50 milliliter sodium chloride to the protein solution to result in a final protein concentration of 0.5 milligrams per milliliter. To prepare 15 milliliters of DEAE resin, suspend 0.6 grams of DEAE resin dry powder in 30 milliliters of Tris-HCl buffer at room temperature for at least one day.Centrifuge the resin at 10, 000 times G at four degrees Celsius for one minute and then remove and discard the supernatant. Then add 15 milliliters of Tris-HCl buffer. After repeating the centrifugation resuspension steps four more times, store the 15 milliliters of settled resin at four degrees Celsius for subsequent use.Working at four degrees Celsius, add 45 milliliters of the prepared soluble proteins to milliliters of the resin and transfer to a 100 milliliter beaker with stir bar. Stir the protein resin slurry using a stir plate at four degrees Celsius for one hour. Next, pour the protein resin slurry into a plastic or a glass column fitted with a stopcock and allow the resin to settle under gravity.Open the stopcock to allow the protein solution to run through the column by gravity flow until the liquid level in the column is just above the resin. Collect the flow through as the unbound fraction which contains the purified neutrophil-activating protein. Add 15 milliliters of the ice-cold Tris-HCl buffer into the column.Open the stopcock again to allow the wash buffer to run through the column by gravity flow until the liquid level in the column is just above the resin. Collect the flow through as the wash fraction. Repeat washing with ice-cold buffer four more times to collect the additional wash fractions.Then add 15 milliliters of ice-cold 20 millimeter Tris-HCl pH 8.0, one molar sodium chloride into the column. Collect the flow through as the elution fractions as before. Repeat the elution steps four more times to collect the additional elution fractions.The effect of pH on solubility of HP-NAP in E.coli lysate are shown here. The amount of HP-NAP detected in this soluble fraction was markedly increased at pH 7.5 to 9.5. Recombinant HP-NAP was almost fully recovered in the soluble fraction upon cell lysis at pH 9.0.Here, the effect of pH on negative purification of recombinant HP-NAP expressed in E.coli by DEAE resins in batch mode are shown. At pH 8.0, only a little amount of HP-NAP was present in the elution fraction. The amount of HP-NAP present in the unbound fractions was the highest at pH 8.0.The optimized amount of proteins loaded onto the DEAE resin is 1.5 milligrams of protein per milliliter of resin for achieving maximum capacity of the resin to absorb the impurities from E.coli. At pH 8.0, very few proteins other than HP-NAP in its native form are recovered in the unbound fraction using DEAE resins in batch mode. The purity of HP-NAP was higher than 95 percent.The purified HP-NAP folds into a multimer with a secondary structure of alpha-helix as revealed by the gelifiltration chromotogram and the far UV circular dichroism spectrum. A luminal dependent chemiluminescence assay reveals that the purified HP-NAP is able to trigger the production of reactive oxygen species by neutrophiles. Once mastered, these techniques can be done within five hours if it is performed properly.After watching this video you should have a good understanding of how to purify functional HP-NAP in its native form with high yield and purity using negative mode batch chromotography with DEAE and exchange resin. While attempting this procedure, it's important to remember to use buffers at the appropriate pH in the step of sterilizes in the batch chromotography. We first had the idea for this method when we tried to apply other chromotographic approaches instead of filtration to purify HP-NAP in its native form.Though this method is designed to appeal by recombinant HP-NAP expressed in E.coli. It can also be applied to other bacterial expression systems such as per-sida sep-tidas. Visual demonstration of this measure is quick code.Plus the step of sterilizes and batch chromotography are difficult to learn. Because these steps must be carried out at the four degrees Celsius without any time delay. If a protein designed for purification is suitable for our exchange chromotography in negative mode, this procedure could also be adapted as a starting point for the development of purification process.After its development, this technique paved the way for researchers in the field of clinical research to explore the possibility of using HP-NAP in cancer therapy as well as the development of vaccines, drugs, and the diagnostics for Helicobacter pylori associated disease.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Neuropathogenic की गैर इनवेसिव मॉडल<em&gt; Escherichia कोलाई</em&gt; नवजात चूहे में संक्रमण

Investigation of the interactions between animal host and bacterial pathogen is only meaningful if the infection model employed replicates the principal ...

High Resolution Electron Microscopy of the Helicobacter pylori Cag Type IV Secretion System Pili Produced in Varying Conditions of Iron Availability

High Resolution Electron Microscopy of the Helicobacter pylori Cag Type IV Secretion System Pili Produced in Varying Conditions of Iron Availability

के उच्च संकल्प इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी<em&gt; हेलिकोबेक्टर</emआयरन उपलब्धता की बदलती परिस्थितियों में उत्पादित&gt; सीएजी प्रकार चतुर्थ स्राव सिस्टम Pili

Helicobacter pylori is a helical-shaped, gram negative bacterium that colonizes the human gastric niche of half of the human population1,2.  H. pylori is ...

Organoids as Model for Infectious Diseases: Culture of Human and Murine Stomach Organoids and Microinjection of Helicobacter Pylori

संक्रामक रोगों के लिए मॉडल के रूप में Organoids: हेलिकोबेक्टर के मानव की संस्कृति और murine पेट Organoids और microinjection

Recently infection biologists have employed stem cell derived cultures to answer the need for new and better models to study host-pathogen interactions. ...

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

Vivo Bioluminescence System में गैर-इनवेसिव द्वारा Murine होस्ट में Enterohemorrhagic ई कोलाई औपनिवेशीकरण का पता लगाना

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome ...

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

ऐसे ई कोलाई या शिगेला flexneri के रूप में Enterobacterial उपभेदों में बैक्टीरियल विकार का उपयोग कर एक घने Transposon प्रविष्टि पुस्तकालय का निर्माण

Transposon mutagenesis is a method that allows gene disruption via the random genomic insertion of a piece of DNA called a transposon. The protocol below ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

ओवेरेक्स्पेशन एंड हेरिंग ऑफ ह्यूमन<em&gt; सीआईएस</em&gt; -प्रेनिलट्रांसफ़्रेज़ इन<em&gt; एस्चेरिचिया कोली</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

A Facile Protocol to Generate Site-Specifically Acetylated Proteins in Escherichia Coli

A Facile Protocol to Generate Site-Specifically Acetylated Proteins in Escherichia Coli

साइट उत्पंन करने के लिए एक सतही प्रोटोकॉल-विशेष रूप से ई कोलाई में Acetylated प्रोटीन

Post-translational modifications that occur at specific positions of proteins have been shown to play important roles in a variety of cellular processes. ...

Dissecting Multi-protein Signaling Complexes by Bimolecular Complementation Affinity Purification (BiCAP)

Dissecting Multi-protein Signaling Complexes by Bimolecular Complementation Affinity Purification BiCAP

Bimolecular पूरित अपनत्व शुद्धि (BiCAP) द्वारा विदारक मल्टी प्रोटीन सिगनल कॉम्प्लेक्स

The assembly of protein complexes is a central mechanism underlying the regulation of many cell signaling pathways. A major focus of biomedical research ...

Using Enhanced Green Fluorescence Protein-expressing Escherichia Coli to Assess Mouse Peritoneal Macrophage Phagocytosis

Using Enhanced Green Fluorescence Protein-expressing Escherichia Coli to Assess Mouse Peritoneal Macrophage Phagocytosis

माउस का आकलन करने के लिए बढ़ाया ग्रीन प्रतिदीप्ति प्रोटीन-व्यक्त ई कोलाई का उपयोग पेरिटोनियल मैक्रोफेज Phagocytosis

This manuscript describes a simple and reproducible method to perform a phagocytosis assay. The first part of this method involves building a ...

Purification of a High Molecular Mass Protein in Streptococcus mutans

Purification of a High Molecular Mass Protein in Streptococcus mutans

स्ट्रेप्टोकॉकस म्यूटान में एक उच्च आण्विक द्रव्यमान प्रोटीन की शुद्धि

Elucidation of a gene&#39;s function typically involves comparison of phenotypic traits of wild-type strains and strains in which the gene of interest has ...