Name: one-step negative chromatographic purification of helicobacter pylori neutrophil-activating protein overexpressed in escherichia coli in batch mode
Uploaded: 2016-06-18T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode at JoVE.co

We thank Dr. Chao-Sheng Cheng at National Tsing Hua University, Taiwan, for performing the circular dichroism measurement. We also thank Drs. Evanthia Galanis and Ianko D. Iankov at Mayo Clinic, USA, for providing the anti-HP-NAP monoclonal antibody. We appreciate Drs. Han-Wen Chang and Chung-Chu Chen at Mackay Memorial Hospital, Hsinchu, Taiwan, for providing advice for IRB application, Mr. Te-Lung Tsai at the Mackay Memorial Hospital, Hsinchu, Taiwan, for supervising the analysis of isolated neutrophils, and Ms. Ju-Chen Weng at National Tsing Hua University, Taiwan, for her technical assistance. This work was supported by grants from the Ministry of Science and Technology of Taiwan (MOST 104-2311-B-007-003, NSC101-2311-B-007-007 and NSC98-2311-B-007-006-MY3), the Joint Research Program of National Tsing Hua University and Mackay Memorial Hospital (100N7727E1, 101N2727E1, 103N2773E1), and the research program of National Tsing Hua University (104N2052E1).

Человеческая кровь собирали у здоровых добровольцев с предварительного письменного информированного согласия и одобрения Совета по институциональному обзору Национального университета Цинхуа, Синьчжу, Тайвань. 1. Экспрессия рекомбинантных HP-NAP в E. палочки <ol><li> Приготовьт?...

<ol>
	<li>Brunette, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+3,+Infectious+diseases+related+to+travel.">Chapter 3, Infectious diseases related to travel.</a> CDC Health Information for International Travel 2016. , (2015).</li><li>Bauer, B., Meyer, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+gastric+pathogen+Helicobacter+pylori+its+association+with+gastric+cancer+and+ulcer+disease.">The human gastric pathogen Helicobacter pylori its association with gastric cancer and ulcer disease.</a> Ulcers. 2011, 340157 (2011).</li><li>Malfertheiner, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Management+of+Helicobacter+pylori+infection--the+Maastricht+IV/+Florence+Consensus+Report.+Gut.">Management of Helicobacter pylori infection--the Maastricht IV/ Florence Consensus Report. Gut.</a> Gut. 61 (5), 646-664 (2012).</li><li>Evans, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+Helicobacter+pylori+neutrophil-activating+protein.">Characterization of a Helicobacter pylori neutrophil-activating protein.</a> Infect. Immun. 63 (6), 2213-2220 (1995).</li><li>Fu, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helicobacter+pylori+neutrophil-activating+protein:+from+molecular+pathogenesis+to+clinical+applications.">Helicobacter pylori neutrophil-activating protein: from molecular pathogenesis to clinical applications.</a> World J. Gastroenterol. 20 (18), 5294-5301 (2014).</li><li>de Bernard, M., D'Elios, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immune+modulating+activity+of+the+Helicobacter+pylori+HP-NAP:+Friend+or+foe?.">The immune modulating activity of the Helicobacter pylori HP-NAP: Friend or foe?.</a> Toxicon. 56 (7), 1186-1192 (2010).</li><li>Malfertheiner, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+immunogenicity+of+an+intramuscular+Helicobacter+pylori+in+noninfected+volunteers:+a+phase+I+study.">Safety and immunogenicity of an intramuscular Helicobacter pylori in noninfected volunteers: a phase I study.</a> Gastroenterology. 135 (3), 787-795 (2008).</li><li>Codolo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HP-NAP+inhibits+the+growth+of+bladder+cancer+in+mice+by+activating+a+cytotoxic+Th1+response.">HP-NAP inhibits the growth of bladder cancer in mice by activating a cytotoxic Th1 response.</a> Cancer Immunol. Immunother. 61 (1), 31-40 (2012).</li><li>Codolo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neutrophil-activating+protein+of+Helicobacter+pylori+Th2+inflammation+in+ovalbumin-induced+allergic+asthma.">The neutrophil-activating protein of Helicobacter pylori Th2 inflammation in ovalbumin-induced allergic asthma.</a> Cell. Microbiol. 10 (11), 2355-2363 (2008).</li><li>Del Prete, ., G, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunosuppression+of+TH2+responses+in+Trichinella+spiralis+by+Helicobacter+pylori+neutrophil-activating+protein.">Immunosuppression of TH2 responses in Trichinella spiralis by Helicobacter pylori neutrophil-activating protein.</a> J. Allergy Clin. Immunol. 122 (5), 908-913.e5 (2008).</li><li>Tang, R. X., Luo, D. J., Sun, A. H., Yan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+Helicobacter+pylori+in+expression+of+antigens+and+induction+of+antibodies.">Diversity of Helicobacter pylori in expression of antigens and induction of antibodies.</a> World J. Gastroenterol. 14 (30), 4816-4822 (2008).</li><li>Long, M., Luo, J., Li, Y., Zeng, F. Y., Li, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+evaluation+of+antibodies+against+neutrophil-activating+protein+of+Helicobacter+pylori+in+patients+with+gastric+cancer.">Detection and evaluation of antibodies against neutrophil-activating protein of Helicobacter pylori in patients with gastric cancer.</a> World J. Gastroenterol. 15 (19), 2381-2388 (2009).</li><li>Song, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CagA-independent+cluster+of+antigens+related+to+the+risk+of+noncardia+gastric+cancer:+associations+between+Helicobacter+pylori+and+gastric+adenocarcinoma+explored+by+multiplex+serology.">A CagA-independent cluster of antigens related to the risk of noncardia gastric cancer: associations between Helicobacter pylori and gastric adenocarcinoma explored by multiplex serology.</a> Int. J. Cancer. 134 (12), 2942-2950 (2014).</li><li>Kottakis, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helicobacter+pylori+neutrophil-activating+protein+activates+neutrophils+by+its+C-terminal+region+even+without+dodecamer+formation,+which+is+a+prerequisite+for+DNA+protection--novel+approaches+against+Helicobacter+pylori+inflammation.">Helicobacter pylori neutrophil-activating protein activates neutrophils by its C-terminal region even without dodecamer formation, which is a prerequisite for DNA protection--novel approaches against Helicobacter pylori inflammation.</a> FEBS J. 275 (2), 302-317 (2008).</li><li>Thoreson, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+surface-exposed+antigen+expression+between+Helicobacter+pylori+isolated+from+duodenal+ulcer+patients+and+from+asymptomatic+subjects.">Differences in surface-exposed antigen expression between Helicobacter pylori isolated from duodenal ulcer patients and from asymptomatic subjects.</a> J. Clin. Microbiol. 38 (9), 3436-3441 (2000).</li><li>Wang, C. A., Liu, Y. C., Du, S. Y., Lin, C. W., Fu, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helicobacter+pylori+neutrophil-activating+protein+promotes+myeloperoxidase+release+from+human+neutrophils.">Helicobacter pylori neutrophil-activating protein promotes myeloperoxidase release from human neutrophils.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 377 (1), 52-56 (2008).</li><li>Iyer, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+surface+area+chromatography+for+flow-through+purification+of+viruses+and+virus+like+particles.">Reduced surface area chromatography for flow-through purification of viruses and virus like particles.</a> J. Chromatogr. A. 1218 (26), 3973-3981 (2011).</li><li>Wongchuphan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+rabbit+polyclonal+immunoglobulin+G+using+anion+exchangers.">Purification of rabbit polyclonal immunoglobulin G using anion exchangers.</a> Process Biochem. 46 (1), 101-107 (2011).</li><li>Lu, X., Zhao, D., Su, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+hemoglobin+by+ion+exchange+chromatography+in+flow-through+mode+with+PEG+as+an+escort.">Purification of hemoglobin by ion exchange chromatography in flow-through mode with PEG as an escort.</a> Artif. Cells Blood Substit. Immobil. Biotechnol. 32 (2), 209-227 (2004).</li><li>Brooks, S. P., Storey, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+a+protein+phosphatase+that+dephosphorylates+pyruvate+kinase+in+an+anoxia+tolerant+animal.">Purification and characterization of a protein phosphatase that dephosphorylates pyruvate kinase in an anoxia tolerant animal.</a> Biochem. Mol. Biol. Int. 38 (6), 1223-1234 (1996).</li><li>Gewirtz, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+typhimurium+translocates+flagellin+across+intestinal+epithelia,+inducing+a+proinflammatory+response.">Salmonella typhimurium translocates flagellin across intestinal epithelia, inducing a proinflammatory response.</a> J. Clin. Invest. 107 (1), 99-109 (2001).</li><li>Levison, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+ion-exchange+column+chromatography+of+proteins:+Comparison+of+different+formats.">Large-scale ion-exchange column chromatography of proteins: Comparison of different formats.</a> J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 790 (1-2), 17-33 (2003).</li><li>Lee, M. F. X., Chan, E. S., Tey, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+chromatography:+Progress,+applications+and+future+perspectives.">Negative chromatography: Progress, applications and future perspectives.</a> Process Biochem. 49 (6), 1005-1011 (2014).</li><li>Yang, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+yield+purification+of+Helicobacter+pylori+neutrophil-activating+protein+overexpressed+in+Escherichia+coli.">High yield purification of Helicobacter pylori neutrophil-activating protein overexpressed in Escherichia coli.</a> BMC biotechnol. 15 (23), (2015).</li><li>Iankov, I. D., Haralambieva, I. H., Galanis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogenicity+of+attenuated+measles+virus+engineered+to+express+Helicobacter+pylori+neutrophil-activating+protein.">Immunogenicity of attenuated measles virus engineered to express Helicobacter pylori neutrophil-activating protein.</a> Vaccine. 29 (8), 1710-1720 (2011).</li><li>Shih, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+chromatographic+purification+of+Helicobacter+pylori+protein+expressed+in+Bacillus+subtilis.">One-step chromatographic purification of Helicobacter pylori protein expressed in Bacillus subtilis.</a> PLoS One. 8 (4), e60786 (2013).</li><li>Liu, H., Naismith, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+one-step+site-directed+deletion,+insertion,+single+and+multiple-site+plasmid+mutagenesis+protocol.">An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol.</a> BMC biotechnol. 8 (91), (2008).</li><li>Karnik, A., Karnik, R., Grefen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SDM-assist+software+to+design+site-directed+mutagenesis+primers+introducing+'silent'+restriction+sites.">SDM-assist software to design site-directed mutagenesis primers introducing 'silent' restriction sites.</a> BMC bioinformatics. 14 (105), (2013).</li></ol>

Отрицательный пакетный режим хроматографии с DEAE анионитов , представленные здесь подходит для очистки рекомбинантного HP-NAP сверхэкспрессируется в E палочки. Значения рН буферов , используемых на стадиях лизиса клеток и очистки очень важно для обеспечения растворимости HP-NAP в E. п...

Helicobacter Pylori (H.) является основной причиной гастрита и язвенной болезни. Эта бактерия также классифицируется как канцероген в организме человека Международным агентством по изучению рака, часть Всемирной организации здравоохранения, в 1994 году было подсчитано , что распространенность H. инфекции пилори составляет 70% в развивающихся странах и на 30-40% в промышленно развитых странах 1. Даже при том , что уровень инфицированности H. пилори снижается в промышленно развитых странах, уровень инфицированности H. пилори в развивающихся странах по - прежнему высок 2. Стандартное лечение искоренить H. Инфекция пилори состоит из введения ингибитора протонной помпы, ИПП и двух антибиотиков, кларитромицин плюс амоксициллин или метронидазол 3. Тем не менее, повышение резистентности к антибиотикам у H. пилори терапия язвенной болезни о связанных настоятельно призывает к разработке новых стратегий по предотвращению Oг вылечить инфекцию. Разработка профилактических и / или терапевтической вакцинации против H. пилори может обеспечить альтернативный подход к контролю H. пилори инфекции. Хеликобактерной активирующий нейтрофилы белок (HP-NAP), одним из основных факторов вирулентности пилори H, был впервые выявлен в водных экстрактов H. пилори с возможностью активировать нейтрофилы придерживаться эндотелиальных клеток и производят активные формы кислорода (ROS) 4. Нейтрофильной инфильтрации слизистой оболочки желудка обнаружено в H. pylori- инфицированных пациентов с активным гастритом может привести к воспалению и повреждению тканей желудка. Таким образом, НР-NAP может играть патологическую роль при активации нейтрофилов , чтобы вызвать воспаление желудка, которое вызывает дальнейшее язву или Н. пилори -associated заболеваний желудка. Тем не менее, НР-NAP является потенциальным кандидатом для клинического применения 5,6. В связи с иммуногенной и иммуномодулирующим проperties НР-NAP, этот белок может быть использован для разработки вакцин, терапевтических средств и диагностических инструментов. Клиническое исследование было проведено с использованием рекомбинантного для HP-NAP в качестве одного из компонентов белковой вакцины против H. пилори. Эта вакцина состоит из рекомбинантного HP-NAP, цитотоксин-ассоциированный ген (CagA) и вакуолизирующий цитотоксин А (VacA) белков , сформулированного с гидроксидом алюминия и далее было показано , что безопасность и иммуногенность у человека 7. Кроме того , НР-NAP действует как мощный иммуномодулятор , чтобы вызвать Т - хелперов типа 1 (Th1) -поляризованым иммунные ответы для лечения рака 8 и вниз регулировать Th2-опосредованные иммунные реакции , индуцируемые аллергических реакций и паразитарных инфекций 9,10. Что касается диагностики, рекомбинантный НР-NAP на основе ELISA , был применен для выявления антител сыворотки против HP-NAP в H. пилори -infected пациентов 11. Одно исследование показало , что уровень HP-NAP-специфических антител в сыворотке крови от H. PYLori -infected пациентов с раком желудка была достоверно выше , чем у пациентов с хроническим гастритом 12. Другое исследование также показало , что сывороточные антитела против HP-NAP связаны с наличием не-кардии аденокарциномы желудка 13. Таким образом, рекомбинантный НР-NAP на основе ELISA , может быть применен для определения сывороточных антител против HP-NAP для прогноза рака желудка в H. пилори -infected пациентов. Взятые вместе, очищенный HP-NAP может быть дополнительно использован для профилактики, лечения, и прогноз H. пилори -associated заболеваний, а также терапии рака. Среди нескольких методов , используемых для очистки рекомбинантного HP-NAP выражается в Escherichia coli (E.coli) в своей нативной форме сообщалось до сих пор, необходим второй этап очистки с участием гель-фильтрационной хроматографии с получением высокочистого НР-NAP 14-16 , При этом способ с использованием негативного режима пакетной хроматографии сдиэтиламиноэтил (DEAE) ионообменные смолы описана для очистки HP-NAP сверхэкспрессируется в E. палочка с высоким выходом и высокой степенью чистоты. Этот метод очистки был основан на связывании белков клетки-хозяина и / или других, чем HP-NAP к смоле примесей. При рН 8,0, почти нет других белков, кроме HP-NAP извлекают из несвязанной фракции. Такая очистка подход с использованием DEAE ионообменной хроматографии в отрицательном режиме проста и экономии, позволяя очистку рекомбинантного HP-NAP с помощью одностадийной хроматографии путем сбора несвязанной фракции времени. В дополнение к HP-NAP, несколько других биомолекул, таких как вирусы 17, иммуноглобулин G (IgG) , 18, ​​гемоглобин 19, протеинфосфатазы 20, и фактор вирулентности флагеллином 21, также , как сообщалось, очищают с помощью ионообменной хроматографии в негативном Режим. Отрицательный режим является предпочтительным для ионообменной хроматографии, если примеси являются незначительнымикомпоненты , присутствующие в образце , подвергнутого быть очищено 22. Применение отрицательной хроматографии в очистки природных или рекомбинантных биомолекул был недавно рассмотрен 23. В настоящем докладе дается шаг за шагом протокола для экспрессии рекомбинантного HP-NAP в E. палочка, лизис клеток и очистки HP-NAP с использованием негативного режима пакетной хроматографии с DEAE ионообменных смол. Если белок желательно для очистки пригоден для ионообменной хроматографии в отрицательном режиме, описанный протокол также может быть адаптирована в качестве отправной точки для разработки способа очистки.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET42a-NAP&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>prepared as described in Supplementary data of Refernce 15&#160; 
			http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0006291X08018317</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli BL21 (DE3)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc</td>
			<td>C6000-03</td>
			<td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/C600003</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>25389-94-0</td>
			<td>http://www.amresco-inc.com/KANAMYCIN-SULFATE-0408.cmsx</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>MD Biomedical Inc</td>
			<td>101-367-93-1</td>
			<td>http://www.antibody-antibodies.com/product_det.php?id=238064&#38;supplier=search&#38;name =IPTG%20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10837091001</td>
			<td>protease inhibitor 
			http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/PMSFRO?lang=en&#38;region=TW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-alpha-tosyl-L-lysinyl-chloromethylketone (TLCK)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7254</td>
			<td>protease inhibitor 
			http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t7254?lang=en&#38;region=TW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-tosyl-L-phenylalaninyl-chloromethylketone (TPCK)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4376</td>
			<td>protease inhibitor 
			http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t4376?lang=en&#38;region=TW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad protein assay dye reagent concentrate</td>
			<td>Bio&#8208;Rad</td>
			<td>500-0006</td>
			<td>for protein quantitation 
			http://www.bio-rad.com/en-us/sku/5000006-bio-rad-protein-assay-dye-reagent-concentrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein standard (bovine serum albumin)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5619&#160;</td>
			<td>a standard protein for Bio-Rad Protein Assay 
			http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/p5619?lang=en&#38;region=TW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEAE&#8211;Sephadex &#160;A-25 chloride form</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A25120</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a25120?lang=en&#38;region=TW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrum/Por dialysis tubing</td>
			<td>Spectrum Laboratories</td>
			<td>132720</td>
			<td>with molecular weight cutoff of 14 kDa 
			http://www.spectrumlabs.com/dialysis/RCtubing.html?Pn=132720;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrodisc&#174; units with Mustang&#174; E membrane</td>
			<td>Pall</td>
			<td>MSTG25E3</td>
			<td>for endotoxin removal; operated at flow rates ranging from 1 to 4 ml/min 
			http://www.pall.com/main/laboratory/product.page?id=19992</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse monoclonal antibody MAb 16F4</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>raised against the purified HP-NAP of H. pylori strain NCTC 11637 as described in Refernce 23;&#160; A gift from Drs. Evanthia Galanis and Ianko D. Iankov at Mayo Clinic, USA 
			http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0264410X10017585</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiLoad 16/600 Superdex 200 pg</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>28989335</td>
			<td>for gel filtration chromatography 
			http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/28989335</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PlusOne silver staining kit, protein</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17-1150-01</td>
			<td>http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/17115001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque PLUS</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17-1440-02</td>
			<td>for density gradient centrifugation to purify human neutrophils 
			http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences-tw/products/AlternativeProductStructure _16963/17144002</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat bottom 96-well white plate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc</td>
			<td>236108</td>
			<td>http://www.thermoscientific.com/en/product/nunc-f96-microwell-black-white-polystyrene-plate.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8511</td>
			<td>protected from light 
			http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a8511?lang=en&#38;region=TW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Expand &#160;long template PCR system</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11681834001</td>
			<td>source of High Fidelity PCR enzyme mix 
			http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/elongro?lang=en&#38;region=TW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dpn I</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0176S</td>
			<td>https://www.neb.com/products/r0176-dpni</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xho I</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0146S</td>
			<td>https://www.neb.com/products/r0146-xhoi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli DH5&#945;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc</td>
			<td>18265-017</td>
			<td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/18265017</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Product Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td> 
			&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-2800 double beam UV/VIS spectrophotometer</td>
			<td>Hitachi&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td>out of market and upgraded to a new model 
			http://hitachi-hta.com/products/life-sciences-chemical-analysis/uvvisible-spectrophotometers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EmulsiFlex-C3 high pressure homogenizer</td>
			<td>Avestin Inc</td>
			<td>C315320</td>
			<td>http://www.avestin.com/English/c3page.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hitachi Koki himac CP80WX general ultracentrifuge</td>
			<td>Hitachi Koki Co</td>
			<td>90106401</td>
			<td>for separation of the soluble and insoluble protein fractions from E. coli lysates 
			http://centrifuges.hitachi-koki.com/products/ultra/cp_wx/cp_wx.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;KTA FPLC</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>18-1900-26</td>
			<td>for gel filtration chromatography 
			http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/18190026</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aviv model 62ADS CD spectrophotometer</td>
			<td>Aviv Biomedical</td>
			<td>N/A</td>
			<td>out of market and upgraded to a new model 
			http://www.avivbiomedical.com/circular.php</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS-3000 imaging system</td>
			<td>Fujifilm</td>
			<td>N/A</td>
			<td>discontinued and replaced 
			http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/28955810</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wallac 1420 (Victor2) multilabel counter</td>
			<td>Perkin-Elmer</td>
			<td>1420-018</td>
			<td>for chemiluminescence detection 
			http://www.perkinelmer.com/catalog/product/id/1420-018</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

one-step negative chromatographic purification of helicobacter pylori neutrophil-activating protein overexpressed in escherichia coli in batch mode

Helicobacter Pylori активирующий нейтрофилы белок (НР-NAP) является одним из основных факторов вирулентности Helicobacter Pylori (H.). Он играет важную роль в H. пилори индуцированный воспаление желудка путем активации нескольких врожденных лейкоциты , включая нейтрофилы, моноциты, и тучных клеток. Иммуногенные и иммуномодулирующие свойства HP-NAP делают его потенциальной диагностики и вакцины кандидат на H. пилори и новый кандидат препарат для лечения рака. Для того чтобы получить значительные количества очищенного HP-NAP, используемой для его клинического применения, является эффективным способом, чтобы очистить этот белок с высоким выходом и чистотой должна быть установлена. В этом протоколе, мы описали метод одностадийного отрицательной хроматографической очистки рекомбинантного HP-NAP избыточная экспрессия Escherichia coli (E.coli) с помощью диэтиламиноэтил (DEAE) ионообменной смолы (например., Колонки Sephadex) Iп пакетном режиме. Рекомбинантный НР-NAP составляет почти 70% от общего количества белка в E. палочка и почти полностью восстановилась в растворимой фракции после лизиса клеток при рН 9,0. При оптимальном состоянии при рН 8,0, большинство HP-NAP восстанавливается в несвязанной фракции в то время как эндогенные белки из E. палочка эффективно удаляются с помощью смолы. Этот метод очистки с использованием отрицательной пакетном режиме хроматографии с DEAE ионообменных смол дает функциональную HP ворсом из E. палочки в своей нативной форме с высоким выходом и чистотой. Очищенный HP-NAP может быть дополнительно использован для профилактики, лечения, и прогноз H. пилори -associated заболеваний, а также терапии рака.

Принципиальная схема экспериментальной процедуры отрицательной очистки рекомбинантного HP-NAP экспрессируется в E. палочка с использованием DEAE ионообменных смол в пакетном режиме, показан на рисунке 1. Этот метод очистки основан на связывании белков клет...

Watch this Scientific Journal Video about One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode at JoVE.co

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

Высокий метод доходности для одностадийного отрицательной очистки рекомбинантного Helicobacter Pylori активирующий нейтрофилы белок (HP-NAP) суперэкспрессированный в кишечной палочки с помощью диэтиламиноэтиловыми смол в пакетном режиме описана. HP-NAP очищают с помощью этого метода является полезным для разработки вакцин, лекарств, или для диагностики H. пилори -associated заболеваний.

Один шаг Отрицательный хроматографической очистки<em&gt; Хеликобактерной</em&gt; Активирующий нейтрофилы белок избыточно экспрессируется в<em&gt; Кишечная палочка</em&gt; В пакетном режиме

Helicobacter pylori neutrophil-activating protein (HP-NAP) is a major virulence factor of Helicobacter pylori (H. pylori). It plays a critical role in H. ...

The overall goal of this purification is to yield functional Helicobacter pylori Neutrophil-activating protein or HP-NAP in its native form with high purity and high yield using negative mode batch chromatography with di-ethyl amino-ethyl ion exchange resin. The main advantage of this technique is that HP-NAP can be purified in its native form in one step with high purity and high yield. Negative purification of HP-NAP starts with a batch binding procedure in which the soluble protein fraction from bacterial lysates is added to DEAE resin.The mixture is incubated to allow wholesale proteins to bind to the resin. HP-NAP present in the unbound fraction is then obtained by centrifugation of gravity flow. The implications of this technique is 10:1 prevention treatment and prognostic of Helicobacter pylori associated diseases as well as cancer therapy.Because of the immunogenic and immunomodulatory properties of HP-NAP. Generally, individuals new to this method will struggle. Because HP-NAP easily aggregates during the sterilization.Demonstrating the procedure will be Zhi-Wei Hong, a graduate student from our lab. Working at four degrees Celsius, we suspend 50 milliliters of the cell palate prepared as described in the text protocol in 20 milliliters of low salt, tris-buffer at pH 9.0 with protease inhibitor mixture. It's critical to keep sample at the four degrees Celsius to allow the procedure to prevent the protein aggregation.Disrupt the bacterial cells by passing the bacterial suspension through a high-pressure homogenizer operated at a range of 15, 000 to 20, 000 PSI for seven times at four degrees Celsius. After lysates baterializes, it should be centrifuged immediately. Transfer homogenized samples to a centrifuge tube.Immediately centrifuge the cell-lysate at 30, 000 times G at four degrees Celsius for one hour to separate the soluble and insoluble protein fractions by using an ultra-centrifuge. Following centrifugation, transfer the supernatant as the soluble protein fraction to a beaker. Measure the protein concentration of the soluble protein fraction by the Bradford method using a commercial kit with bovine serum albumin as the standard according to the manufacturer's instructions.Then add 177.6 microliters of one normal HCl into 20 milliliters of the soluble protein fraction to adjust its pH value from pH 9.0 to pH 8.0. Add 20 millimeter Tris-HCl, pH 8.0, 50 milliliter sodium chloride to the protein solution to result in a final protein concentration of 0.5 milligrams per milliliter. To prepare 15 milliliters of DEAE resin, suspend 0.6 grams of DEAE resin dry powder in 30 milliliters of Tris-HCl buffer at room temperature for at least one day.Centrifuge the resin at 10, 000 times G at four degrees Celsius for one minute and then remove and discard the supernatant. Then add 15 milliliters of Tris-HCl buffer. After repeating the centrifugation resuspension steps four more times, store the 15 milliliters of settled resin at four degrees Celsius for subsequent use.Working at four degrees Celsius, add 45 milliliters of the prepared soluble proteins to milliliters of the resin and transfer to a 100 milliliter beaker with stir bar. Stir the protein resin slurry using a stir plate at four degrees Celsius for one hour. Next, pour the protein resin slurry into a plastic or a glass column fitted with a stopcock and allow the resin to settle under gravity.Open the stopcock to allow the protein solution to run through the column by gravity flow until the liquid level in the column is just above the resin. Collect the flow through as the unbound fraction which contains the purified neutrophil-activating protein. Add 15 milliliters of the ice-cold Tris-HCl buffer into the column.Open the stopcock again to allow the wash buffer to run through the column by gravity flow until the liquid level in the column is just above the resin. Collect the flow through as the wash fraction. Repeat washing with ice-cold buffer four more times to collect the additional wash fractions.Then add 15 milliliters of ice-cold 20 millimeter Tris-HCl pH 8.0, one molar sodium chloride into the column. Collect the flow through as the elution fractions as before. Repeat the elution steps four more times to collect the additional elution fractions.The effect of pH on solubility of HP-NAP in E.coli lysate are shown here. The amount of HP-NAP detected in this soluble fraction was markedly increased at pH 7.5 to 9.5. Recombinant HP-NAP was almost fully recovered in the soluble fraction upon cell lysis at pH 9.0.Here, the effect of pH on negative purification of recombinant HP-NAP expressed in E.coli by DEAE resins in batch mode are shown. At pH 8.0, only a little amount of HP-NAP was present in the elution fraction. The amount of HP-NAP present in the unbound fractions was the highest at pH 8.0.The optimized amount of proteins loaded onto the DEAE resin is 1.5 milligrams of protein per milliliter of resin for achieving maximum capacity of the resin to absorb the impurities from E.coli. At pH 8.0, very few proteins other than HP-NAP in its native form are recovered in the unbound fraction using DEAE resins in batch mode. The purity of HP-NAP was higher than 95 percent.The purified HP-NAP folds into a multimer with a secondary structure of alpha-helix as revealed by the gelifiltration chromotogram and the far UV circular dichroism spectrum. A luminal dependent chemiluminescence assay reveals that the purified HP-NAP is able to trigger the production of reactive oxygen species by neutrophiles. Once mastered, these techniques can be done within five hours if it is performed properly.After watching this video you should have a good understanding of how to purify functional HP-NAP in its native form with high yield and purity using negative mode batch chromotography with DEAE and exchange resin. While attempting this procedure, it's important to remember to use buffers at the appropriate pH in the step of sterilizes in the batch chromotography. We first had the idea for this method when we tried to apply other chromotographic approaches instead of filtration to purify HP-NAP in its native form.Though this method is designed to appeal by recombinant HP-NAP expressed in E.coli. It can also be applied to other bacterial expression systems such as per-sida sep-tidas. Visual demonstration of this measure is quick code.Plus the step of sterilizes and batch chromotography are difficult to learn. Because these steps must be carried out at the four degrees Celsius without any time delay. If a protein designed for purification is suitable for our exchange chromotography in negative mode, this procedure could also be adapted as a starting point for the development of purification process.After its development, this technique paved the way for researchers in the field of clinical research to explore the possibility of using HP-NAP in cancer therapy as well as the development of vaccines, drugs, and the diagnostics for Helicobacter pylori associated disease.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Неинвазивного Модель Neuropathogenic<em&gt; Кишечная палочка</em&gt; Инфекция в новорожденной крысы

Investigation of the interactions between animal host and bacterial pathogen is only meaningful if the infection model employed replicates the principal ...

High Resolution Electron Microscopy of the Helicobacter pylori Cag Type IV Secretion System Pili Produced in Varying Conditions of Iron Availability

High Resolution Electron Microscopy of the Helicobacter pylori Cag Type IV Secretion System Pili Produced in Varying Conditions of Iron Availability

Электронной микроскопии высокого разрешения из<em&gt; Helicobacter Pylori</em&gt; Cag Тип IV секреции Система Пили Выпускается в различных условиях железного Наличие

Helicobacter pylori is a helical-shaped, gram negative bacterium that colonizes the human gastric niche of half of the human population1,2.  H. pylori is ...

Organoids as Model for Infectious Diseases: Culture of Human and Murine Stomach Organoids and Microinjection of Helicobacter Pylori

Органоиды как модель для инфекционных болезней: Культура человека и мыши желудка органоидов и Микроинъекция Helicobacter Pylori

Recently infection biologists have employed stem cell derived cultures to answer the need for new and better models to study host-pathogen interactions. ...

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

Обнаружение энтерогеморрагические Escherichia Coli колонизации в мышиных принимающей системой неинвазивные в Vivo биолюминесценции

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome ...

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Создание плотного Transposon вставки библиотеки с использованием бактериальной сопряжения в энтеробактерий штаммов таких как Кишечная палочка или шигеллам Флекснера

Transposon mutagenesis is a method that allows gene disruption via the random genomic insertion of a piece of DNA called a transposon. The protocol below ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Сверхэкспрессия и очищение человека<em&gt; Cis</em&gt; -пренилтрансфераза в<em&gt; Escherichia coli</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

A Facile Protocol to Generate Site-Specifically Acetylated Proteins in Escherichia Coli

A Facile Protocol to Generate Site-Specifically Acetylated Proteins in Escherichia Coli

Легковесные протокол для создания Site-Specifically ацетилированный белков в Escherichia Coli

Post-translational modifications that occur at specific positions of proteins have been shown to play important roles in a variety of cellular processes. ...

Dissecting Multi-protein Signaling Complexes by Bimolecular Complementation Affinity Purification (BiCAP)

Dissecting Multi-protein Signaling Complexes by Bimolecular Complementation Affinity Purification BiCAP

Пройдя через сигнализации различных белковых комплексов, очищение сродства Bimolecular дополнения (BiCAP)

The assembly of protein complexes is a central mechanism underlying the regulation of many cell signaling pathways. A major focus of biomedical research ...

Using Enhanced Green Fluorescence Protein-expressing Escherichia Coli to Assess Mouse Peritoneal Macrophage Phagocytosis

Using Enhanced Green Fluorescence Protein-expressing Escherichia Coli to Assess Mouse Peritoneal Macrophage Phagocytosis

С помощью усиленной зеленый флуоресценции белков выражая Escherichia Coli оценить мыши перитонеальных макрофагов фагоцитоз

This manuscript describes a simple and reproducible method to perform a phagocytosis assay. The first part of this method involves building a ...

Purification of a High Molecular Mass Protein in Streptococcus mutans

Purification of a High Molecular Mass Protein in Streptococcus mutans

Очистка высокомолекулярного массового белка в streptococcus mutans

Elucidation of a gene&#39;s function typically involves comparison of phenotypic traits of wild-type strains and strains in which the gene of interest has ...