Name: assessment of myofilament ca2+ sensitivity underlying cardiac excitation-contraction coupling
Uploaded: 2016-08-01T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Myofilament Ca2+ Sensitivity Underlying Cardiac Excitation-contraction Coupling at JoVE.com

Esta pesquisa foi apoiada pelo Programa de Pesquisa em Ciência Básica através da Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia (NRF), financiado pelo Ministério da Educação, Ciência e Tecnologia (2013068067); pelo Programa de Pós-Graduação Cérebro Korea 21 do Ministério da Educação, Ciência e Tecnologia, Hospital da Universidade Nacional de Seul, a sociedade coreana de Hipertensão (2013), SK Fund Research Telecom coreano (no. 3420130290) e da Fundação Nacional de Ciência Natural da China (NSFC 31460265; 81260035 NSFC).

O protocolo está de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório publicados pelos Institutos Nacionais da ONU de Saúde (NIH Publication No. 85-23, revista em 1996). Foi aprovado pelo Comitê Institucional de Animal Care and Use (IACUC) da Universidade Nacional de Seul (aprovação IACUC no .: SNU-101213-1). 1. Tampão de Preparação (Materiais de mesa e equipamentos) <ol><li> Preparar 300 ml de solução de isolamento de fresco no dia da experiência (em mM: NaCl, 1...

<ol>
	<li>Bers, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+excitation-contraction+coupling.">Cardiac excitation-contraction coupling.</a> Nature. 415 (6868), 198-205 (2002).</li><li>Eisner, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+analysis+of+calcium+cycling+in+cardiac+muscle.">Integrative analysis of calcium cycling in cardiac muscle.</a> Circ Res. 87 (12), 1087-1094 (2000).</li><li>Palmiter, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+regulating+the+myofilament+response+to+Ca2+:+implications+of+mutations+causal+for+familial+hypertrophic+cardiomyopathy.">Molecular mechanisms regulating the myofilament response to Ca2+: implications of mutations causal for familial hypertrophic cardiomyopathy.</a> Basic Res Cardiol. 92 (S1), 63-74 (1997).</li><li>Missiaen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+intracellular+Ca2++homeostasis+and+disease.">Abnormal intracellular Ca2+ homeostasis and disease.</a> Cell Calcium. 28 (1), 1-21 (2000).</li><li>Trafford, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel,+rapid+and+reversible+method+to+measure+Ca+buffering+and+time-course+of+total+sarcoplasmic+reticulum+Ca+content+in+cardiac+ventricular+myocytes.">A novel, rapid and reversible method to measure Ca buffering and time-course of total sarcoplasmic reticulum Ca content in cardiac ventricular myocytes.</a> Pflugers Arch. 437 (3), 501-503 (1999).</li><li>Berlin, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+cytosolic+calcium+buffering+properties+of+single+rat+cardiac+myocytes.">Intrinsic cytosolic calcium buffering properties of single rat cardiac myocytes.</a> Biophys J. 67 (4), 1775-1787 (1994).</li><li>Robertson, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+time-course+of+Ca2++exchange+with+calmodulin,+troponin,+parvalbumin,+and+myosin+in+response+to+transient+increases+in+Ca2+.">The time-course of Ca2+ exchange with calmodulin, troponin, parvalbumin, and myosin in response to transient increases in Ca2+.</a> Biophys J. 34 (3), 559-569 (1981).</li><li>Schober, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myofilament+Ca2++sensitization+increases+cytosolic+Ca2++binding+affinity,+alters+intracellular+Ca2++homeostasis,+and+causes+pause-dependent+Ca2+-triggered+arrhythmia.">Myofilament Ca2+ sensitization increases cytosolic Ca2+ binding affinity, alters intracellular Ca2+ homeostasis, and causes pause-dependent Ca2+-triggered arrhythmia.</a> Circ Res. 112 (2), 170-179 (2012).</li><li>Briston, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Balanced+changes+in+Ca+buffering+by+SERCA+and+troponin+contribute+to+Ca+handling+during+&#946;-adrenergic+stimulation+in+cardiac+myocytes.">Balanced changes in Ca buffering by SERCA and troponin contribute to Ca handling during &#946;-adrenergic stimulation in cardiac myocytes.</a> Cardiovasc Res. 104 (2), 347-354 (2014).</li><li>Patel, B. G., Wilder, T., John Solaro, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+control+of+cardiac+myofilament+response+to+calcium+by+S-glutathionylation+at+specific+sites+of+myosin+binding+protein+C.">Novel control of cardiac myofilament response to calcium by S-glutathionylation at specific sites of myosin binding protein C.</a> Front Physiol. 4, 336 (2013).</li><li>Jin, C. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myofilament+Ca2++desensitization+mediates+positive+lusitropic+effect+of+neuronal+nitric+oxide+synthase+in+left+ventricular+myocytes+from+murine+hypertensive+heart.">Myofilament Ca2+ desensitization mediates positive lusitropic effect of neuronal nitric oxide synthase in left ventricular myocytes from murine hypertensive heart.</a> J Mol Cell Cardiol. 60, 107-115 (2013).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+L-type+Ca2++channel+activity+by+neuronal+nitric+oxide+synthase+and+myofilament+Ca2++sensitivity+in+cardiac+myocytes+from+hypertensive+rat.">Modulation of L-type Ca2+ channel activity by neuronal nitric oxide synthase and myofilament Ca2+ sensitivity in cardiac myocytes from hypertensive rat.</a> Cell Calcium. 58 (3), 264-274 (2015).</li><li>Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+cardiomyocyte+isolation,+culture,+and+gene+transfer.">Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer.</a> J Mol Cell Cardiol. 51 (3), 288-298 (2011).</li><li>Spurgeon, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytosolic+calcium+and+myofilaments+in+single+rat+cardiac+myocytes+achieve+a+dynamic+equilibrium+during+twitch+relaxation.">Cytosolic calcium and myofilaments in single rat cardiac myocytes achieve a dynamic equilibrium during twitch relaxation.</a> J Physiol. 447, 83-102 (1992).</li><li>Preston, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+effects+of+the+DCM+mutant+Gly159Asp+troponin+C+in+skinned+muscle+fibres.">Functional effects of the DCM mutant Gly159Asp troponin C in skinned muscle fibres.</a> Pflugers Arch. 453 (6), 771-776 (2007).</li><li>Willott, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+Troponin+that+cause+HCM,+DCM+AND+RCM:+what+can+we+learn+about+thin+filament+function?.">Mutations in Troponin that cause HCM, DCM AND RCM: what can we learn about thin filament function?.</a> J Mol Cell Cardiol. 48 (5), 882-892 (2010).</li><li>Yasuda, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+to+study+contraction+characteristics+of+a+single+cardiac+myocyte+using+carbon+fibers.">A novel method to study contraction characteristics of a single cardiac myocyte using carbon fibers.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 281 (3), H1442-H1446 (2001).</li><li>Sears, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+neuronal+nitric+oxide+synthase+isoform+regulates+myocardial+contraction+and+calcium+handling.">Cardiac neuronal nitric oxide synthase isoform regulates myocardial contraction and calcium handling.</a> Circ Res. 92 (5), e52-e59 (2003).</li><li>Ashley, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+nitric+oxide+synthase+1+regulates+basal+and+beta-adrenergic+contractility+in+murine+ventricular+myocytes.">Cardiac nitric oxide synthase 1 regulates basal and beta-adrenergic contractility in murine ventricular myocytes.</a> Circulation. 105 (25), 3011-3016 (2002).</li><li>Zhang, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+phospholamban+phosphorylation+is+associated+with+impaired+relaxation+in+left+ventricular+myocytes+from+neuronal+NO+synthase-deficient+mice.">Reduced phospholamban phosphorylation is associated with impaired relaxation in left ventricular myocytes from neuronal NO synthase-deficient mice.</a> Circ Res. 102 (2), 242-249 (2008).</li><li>Roe, M. W., Lemasters, J. J., Herman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+Fura-2+for+measurements+of+cytosolic+free+calcium.">Assessment of Fura-2 for measurements of cytosolic free calcium.</a> Cell Calcium. 11 (2-3), 63-73 (1990).</li><li>Grynkiewicz, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+generation+of+Ca2++indicators+with+greatly+improved+fluorescence+properties.">A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.</a> J Biol Chem. 260 (6), 3440-3450 (1985).</li></ol>

Aqui, descrevemos os protocolos para avaliar as alterações de sensibilidade dos miofilamentos Ca 2+ em um único miócitos cardíacos isolados e enfatizar a importância de se medir este parâmetro juntamente com propriedades eletrofisiológicas, intracelulares de Ca2 + transientes, ea dinâmica dos miofilamentos. Isto é porque as gravações de um ou dois dos parâmetros não podem explicar os mecanismos subjacentes a contracção cardíaca e relaxamento. Ao contrário dos métodos convencionai...

Acoplamento de excitação-contracção cardíaca (CE) é o esquema fundamental para analisar as propriedades mecânicas do miocárdio, ou seja, a função contráctil do coração 1,2. CE de acoplamento é iniciado pela despolarização da membrana secundária para as actividades dos canais de iões de sarcolema (por exemplo, a voltagem-canal de Na +, que pode ser medido através de técnicas de patch-clamp). Activação subsequente do tipo L dependentes da voltagem canais de Ca2 + (LTCCs) e influxo de Ca2 + através LTCCs desencadear a grandes quantidades de libertação de Ca2 + através dos receptores de rianodina (RyRs), aumentando a concentração citosólica de Ca2 + a partir do nanomolar (nM ) a micromolar nível (^ M). Um tal aumento no Ca 2+ citosólica de Ca2 + promove a ligação à troponina C (TNC) em filamentos finos e induz alterações conformacionais do complexo filamento para facilitar a interacção actina-miosina e alcança myocardial contração 3. Por outro lado, o Ca2 + citosólico é re-captado volta para o retículo sarcoplasmático (RS) através da Ca2 + -ATPase em SR (SERCA2a) ou é extrudada para fora do miócito através do Na + / Ca2 + e o permutador de plasmalemmal Ca2 + ATPase 1,2. Consequentemente, o declínio no Ca 2+ citosólico instiga mudanças conformacionais de filamentos finos de volta ao estado original, resultando na dissociação da actina-miosina e miócitos relaxamento 1-3. Neste esquema, a actividade da SERCA2a é geralmente considerada para determinar a velocidade de relaxamento do miocárdio porque é responsável por 70 - 90% de remoção citosólica de Ca2 + na maioria das células de mamífero do coração 1. Como tal, anormal manipulação de Ca 2+ por LTCC, RyR e SERCA2a, etc. tem sido considerado os mecanismos principais para comprometimento da contratilidade e relaxamento no coração doente 1-4. de Ca2 +, que funciona como o mensageiro em contas de acoplamento CE para cerca de 1% do total de Ca 2+ e a maioria dos Ca 2+ é obrigado a intracelulares de Ca2 + buffers 5,6. Isto é devido ao facto de vários tampões Ca 2+ são abundantes em miócitos cardíacos, por exemplo, fosfolípidos de membrana, ATP, fosfocreatina, a calmodulina, a parvalbumina, miofibrila TnC, miosina, SERCA2a, e calsequestrin no SR. 5,6,7. Entre eles, SERCA2a e TnC são as predominantes Ca 2+ buffers 5,6,7. Além disso, o Ca 2+ ligação aos seus tampões é um processo dinâmico durante tique (por exemplo, 30-50% de Ca 2+ se liga a TnC e dissociam-se que durante os transientes de Ca2 + 7) e a alteração no Ca 2+ causa adicional de ligação &quot;libertação&quot; de Ca2 + livre para o citosol, os resultados nas alterações do Ca2 + intracelular concentration. Consequentemente, a perturbação do nível intracelular de Ca 2+ induz movimentos miofilamentos anormais, que são os precursores da disfunção contráctil e arritmias 8,9. Muitos factores (tanto fisiológicos e patológicos) podem ser as fontes de modificações pós-transcricionais de proteínas miofilamentos, que influenciam miofilamentos Ca 2+ e de tamponamento miofilamentos Ca 2+ sensibilidade 8-10. Recentemente, foi relatado que mutações em proteínas miofilamentos aumentar o Ca2 + intracelular e a afinidade de ligação a manipulação de Ca2 +, desencadeando a potenciação dependente de pausa de transientes de Ca2 +, Ca2 +, libertação anormal e arritmias 8. De acordo com este conceito, mostrámos também que miofilamentos Ca 2+ dessensibilização em corações de ratos hipertensos secundárias à sobre-regulação da sintase do óxido nítrico neuronal está associada com elevada diastólica e sistólica Ca 2+ níveis11, que por sua vez, aumenta a vulnerabilidade do LTCC ao Ca2 + inactivação dependente 12. Assim, miofilamentos Ca 2+ sensibilidade é um regulador &quot;ativo&quot; da função contrátil intracelular de Ca2 + homeostase e miócitos. Tornou-se necessário analisar as interacções entre miofilamentos e Ca 2+ manipulação proteínas para investigação aprofundada sobre miócitos acoplamento CE e função cardíaca. Aqui, descrevemos um protocolo que avalia as mudanças de miofilamentos Ca 2+ sensibilidade em miócitos cardíacos isolados. Análise abrangente do intracelular perfil Ca 2+, miofilamentos Ca 2+ sensibilidade e contração vai descobrir novos mecanismos mecânicos do miocárdio subjacentes.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1136">
	<tbody>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:66px;width:315px;">Sprague Dawley rat</td>
			<td style="width:131px;">Koatech</td>
			<td style="width:125px;"></td>
			<td style="width:565px;">8-12 weeks</td>
		</tr>
		<tr height="54">
			<td height="54" style="height:54px;width:315px;">Pentobarbital Sodium</td>
			<td style="width:131px;">Hanlim Pharmaceutical (Korea)</td>
			<td style="width:125px;">AHN901</td>
			<td style="width:565px;">Insurance code:645301220</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">NaCl</td>
			<td style="width:131px;">Sigma</td>
			<td style="width:125px;">S9625</td>
			<td style="width:565px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">KCl</td>
			<td style="width:131px;">Sigma</td>
			<td style="width:125px;">P4504</td>
			<td style="width:565px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">NaH2PO4</td>
			<td style="width:131px;">Sigma</td>
			<td style="width:125px;">S8282</td>
			<td style="width:565px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">HEPES</td>
			<td style="width:131px;">Sigma</td>
			<td style="width:125px;">H3375</td>
			<td style="width:565px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Glucose</td>
			<td style="width:131px;">Sigma</td>
			<td style="width:125px;">G8270</td>
			<td style="width:565px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">CaCl2</td>
			<td style="width:131px;">Biosesang</td>
			<td style="width:125px;">C2002</td>
			<td style="width:565px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">MgCl2</td>
			<td style="width:131px;">Biosesang</td>
			<td style="width:125px;">M2001</td>
			<td style="width:565px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Mannitol</td>
			<td style="width:131px;">Sigma</td>
			<td style="width:125px;">M4125</td>
			<td style="width:565px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:315px;">MgSO4</td>
			<td style="width:131px;">Sigma</td>
			<td style="width:125px;">M5921</td>
			<td style="width:565px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Sodium Pyruvate</td>
			<td style="width:131px;">Sigma</td>
			<td style="width:125px;">P2256</td>
			<td style="width:565px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Taurine</td>
			<td style="width:131px;">Merck</td>
			<td style="width:125px;">8.08616.1000</td>
			<td style="width:565px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Na2HPO4&#160;</td>
			<td style="width:131px;">Sigma</td>
			<td style="width:125px;">71649</td>
			<td style="width:565px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Bovine Fetal Albumin</td>
			<td style="width:131px;">Sigma</td>
			<td style="width:125px;">A7906</td>
			<td style="width:565px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Collagenase Type 2</td>
			<td style="width:131px;">Worthington</td>
			<td style="width:125px;">LS004177</td>
			<td style="width:565px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Protease</td>
			<td style="width:131px;">Sigma</td>
			<td style="width:125px;">P6911</td>
			<td style="width:565px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Fura-2 (AM)</td>
			<td style="width:131px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:125px;">F1221</td>
			<td style="width:565px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Pluronic F127 20% solution in DMSO</td>
			<td style="width:131px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:125px;">P3000MP</td>
			<td style="width:565px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Shaking Water Bath</td>
			<td style="width:131px;">Chang Shin Scientific</td>
			<td style="width:125px;">Model: C-108</td>
			<td style="width:565px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:315px;">IonWizard Softwae Suite</td>
			<td style="width:131px;">IonOptix Ltd</td>
			<td style="width:125px;">Experimental Builder</td>
			<td style="width:565px;">Acquisition and Analysis of EC Coupling Data in Myocytes</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:315px;">Myocyte Calcium &#38; Contractility Recording System</td>
			<td style="width:131px;">IonOptix Ltd</td>
			<td style="width:125px;"></td>
			<td style="width:565px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Circulating Water Bath</td>
			<td style="width:131px;">BS-Tech</td>
			<td style="width:125px;">BW2-8</td>
			<td style="width:565px;"></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:315px;">Myocyte Fluorescence Microscope</td>
			<td style="width:131px;">Nikon</td>
			<td style="width:125px;">DIATPHOTO 200</td>
			<td style="width:565px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:315px;">MyoCam-S Power</td>
			<td style="width:131px;">IonOptix</td>
			<td style="width:125px;"></td>
			<td style="width:565px;"></td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="119" rowspan="3" style="height:119px;width:315px;">Fluorescence &#38; Video Detection</td>
			<td rowspan="3" style="width:131px;">IonOptix</td>
			<td style="width:125px;">MyoCam-S</td>
			<td style="width:565px;"></td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:125px;">CFA300</td>
			<td style="width:565px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:125px;">PMT400</td>
			<td style="width:565px;"></td>
		</tr>
		<tr height="71">
			<td height="71" style="height:71px;width:315px;">Fluorescence &#38; System Interface</td>
			<td style="width:131px;">IonOptix</td>
			<td style="width:125px;">FSI700</td>
			<td style="width:565px;"></td>
		</tr>
		<tr height="71">
			<td height="71" style="height:71px;width:315px;">Excitation Light Source</td>
			<td style="width:131px;">IonOptix</td>
			<td style="width:125px;">mSTEP</td>
			<td style="width:565px;"></td>
		</tr>
		<tr height="71">
			<td height="71" style="height:71px;width:315px;">High intensity ARC Lamp Power supply</td>
			<td style="width:131px;">Cairn Reseach</td>
			<td></td>
			<td style="width:565px;"></td>
		</tr>
		<tr height="71">
			<td height="71" style="height:71px;width:315px;">Filter wheel controller</td>
			<td style="width:131px;">IonOptix</td>
			<td style="width:125px;">GB/MUS200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="71">
			<td height="71" style="height:71px;">Digital Stimulator</td>
			<td style="width:131px;">Medical Systems Corportion</td>
			<td>S-98 Mutimode</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Compositions of Experimental Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:315px;">Name</td>
			<td style="width:131px;">Company</td>
			<td style="width:125px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:565px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:315px;">Isolation Solution (pH: 7.4, NaOH)</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:125px;"></td>
			<td style="width:565px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:315px;">NaCl</td>
			<td style="width:131px;">Sigma</td>
			<td style="width:125px;">S9625</td>
			<td style="width:565px;">Concentration (mmol) 135</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:315px;">KCl</td>
			<td style="width:131px;">Sigma</td>
			<td style="width:125px;">P4504</td>
			<td style="width:565px;">Concentration (mmol) 5.4</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:315px;">HEPES</td>
			<td style="width:131px;">Sigma</td>
			<td style="width:125px;">H3375</td>
			<td style="width:565px;">Concentration (mmol) 5</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:315px;">Glucose</td>
			<td style="width:131px;">Sigma</td>
			<td style="width:125px;">G8270</td>
			<td style="width:565px;">Concentration (mmol) 5</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:315px;">MgCl2</td>
			<td style="width:131px;">Biosesang</td>
			<td style="width:125px;">M2001</td>
			<td style="width:565px;">Concentration (mmol) 3.5</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:315px;">Taurine</td>
			<td style="width:131px;">Sigma</td>
			<td style="width:125px;">CB2742654</td>
			<td style="width:565px;">Concentration (mmol) 20</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:315px;">Na2HPO4&#160;</td>
			<td style="width:131px;">Sigma</td>
			<td style="width:125px;">71649</td>
			<td style="width:565px;">Concentration (mmol) 0.4</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:315px;">Storage Solution (pH: 7.4, NaOH)</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:125px;"></td>
			<td style="width:565px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:315px;">NaCl</td>
			<td style="width:131px;">Sigma</td>
			<td style="width:125px;">S9625</td>
			<td style="width:565px;">Concentration (mmol) 120</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:315px;">KCl</td>
			<td style="width:131px;">Sigma</td>
			<td style="width:125px;">P4504</td>
			<td style="width:565px;">Concentration (mmol) 5.4</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:315px;">HEPES</td>
			<td style="width:131px;">Sigma</td>
			<td style="width:125px;">H3375</td>
			<td style="width:565px;">Concentration (mmol) 10</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:315px;">Glucose</td>
			<td style="width:131px;">Sigma</td>
			<td style="width:125px;">G8270</td>
			<td style="width:565px;">Concentration (mmol) 5.5</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:315px;">CaCl2</td>
			<td style="width:131px;">Biosesang</td>
			<td style="width:125px;">C2002</td>
			<td style="width:565px;">Concentration (mmol) 0.2</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:315px;">Mannitol</td>
			<td style="width:131px;">Sigma</td>
			<td style="width:125px;">M4125</td>
			<td style="width:565px;">Concentration (mmol) 29</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:315px;">MgSO4</td>
			<td style="width:131px;">Sigma</td>
			<td style="width:125px;">M5921</td>
			<td style="width:565px;">Concentration (mmol) 5</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:315px;">Sodium Pyruvate</td>
			<td style="width:131px;">Sigma</td>
			<td style="width:125px;">P2256</td>
			<td style="width:565px;">Concentration (mmol) 5</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:315px;">Taurine</td>
			<td style="width:131px;">Sigma</td>
			<td style="width:125px;">CB2742654</td>
			<td style="width:565px;">Concentration (mmol) 20</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:315px;">Perfusion Solution (Tyrode solution, pH: 7.4, NaOH)</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:125px;"></td>
			<td style="width:565px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:315px;">NaCl</td>
			<td style="width:131px;">Sigma</td>
			<td style="width:125px;">S9625</td>
			<td style="width:565px;">Concentration (mmol) 141.4</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:315px;">KCl</td>
			<td style="width:131px;">Sigma</td>
			<td style="width:125px;">P4504</td>
			<td style="width:565px;">Concentration (mmol) 4</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:315px;">NaH2PO4</td>
			<td style="width:131px;">Sigma</td>
			<td style="width:125px;">S8282</td>
			<td style="width:565px;">Concentration (mmol) 0.33</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:315px;">HEPES</td>
			<td style="width:131px;">Sigma</td>
			<td style="width:125px;">H3375</td>
			<td style="width:565px;">Concentration (mmol) 10</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:315px;">Glucose</td>
			<td style="width:131px;">Sigma</td>
			<td style="width:125px;">G8270</td>
			<td style="width:565px;">Concentration (mmol) 5.5</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:315px;">CaCl2</td>
			<td style="width:131px;">Biosesang</td>
			<td style="width:125px;">C2002</td>
			<td>Concentration (mmol) 1.8&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; For Fura 2AM loading, CaCl2 concentrations are 0.25 mM and 0.5 mM</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:315px;">MgCl2</td>
			<td style="width:131px;">Biosesang</td>
			<td style="width:125px;">M2001</td>
			<td style="width:565px;">Concentration (mmol) 1</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:315px;">Mannitol</td>
			<td style="width:131px;">Sigma</td>
			<td style="width:125px;">M4125</td>
			<td style="width:565px;">Concentration (mmol) 14.5</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:315px;">Collangenase Solution 1</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:125px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:315px;">Isolation Solution (30mL)</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:125px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:315px;">Bovine Fetal Albumin (BSA solution 5 ml)</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:125px;"></td>
			<td style="width:565px;">Concentration (mmol) 1.67 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:315px;">Collagenase Type 2</td>
			<td style="width:131px;">Worthington</td>
			<td style="width:125px;">LS004177</td>
			<td style="width:565px;">Concentration (mmol) 1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:315px;">Protease</td>
			<td style="width:131px;">Sigma</td>
			<td style="width:125px;">P6911</td>
			<td style="width:565px;">Concentration (mmol) 0.1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:315px;">CaCl2</td>
			<td style="width:131px;">Biosesang</td>
			<td style="width:125px;">C2002</td>
			<td style="width:565px;">Concentration (mmol) 0.05 mM</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:315px;">Collangenase Solution 2</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:125px;"></td>
			<td style="width:565px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:315px;">Isolation Solution (20mL)</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:125px;"></td>
			<td style="width:565px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:315px;">Bovine Fetal Albumin (BSA solution 3.3 mL)</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:125px;"></td>
			<td style="width:565px;">Concentration (mmol) 1.67 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:315px;">Collagenase Type 2</td>
			<td style="width:131px;">Worthington</td>
			<td style="width:125px;">LS004177</td>
			<td style="width:565px;">Concentration (mmol) 1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:315px;">CaCl2</td>
			<td style="width:131px;">Biosesang</td>
			<td style="width:125px;">C2002</td>
			<td style="width:565px;">Concentration (mmol) 0.05 mM</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:315px;">BSA solution</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:125px;"></td>
			<td style="width:565px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:315px;">Isolation Solution (40mL)</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:125px;"></td>
			<td style="width:565px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:315px;">Bovine Fetal Albumin</td>
			<td style="width:131px;">Sigma</td>
			<td style="width:125px;">A7906</td>
			<td style="width:565px;">Concentration (mmol) 400 mg</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:315px;">CaCl2</td>
			<td style="width:131px;">Biosesang</td>
			<td style="width:125px;">C2002</td>
			<td style="width:565px;">Concentration (mmol) 1mM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of myofilament ca2+ sensitivity underlying cardiac excitation-contraction coupling

insuficiência cardíaca e arritmias cardíacas são as principais causas de mortalidade e morbidade em todo o mundo. No entanto, o mecanismo de patogênese e mau funcionamento do miocárdio no coração doente continua a ser totalmente esclarecido. Provas convincentes recente demonstra que as mudanças na miofilamentos Ca 2+ sensibilidade afetam Ca 2+ intracelular atividades homeostase e canais iônicos em miócitos cardíacos, os mecanismos essenciais responsáveis ​​pelo potencial de ação cardíaco e contração em corações saudáveis ​​e doentes. De facto, as actividades dos canais de iões e transportadores subjacentes potenciais de acção cardíaca (por exemplo, Na +, Ca 2+ e os canais de K + e Na + -Ca 2+) e proteínas de permutador de Ca 2+ intracelular de manuseamento (por exemplo., Os receptores de rianodina e Ca 2 + -ATPase no retículo sarcoplasmático (SERCA2a) ou fosfolambam e a sua fosforilação) são convencionalmente medido para avacomeu os mecanismos fundamentais do acoplamento excitação-contração cardíaca (CE). Ambas as atividades elétricas na membrana e Ca 2+ alterações intracelulares são os sinais de disparo de acoplamento CE, enquanto miofilamentos é a unidade funcional de contração e relaxamento, e miofilamentos Ca 2+ sensibilidade é imperativo na implementação de desempenho miofibrila. No entanto, poucos estudos incorporar miofilamentos Ca 2+ sensibilidade para a análise funcional do miocárdio, a menos que é o foco do estudo. Aqui, descrevemos um protocolo que mede sarcomere encurtamento / re-alongamento eo nível de Ca2 + intracelular usando Fura-2 AM (detecção ratiometric) e avaliar as alterações de sensibilidade dos miofilamentos Ca 2+ em miócitos cardíacos de corações de ratos. O principal objetivo é enfatizar que miofilamentos Ca 2+ sensibilidade deve ser levado em consideração no acoplamento CE para análise mecanicista. investigação detalhada do iem canais, transportadores iônicos, intracelular de manipulação de Ca2 +, e miofilamentos Ca 2+ sensibilidade que fundamentam a contratilidade dos miócitos em corações saudáveis ​​e doentes irá fornecer informações valiosas para a concepção de estratégias mais eficazes de translação e valor terapêutico.

miócitos do VE são isolados de corações normais e hipertensos ratos. Miócitos em forma de haste com estrias claras (representando sarcómeros) e contracções estáveis ​​em resposta à estimulação do campo são considerados os miócitos óptimos e são seleccionados para gravações (Figura 2A). No exemplo mostrado na F igura 2A, uma Fura 02:00 -loaded miócitos está posicionado horizontalmente e a abertura da câmara é ajustado de modo que...

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Assessment of Myofilament Ca2+ Sensitivity Underlying Cardiac Excitation-contraction Coupling

This paper describes a protocol that assesses the changes of myofilament Ca2+ sensitivity during contraction in isolated cardiac myocytes from rat heart. Together with cardiac electrophysiology, systolic/diastolic cytosol Ca2+ levels and contraction/relaxation, this measurement is imperative in underpinning the mechanisms mediating cardiac excitation-contraction coupling in healthy and diseased hearts.

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