Name: one-step negative chromatographic purification of helicobacter pylori neutrophil-activating protein overexpressed in escherichia coli in batch mode
Uploaded: 2016-06-18T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode at JoVE.co

We thank Dr. Chao-Sheng Cheng at National Tsing Hua University, Taiwan, for performing the circular dichroism measurement. We also thank Drs. Evanthia Galanis and Ianko D. Iankov at Mayo Clinic, USA, for providing the anti-HP-NAP monoclonal antibody. We appreciate Drs. Han-Wen Chang and Chung-Chu Chen at Mackay Memorial Hospital, Hsinchu, Taiwan, for providing advice for IRB application, Mr. Te-Lung Tsai at the Mackay Memorial Hospital, Hsinchu, Taiwan, for supervising the analysis of isolated neutrophils, and Ms. Ju-Chen Weng at National Tsing Hua University, Taiwan, for her technical assistance. This work was supported by grants from the Ministry of Science and Technology of Taiwan (MOST 104-2311-B-007-003, NSC101-2311-B-007-007 and NSC98-2311-B-007-006-MY3), the Joint Research Program of National Tsing Hua University and Mackay Memorial Hospital (100N7727E1, 101N2727E1, 103N2773E1), and the research program of National Tsing Hua University (104N2052E1).

İnsan kanı Ulusal Tsing Hua Üniversitesi Kurumsal Değerlendirme Kurulu, Hsinchu, Tayvan önceden yazılı aydınlatılmış onam ve onayı ile sağlıklı gönüllülerden alındı. E. Rekombinant HP NAP 1. İfade E. coli <ol><li> H. HP NAP-DNA dizisini içeren plazmid pET42a NAP-hazırlama pylori 26695 suşu olarak daha önce 16 nitelendirdi. tarif edildiği gibi arzu edilen nokta mutasyonu olan HP NAP DNA dizisini ihtiva eden plasmidler hazırlama (Protokol?...

<ol>
	<li>Brunette, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+3,+Infectious+diseases+related+to+travel.">Chapter 3, Infectious diseases related to travel.</a> CDC Health Information for International Travel 2016. , (2015).</li><li>Bauer, B., Meyer, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+gastric+pathogen+Helicobacter+pylori+its+association+with+gastric+cancer+and+ulcer+disease.">The human gastric pathogen Helicobacter pylori its association with gastric cancer and ulcer disease.</a> Ulcers. 2011, 340157 (2011).</li><li>Malfertheiner, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Management+of+Helicobacter+pylori+infection--the+Maastricht+IV/+Florence+Consensus+Report.+Gut.">Management of Helicobacter pylori infection--the Maastricht IV/ Florence Consensus Report. Gut.</a> Gut. 61 (5), 646-664 (2012).</li><li>Evans, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+Helicobacter+pylori+neutrophil-activating+protein.">Characterization of a Helicobacter pylori neutrophil-activating protein.</a> Infect. Immun. 63 (6), 2213-2220 (1995).</li><li>Fu, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helicobacter+pylori+neutrophil-activating+protein:+from+molecular+pathogenesis+to+clinical+applications.">Helicobacter pylori neutrophil-activating protein: from molecular pathogenesis to clinical applications.</a> World J. Gastroenterol. 20 (18), 5294-5301 (2014).</li><li>de Bernard, M., D'Elios, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immune+modulating+activity+of+the+Helicobacter+pylori+HP-NAP:+Friend+or+foe?.">The immune modulating activity of the Helicobacter pylori HP-NAP: Friend or foe?.</a> Toxicon. 56 (7), 1186-1192 (2010).</li><li>Malfertheiner, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+immunogenicity+of+an+intramuscular+Helicobacter+pylori+in+noninfected+volunteers:+a+phase+I+study.">Safety and immunogenicity of an intramuscular Helicobacter pylori in noninfected volunteers: a phase I study.</a> Gastroenterology. 135 (3), 787-795 (2008).</li><li>Codolo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HP-NAP+inhibits+the+growth+of+bladder+cancer+in+mice+by+activating+a+cytotoxic+Th1+response.">HP-NAP inhibits the growth of bladder cancer in mice by activating a cytotoxic Th1 response.</a> Cancer Immunol. Immunother. 61 (1), 31-40 (2012).</li><li>Codolo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neutrophil-activating+protein+of+Helicobacter+pylori+Th2+inflammation+in+ovalbumin-induced+allergic+asthma.">The neutrophil-activating protein of Helicobacter pylori Th2 inflammation in ovalbumin-induced allergic asthma.</a> Cell. Microbiol. 10 (11), 2355-2363 (2008).</li><li>Del Prete, ., G, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunosuppression+of+TH2+responses+in+Trichinella+spiralis+by+Helicobacter+pylori+neutrophil-activating+protein.">Immunosuppression of TH2 responses in Trichinella spiralis by Helicobacter pylori neutrophil-activating protein.</a> J. Allergy Clin. Immunol. 122 (5), 908-913.e5 (2008).</li><li>Tang, R. X., Luo, D. J., Sun, A. H., Yan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+Helicobacter+pylori+in+expression+of+antigens+and+induction+of+antibodies.">Diversity of Helicobacter pylori in expression of antigens and induction of antibodies.</a> World J. Gastroenterol. 14 (30), 4816-4822 (2008).</li><li>Long, M., Luo, J., Li, Y., Zeng, F. Y., Li, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+evaluation+of+antibodies+against+neutrophil-activating+protein+of+Helicobacter+pylori+in+patients+with+gastric+cancer.">Detection and evaluation of antibodies against neutrophil-activating protein of Helicobacter pylori in patients with gastric cancer.</a> World J. Gastroenterol. 15 (19), 2381-2388 (2009).</li><li>Song, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CagA-independent+cluster+of+antigens+related+to+the+risk+of+noncardia+gastric+cancer:+associations+between+Helicobacter+pylori+and+gastric+adenocarcinoma+explored+by+multiplex+serology.">A CagA-independent cluster of antigens related to the risk of noncardia gastric cancer: associations between Helicobacter pylori and gastric adenocarcinoma explored by multiplex serology.</a> Int. J. Cancer. 134 (12), 2942-2950 (2014).</li><li>Kottakis, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helicobacter+pylori+neutrophil-activating+protein+activates+neutrophils+by+its+C-terminal+region+even+without+dodecamer+formation,+which+is+a+prerequisite+for+DNA+protection--novel+approaches+against+Helicobacter+pylori+inflammation.">Helicobacter pylori neutrophil-activating protein activates neutrophils by its C-terminal region even without dodecamer formation, which is a prerequisite for DNA protection--novel approaches against Helicobacter pylori inflammation.</a> FEBS J. 275 (2), 302-317 (2008).</li><li>Thoreson, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+surface-exposed+antigen+expression+between+Helicobacter+pylori+isolated+from+duodenal+ulcer+patients+and+from+asymptomatic+subjects.">Differences in surface-exposed antigen expression between Helicobacter pylori isolated from duodenal ulcer patients and from asymptomatic subjects.</a> J. Clin. Microbiol. 38 (9), 3436-3441 (2000).</li><li>Wang, C. A., Liu, Y. C., Du, S. Y., Lin, C. W., Fu, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helicobacter+pylori+neutrophil-activating+protein+promotes+myeloperoxidase+release+from+human+neutrophils.">Helicobacter pylori neutrophil-activating protein promotes myeloperoxidase release from human neutrophils.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 377 (1), 52-56 (2008).</li><li>Iyer, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+surface+area+chromatography+for+flow-through+purification+of+viruses+and+virus+like+particles.">Reduced surface area chromatography for flow-through purification of viruses and virus like particles.</a> J. Chromatogr. A. 1218 (26), 3973-3981 (2011).</li><li>Wongchuphan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+rabbit+polyclonal+immunoglobulin+G+using+anion+exchangers.">Purification of rabbit polyclonal immunoglobulin G using anion exchangers.</a> Process Biochem. 46 (1), 101-107 (2011).</li><li>Lu, X., Zhao, D., Su, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+hemoglobin+by+ion+exchange+chromatography+in+flow-through+mode+with+PEG+as+an+escort.">Purification of hemoglobin by ion exchange chromatography in flow-through mode with PEG as an escort.</a> Artif. Cells Blood Substit. Immobil. Biotechnol. 32 (2), 209-227 (2004).</li><li>Brooks, S. P., Storey, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+a+protein+phosphatase+that+dephosphorylates+pyruvate+kinase+in+an+anoxia+tolerant+animal.">Purification and characterization of a protein phosphatase that dephosphorylates pyruvate kinase in an anoxia tolerant animal.</a> Biochem. Mol. Biol. Int. 38 (6), 1223-1234 (1996).</li><li>Gewirtz, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+typhimurium+translocates+flagellin+across+intestinal+epithelia,+inducing+a+proinflammatory+response.">Salmonella typhimurium translocates flagellin across intestinal epithelia, inducing a proinflammatory response.</a> J. Clin. Invest. 107 (1), 99-109 (2001).</li><li>Levison, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+ion-exchange+column+chromatography+of+proteins:+Comparison+of+different+formats.">Large-scale ion-exchange column chromatography of proteins: Comparison of different formats.</a> J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 790 (1-2), 17-33 (2003).</li><li>Lee, M. F. X., Chan, E. S., Tey, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+chromatography:+Progress,+applications+and+future+perspectives.">Negative chromatography: Progress, applications and future perspectives.</a> Process Biochem. 49 (6), 1005-1011 (2014).</li><li>Yang, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+yield+purification+of+Helicobacter+pylori+neutrophil-activating+protein+overexpressed+in+Escherichia+coli.">High yield purification of Helicobacter pylori neutrophil-activating protein overexpressed in Escherichia coli.</a> BMC biotechnol. 15 (23), (2015).</li><li>Iankov, I. D., Haralambieva, I. H., Galanis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogenicity+of+attenuated+measles+virus+engineered+to+express+Helicobacter+pylori+neutrophil-activating+protein.">Immunogenicity of attenuated measles virus engineered to express Helicobacter pylori neutrophil-activating protein.</a> Vaccine. 29 (8), 1710-1720 (2011).</li><li>Shih, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+chromatographic+purification+of+Helicobacter+pylori+protein+expressed+in+Bacillus+subtilis.">One-step chromatographic purification of Helicobacter pylori protein expressed in Bacillus subtilis.</a> PLoS One. 8 (4), e60786 (2013).</li><li>Liu, H., Naismith, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+one-step+site-directed+deletion,+insertion,+single+and+multiple-site+plasmid+mutagenesis+protocol.">An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol.</a> BMC biotechnol. 8 (91), (2008).</li><li>Karnik, A., Karnik, R., Grefen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SDM-assist+software+to+design+site-directed+mutagenesis+primers+introducing+'silent'+restriction+sites.">SDM-assist software to design site-directed mutagenesis primers introducing 'silent' restriction sites.</a> BMC bioinformatics. 14 (105), (2013).</li></ol>

Burada sunulan DEAE anyon-değişim reçineleri ile negatif mod toplu kromatografisi E coli içinde aşırı eksprese rekombinant HP NAP saflaştırılması için uygundur. Hücre lizizi ve saflaştırma aşamasında kullanılan tamponların pH değerleri E. HP-NAP çözünürlüğünü sağlamak için çok önemlidir E. coli lizatları ve sırasıyla konak hücre yabancı maddelerden rekombinant HP NAP verimli ayrılması. Bakteri hücreleri, pH 9.0 lize olmalıdır ve negatif saflaştırma y...

Helikobakter pilori (H. pilori) gastrit ve peptik ülser bir ana sebebidir. Bu bakteri, aynı zamanda Kanser, Dünya Sağlık Örgütü adına Araştırmaları Uluslararası Ajansı tarafından insanlarda karsinojen olarak sınıflandırılmıştır, 1994 yılında tahmin edildiğini H. prevalansı pylori enfeksiyonu gelişmekte olan ülkelerde% 70 ve sanayileşmiş ülkelerde 1 30-40% &#39;dir. Olsa H. enfeksiyon oranı pylori, sanayileşmiş ülkelerde H. enfeksiyon oranını azaltmak olduğunu Gelişmekte olan ülkelerde pylori halen 2 yüksektir. Standart tedavi H. ortadan kaldırmak için pylori enfeksiyonu, bir proton pompası inhibitörü, PPI ve iki antibiyotik, klaritromisin artı amoksisilin veya metronidazol 3 uygulanmasından oluşur. H. antibiyotik direnci Ancak, yükselişi pylori ülser tedavisi o önlemek için yeni stratejilerin geliştirilmesini çağrısı lır enfeksiyonu tedavi. H. karşı önleyici ve / veya terapötik bir aşı geliştirilmesi H. pylori kontrol etmek için alternatif bir yaklaşım sağlayabilir pylori enfeksiyonunun. Helikobakter pilori nötrofil aktive edici protein (HP-NAP), H. pylori önemli bir virülans faktörü, birinci bir H. su ekstreleri tespit edilmiştir endotel hücrelerine ve reaktif oksijen türlerini (ROS) 4 üretmek için uygun nötrofillerin aktive etme kabiliyetine sahip pylori. H. bulunan mide mukozasının nötrofil infiltrasyonu pylori- aktif gastrit ile enfekte olan hastalarda mide enflamasyon ve doku hasarına yol açabilir. Bu nedenle, HP-NAP fazla ülser veya H. neden gastrik enflamasyon, indükleme nötrofillerin aktive ederek patolojik bir rol oynayabilir pylori mide hastalıkları -associated. Bununla birlikte, HP-NAP klinik uygulamalara 5,6 için potansiyel bir adaydır. Nedeniyle bağışıklık ve bağışıklık düzenleyici proHP UEP perties, bu proteinin aşılar, terapötik ajanlar ve diyagnostik araçlar geliştirmek için kullanılabilir. Bir klinik çalışma H. karşı bir protein aşı bileşenleri olarak yeniden birleştirici HP NAP kullanılarak gerçekleştirilmiştir pylori. Bu aşının, alüminyum hidroksit ile birlikte formüle rekombinant HP NAP, sitotoksin ilişkili gen A (CagA) ve vakuolasyon sitotoksin A (VacA) proteinlerden oluşur ve daha fazla güvenli ve insanlarda 7 imünojenik olduğu gösterilmiştir. Ayrıca HP NAP-kanser terapisi 8 immün yanıtları -polarized aşağı alerjik reaksiyonlar ve parazit enfeksiyonları 9,10 ile ortaya çıkarılan Th2 immün yanıtları düzenleyen (Th1) T yardımcı tip 1 tetiklemek için güçlü bir bağışıklık düzenleyici olarak işlev görür. Diagnostik olarak, yeniden birleştirici HP NAP-tabanlı ELISA H. HP-NAP karşı serum antikorları tespit etmek için uygulanmıştır pylori hasta 11 ile enfekte. Bir çalışma göstermiştir ki H. serumunda HP NAP-özgü antikorların seviyesi pylori mide kanserli hastaların kronik gastrit 12 olan hastalardan alınan göre anlamlı derecede yüksek olduğu ile enfekte. Bir başka çalışma, HP-NAP karşı serum antikorları olmayan kardiya gastrik adenokarsinoma 13 varlığı ile ilişkili olduğunu göstermiştir. Bu nedenle, yeniden birleştirici HP NAP-tabanlı ELISA H. mide kanseri prognoz için HP-NAP karşı serum antikorları tespit etmek için tatbik edilebilir pylori hastaları ile enfekte. Birlikte ele alındığında, arıtılmış, HP-NAP daha önleme, tedavi için kullanılan ve H. prognozu edilebilir pylori hastalıkları yanı sıra kanser tedavisi -associated. Rekombinant HP NAP saflaştırılması için kullanılan çeşitli yöntemler arasında doğal biçiminde Escherichia coli (E. Coli) &#39;de ifade edilen ikinci bir saflaştırma aşaması ile ilgili jel filtrasyon kromatografisi yüksek ölçüde saf, HP-NAP 14-16 elde etmek için gerekli olan şu ana kadar rapor . Burada, negatif mod toplu kromatografisi kullanılarak bir yöntemdietilaminoetil (DEAE) iyon-değiştirme reçineleri E. aşırı eksprese HP NAP saflaştırılması için açıklanan yüksek verim ve yüksek saflıkta coli. Bu saflaştırma tekniği konakçı hücre proteinleri ve / veya reçine HP-NAP dışındaki yabancı maddeler bağlanmasının dayanıyordu. pH 8.0, HP-NAP dışında neredeyse başka hiçbir proteinler bağlanmamış fraksiyonu geri kazanılır. negatif modda DEAE iyon değişimi kromatografisi kullanılarak bu saflaştırma yaklaşımı basit ve zaman bağlı olmayan fraksiyon toplama yoluyla tek adımlı kromatografisi ile yeniden birleştirici HP NAP saflaştırılmasını sağlayarak kazandıran. 17, immünoglobülin G (IgG) 18 hemoglobin 19, protein fosfataz 20 ve hastalık oluşturma faktörü flagellin 21 virüsleri gibi, aynı zamanda negatif iyon değişim kromatografisi ile saflaştırılabilir bildirilmiştir HP-NAP, birçok biyomoleküllerin ek olarak, modu. yabancı maddeler küçük ise negatif mod iyon değişimli kromatografi için tercih edilirtabi numunede mevcut olan bileşenlerin 22 arıtılacak. Doğal ya da yeniden birleştirici biyomoleküllerin saflaştırma negatif kromatografi uygulanması en son 23 gözden geçirilmiştir. Bu rapor E. rekombinant HP NAP ifadesi için adım protokolü tarafından bir adım sağlar E. coli, DEAE iyon değişim reçineleri ile negatif mod toplu kromatografisi kullanılarak HP-UEP hücrelerin parçalanması ve saflaştırılması. arıtma için arzu edilen bir protein negatif modda iyon değiştirme kromatografisi için uygun ise, açıklanan protokol, aynı zamanda bir saflaştırma işleminin geliştirilmesi için bir başlangıç ​​noktası olarak adapte edilebilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET42a-NAP&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>prepared as described in Supplementary data of Refernce 15&#160; 
			http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0006291X08018317</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli BL21 (DE3)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc</td>
			<td>C6000-03</td>
			<td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/C600003</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>25389-94-0</td>
			<td>http://www.amresco-inc.com/KANAMYCIN-SULFATE-0408.cmsx</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>MD Biomedical Inc</td>
			<td>101-367-93-1</td>
			<td>http://www.antibody-antibodies.com/product_det.php?id=238064&#38;supplier=search&#38;name =IPTG%20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10837091001</td>
			<td>protease inhibitor 
			http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/PMSFRO?lang=en&#38;region=TW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-alpha-tosyl-L-lysinyl-chloromethylketone (TLCK)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7254</td>
			<td>protease inhibitor 
			http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t7254?lang=en&#38;region=TW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-tosyl-L-phenylalaninyl-chloromethylketone (TPCK)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4376</td>
			<td>protease inhibitor 
			http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t4376?lang=en&#38;region=TW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad protein assay dye reagent concentrate</td>
			<td>Bio&#8208;Rad</td>
			<td>500-0006</td>
			<td>for protein quantitation 
			http://www.bio-rad.com/en-us/sku/5000006-bio-rad-protein-assay-dye-reagent-concentrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein standard (bovine serum albumin)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5619&#160;</td>
			<td>a standard protein for Bio-Rad Protein Assay 
			http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/p5619?lang=en&#38;region=TW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEAE&#8211;Sephadex &#160;A-25 chloride form</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A25120</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a25120?lang=en&#38;region=TW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrum/Por dialysis tubing</td>
			<td>Spectrum Laboratories</td>
			<td>132720</td>
			<td>with molecular weight cutoff of 14 kDa 
			http://www.spectrumlabs.com/dialysis/RCtubing.html?Pn=132720;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrodisc&#174; units with Mustang&#174; E membrane</td>
			<td>Pall</td>
			<td>MSTG25E3</td>
			<td>for endotoxin removal; operated at flow rates ranging from 1 to 4 ml/min 
			http://www.pall.com/main/laboratory/product.page?id=19992</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse monoclonal antibody MAb 16F4</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>raised against the purified HP-NAP of H. pylori strain NCTC 11637 as described in Refernce 23;&#160; A gift from Drs. Evanthia Galanis and Ianko D. Iankov at Mayo Clinic, USA 
			http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0264410X10017585</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiLoad 16/600 Superdex 200 pg</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>28989335</td>
			<td>for gel filtration chromatography 
			http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/28989335</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PlusOne silver staining kit, protein</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17-1150-01</td>
			<td>http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/17115001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque PLUS</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17-1440-02</td>
			<td>for density gradient centrifugation to purify human neutrophils 
			http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences-tw/products/AlternativeProductStructure _16963/17144002</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat bottom 96-well white plate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc</td>
			<td>236108</td>
			<td>http://www.thermoscientific.com/en/product/nunc-f96-microwell-black-white-polystyrene-plate.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8511</td>
			<td>protected from light 
			http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a8511?lang=en&#38;region=TW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Expand &#160;long template PCR system</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11681834001</td>
			<td>source of High Fidelity PCR enzyme mix 
			http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/elongro?lang=en&#38;region=TW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dpn I</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0176S</td>
			<td>https://www.neb.com/products/r0176-dpni</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xho I</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0146S</td>
			<td>https://www.neb.com/products/r0146-xhoi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli DH5&#945;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc</td>
			<td>18265-017</td>
			<td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/18265017</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Product Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td> 
			&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-2800 double beam UV/VIS spectrophotometer</td>
			<td>Hitachi&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td>out of market and upgraded to a new model 
			http://hitachi-hta.com/products/life-sciences-chemical-analysis/uvvisible-spectrophotometers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EmulsiFlex-C3 high pressure homogenizer</td>
			<td>Avestin Inc</td>
			<td>C315320</td>
			<td>http://www.avestin.com/English/c3page.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hitachi Koki himac CP80WX general ultracentrifuge</td>
			<td>Hitachi Koki Co</td>
			<td>90106401</td>
			<td>for separation of the soluble and insoluble protein fractions from E. coli lysates 
			http://centrifuges.hitachi-koki.com/products/ultra/cp_wx/cp_wx.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;KTA FPLC</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>18-1900-26</td>
			<td>for gel filtration chromatography 
			http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/18190026</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aviv model 62ADS CD spectrophotometer</td>
			<td>Aviv Biomedical</td>
			<td>N/A</td>
			<td>out of market and upgraded to a new model 
			http://www.avivbiomedical.com/circular.php</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS-3000 imaging system</td>
			<td>Fujifilm</td>
			<td>N/A</td>
			<td>discontinued and replaced 
			http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/28955810</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wallac 1420 (Victor2) multilabel counter</td>
			<td>Perkin-Elmer</td>
			<td>1420-018</td>
			<td>for chemiluminescence detection 
			http://www.perkinelmer.com/catalog/product/id/1420-018</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

one-step negative chromatographic purification of helicobacter pylori neutrophil-activating protein overexpressed in escherichia coli in batch mode

Helikobakter pilori nötrofil aktive edici protein (HP-NAP) Helicobacter pylori (H. pylori) önemli bir virülans faktörü olduğu. Bu H. kritik bir rol oynar pylori nötrofiller, monositler ve mast hücreleri dahil olmak üzere birçok doğuştan lökositlerin aktive ederek mide iltihabı indüklenen. HP-NAP bağışıklık ve bağışıklık düzenleyici özellikleri onu H. için potansiyel bir tanı ve aşı adayı yapmak pylori ve kanser tedavisi için yeni bir ilaç adayı. klinik uygulamalarda kullanılan arıtılmış, HP-NAP önemli miktarlarda elde etmek için, etkili bir yöntem, yüksek verim ve saflıkta bu proteinin oluşturulmasına ihtiyaç saflaştırmak için. Bu protokol, dietilaminoetil (DEAE), iyon değiştirme reçineleri kullanılarak, Escherichia coli (E. Coli) &#39;de rekombinant aşırı eksprese HP UEP tek adımlı negatif kromatografik arıtma için bir yöntem tanımlanmıştır (örn., Sephadex i)n toplu modunda. Rekombinant HP-NAP E. toplam proteinin yaklaşık% 70 oluşturmaktadır E. coli ve hemen hemen tam olarak pH 9.0 hücre lizizi sonrasında çözünebilir fraksiyondan elde edilir. PH 8.0&#39;da iyi şartlar altında, HP-NAP çoğunluğu bağlanmamış fraksiyon geri kazanılır ise E. endojen proteinler E. coli etkin reçinesi ile giderilirler. DEAE iyon değişim reçineleri ile negatif mod toplu kromatografisi kullanılarak bu saflaştırma yöntemi E fonksiyonel HP NAP verir yüksek verim ve saflıkta doğal biçiminde coli. Saflaştınldı HP NAP daha önleme, tedavi için kullanılan ve H. prognozu edilebilir pylori hastalıkları yanı sıra kanser tedavisi -associated.

Rekombinant HP-NAP negatif arınma deneysel işlemin şematik E. ifade Toplu modunda DEAE iyon değişim reçineleri kullanılarak E. coli, Şekil 1 &#39;de gösterilmiştir. Bu saflaştırma tekniği konakçı hücre proteinleri ve / veya reçine HP-NAP dışındaki yabancı maddeler bağlanmasının dayanmaktadır. PH 8.0 &#39;de, kendi doğal formunda HP NAP dışında hemen hemen hiçbir proteinler, bağlanmamış fraksiyon (Şekil ...

Watch this Scientific Journal Video about One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode at JoVE.co

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

Rekombinant Helicobacter tek-aşamalı negatif saflaştırılması için yüksek verimli bir yöntem tarif edilmektedir küme modunda dietilaminoetil reçineleri kullanılarak Escherichia coli içinde aşırı eksprese nötrofil aktive edici protein (HP-NAP) pylori. Bu yöntem ile arıtılmış, HP-NAP H. aşı, ilaç veya teşhis maddelerinin geliştirilmesi için faydalıdır pylori hastalıkları -associated.

Tek adımlı olumsuz Kromatografik arıtma<em&gt; Helicobacter pylori</em&gt; Nötrofil-aktive protein aşın<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Toplu Modunda

Helicobacter pylori neutrophil-activating protein (HP-NAP) is a major virulence factor of Helicobacter pylori (H. pylori). It plays a critical role in H. ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

MALDI-TOF kütle spektrometrisi kullanılarak kan kültür besi yerinden, Gram negatif bakterilerin hızlı belirlenmesi

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Neuropathogenic olmayan İnvaziv Modeli<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Yenidoğan Sıçan Enfeksiyon

Investigation of the interactions between animal host and bacterial pathogen is only meaningful if the infection model employed replicates the principal ...

High Resolution Electron Microscopy of the Helicobacter pylori Cag Type IV Secretion System Pili Produced in Varying Conditions of Iron Availability

High Resolution Electron Microscopy of the Helicobacter pylori Cag Type IV Secretion System Pili Produced in Varying Conditions of Iron Availability

Yüksek çözünürlüklü elektron mikroskobu<em&gt; Helikobakter pilori</emDemir Kullanılabilirlik Değişen Koşullarda Üretilen&gt; Çağ Tip IV Salgı Sistemi Pili

Helicobacter pylori is a helical-shaped, gram negative bacterium that colonizes the human gastric niche of half of the human population1,2.  H. pylori is ...

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

Non-invaziv Vivo içinde Bioluminescence sistemi tarafından fare konak Enterohemorrhagic Escherichia Coli kolonizasyon algılama

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome ...

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Bir yoğun Transposon ekleme kütüphane kullanarak bakteriyel konjugasyon Escherichia Coli Enterobacterial suşları gibi veya Shigella flexneri oluşturulması

Transposon mutagenesis is a method that allows gene disruption via the random genomic insertion of a piece of DNA called a transposon. The protocol below ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Aşırı Ezme ve İnsanın Saflaştırılması<em&gt; Cis</em&gt; -prenıltransferaz in<em&gt; Escherichia coli</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

A Facile Protocol to Generate Site-Specifically Acetylated Proteins in Escherichia Coli

A Facile Protocol to Generate Site-Specifically Acetylated Proteins in Escherichia Coli

Escherichia Coli proteinler Site-Specifically oluşturmak için Facile iletişim kuralı Acetylated

Post-translational modifications that occur at specific positions of proteins have been shown to play important roles in a variety of cellular processes. ...

Dissecting Multi-protein Signaling Complexes by Bimolecular Complementation Affinity Purification (BiCAP)

Dissecting Multi-protein Signaling Complexes by Bimolecular Complementation Affinity Purification BiCAP

Bimolecular tamamlayıcı benzeşme arıtma (BiCAP) tarafından parçalanmış çok protein sinyal kompleksleri

The assembly of protein complexes is a central mechanism underlying the regulation of many cell signaling pathways. A major focus of biomedical research ...

Using Enhanced Green Fluorescence Protein-expressing Escherichia Coli to Assess Mouse Peritoneal Macrophage Phagocytosis

Using Enhanced Green Fluorescence Protein-expressing Escherichia Coli to Assess Mouse Peritoneal Macrophage Phagocytosis

Yeşil floresans Protein-ifade gelişmiş kullanma fare Peritoneal makrofaj fagositoz değerlendirmek için Escherichia Coli

This manuscript describes a simple and reproducible method to perform a phagocytosis assay. The first part of this method involves building a ...

Purification of a High Molecular Mass Protein in Streptococcus mutans

Purification of a High Molecular Mass Protein in Streptococcus mutans

Streptococcus mutans'larda Yüksek Moleküler Kütle Proteininin Saflaştırılması

Elucidation of a gene&#39;s function typically involves comparison of phenotypic traits of wild-type strains and strains in which the gene of interest has ...