Name: stencil micropatterning of human pluripotent stem cells for probing spatial organization of differentiation fates
Uploaded: 2016-06-17T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stencil Micropatterning of Human Pluripotent Stem Cells for Probing Spatial Organization of Differentiation Fates at JoVE.com

ويدعم هذا العمل من قبل جامعة سنغافورة الوطنية بدء التشغيل منحة (R-397-000-192-133) وصندوق الفجوة ETPL (R-397-000-198-592). ع هو عالم أبحاث جامعة سنغافورة الوطنية. سيكون الكتاب أود أن أشكر الدكتور Jiangwa شينغ لها الدعم الفني على micropatterning الخلية.

ملاحظة: يصف هذا البروتوكول تلفيق PDMS الاستنسل مع 1000 ميكرون أنماط بواسطة الليزر لعدة قطاعات وmicropatterning خط HESC، H9 باستخدام الاستنسل PDMS. 1. تصميم وتصنيع PDMS استنسل لMicropatterning <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصميم ورقة با?...

<ol>
	<li>Graf, T., Stadtfeld, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+embryonic+and+adult+stem+cells.">Heterogeneity of embryonic and adult stem cells.</a> Cell Stem Cell. 3 (5), 480-483 (2008).</li><li>Nishikawa, S., Goldstein, R. A., Nierras, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+promise+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+for+research+and+therapy.">The promise of human induced pluripotent stem cells for research and therapy.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (9), 725-729 (2008).</li><li>Guilak, F., Cohen, D. M., Estes, B. T., Gimble, J. M., Liedtke, W., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+stem+cell+fate+by+physical+interactions+with+the+extracellular+matrix.">Control of stem cell fate by physical interactions with the extracellular matrix.</a> Cell Stem Cell. 5 (1), 17-26 (2009).</li><li>Dalby, M. J., Gadegaard, N., Oreffo, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+nanotopography+and+integrin-matrix+interactions+to+influence+stem+cell+fate.">Harnessing nanotopography and integrin-matrix interactions to influence stem cell fate.</a> Nat Mater. 13 (6), 558-569 (2014).</li><li>Joddar, B., Ito, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+niche+substrates+for+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cell+cultures.">Artificial niche substrates for embryonic and induced pluripotent stem cell cultures.</a> J Biotechnol. 168 (2), 218-228 (2013).</li><li>Warmflash, A., Sorre, B., Etoc, F., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+to+recapitulate+early+embryonic+spatial+patterning+in+human+embryonic+stem+cells.">A method to recapitulate early embryonic spatial patterning in human embryonic stem cells.</a> Nat Methods. 11 (8), 847-854 (2014).</li><li>Peerani, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Niche-mediated+control+of+human+embryonic+stem+cell+self-renewal+and+differentiation.">Niche-mediated control of human embryonic stem cell self-renewal and differentiation.</a> EMBO J. 26 (22), 4744-4755 (2007).</li><li>Lee, L. H., Peerani, R., Ungrin, M., Joshi, C., Kumacheva, E., Zandstra, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropatterning+of+human+embryonic+stem+cells+dissects+the+mesoderm+and+endoderm+lineages.">Micropatterning of human embryonic stem cells dissects the mesoderm and endoderm lineages.</a> Stem Cell Res. 2 (2), 155-162 (2009).</li><li>Hwang, Y. S., Chung, B. G., Ortmann, D., Hattori, N., Moeller, H. C., Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microwell-mediated+control+of+embryoid+body+size+regulates+embryonic+stem+cell+fate+via+differential+expression+of+WNT5a+and+WNT11.">Microwell-mediated control of embryoid body size regulates embryonic stem cell fate via differential expression of WNT5a and WNT11.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (40), 16978-16983 (2009).</li><li>Toh, Y. C., Xing, J., Yu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+integrin+and+E-cadherin-mediated+adhesions+to+spatially+control+heterogeneity+in+human+pluripotent+stem+cell+differentiation.">Modulation of integrin and E-cadherin-mediated adhesions to spatially control heterogeneity in human pluripotent stem cell differentiation.</a> Biomaterials. 50, 87-97 (2015).</li><li>Xing, J., Toh, Y. C., Xu, S., Yu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+human+teratogen+detection+by+geometrically+confined+cell+differentiation+and+migration.">A method for human teratogen detection by geometrically confined cell differentiation and migration.</a> Sci Rep. 5, 10038 (2015).</li><li>Falconnet, D., Csucs, G., Grandin, H. M., Textor, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+engineering+approaches+to+micropattern+surfaces+for+cell-based+assays.">Surface engineering approaches to micropattern surfaces for cell-based assays.</a> Biomaterials. 27 (16), 3044-3063 (2006).</li><li>Bauwens, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+human+embryonic+stem+cell+colony+and+aggregate+size+heterogeneity+influences+differentiation+trajectories.">Control of human embryonic stem cell colony and aggregate size heterogeneity influences differentiation trajectories.</a> Stem Cells. 26 (9), 2300-2310 (2008).</li><li>Khademhosseini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-culture+of+human+embryonic+stem+cells+with+murine+embryonic+fibroblasts+on+microwell-patterned+substrates.">Co-culture of human embryonic stem cells with murine embryonic fibroblasts on microwell-patterned substrates.</a> Biomaterials. 27 (36), 5968-5977 (2006).</li><li>Mohr, J. C., de Pablo, J. J., Palecek, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-D+microwell+culture+of+human+embryonic+stem+cells.">3-D microwell culture of human embryonic stem cells.</a> Biomaterials. 27 (36), 6032-6042 (2006).</li><li>Yao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+as+microscaled+multilayered+colonies+leading+to+enhanced+homogeneity+and+maturation.">Hepatic differentiation of human embryonic stem cells as microscaled multilayered colonies leading to enhanced homogeneity and maturation.</a> Small. 10 (21), 4311-4323 (2014).</li><li>Mei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+development+of+biomaterials+for+clonal+growth+of+human+pluripotent+stem+cells.">Combinatorial development of biomaterials for clonal growth of human pluripotent stem cells.</a> Nat Mater. 9 (9), 768-778 (2010).</li><li>Melkoumian, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+peptide-acrylate+surfaces+for+long-term+self-renewal+and+cardiomyocyte+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells.">Synthetic peptide-acrylate surfaces for long-term self-renewal and cardiomyocyte differentiation of human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 28 (6), 606-610 (2010).</li><li>Evans, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+stiffness+affects+early+differentiation+events+in+embryonic+stem+cells.">Substrate stiffness affects early differentiation events in embryonic stem cells.</a> Eur Cell Mater. 18, 1-13 (2009).</li><li>Carter, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haptotactic+islands:+a+method+of+confining+single+cells+to+study+individual+cell+reactions+and+clone+formation.">Haptotactic islands: a method of confining single cells to study individual cell reactions and clone formation.</a> Exp Cell Res. 48 (1), 189-193 (1967).</li><li>Jimbo, Y., Robinson, H. P., Kawana, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+measurement+of+intracellular+calcium+and+electrical+activity+from+patterned+neural+networks+in+culture.">Simultaneous measurement of intracellular calcium and electrical activity from patterned neural networks in culture.</a> IEEE Trans Biomed Eng. 40 (8), 804-810 (1993).</li><li>Wright, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reusable,+reversibly+sealable+parylene+membranes+for+cell+and+protein+patterning.">Reusable, reversibly sealable parylene membranes for cell and protein patterning.</a> J Biomed Mater Res. A. 85 (2), 530-538 (2008).</li><li>Jinno, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabricated+multilayer+parylene-C+stencils+for+the+generation+of+patterned+dynamic+co-cultures.">Microfabricated multilayer parylene-C stencils for the generation of patterned dynamic co-cultures.</a> J Biomed Mater Res A. 86 (1), 278-288 (2008).</li><li>Jackman, R. J., Duffy, D. C., Cherniavskaya, O., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+elastomeric+membranes+as+dry+resists+and+for+dry+lift-off.">Using elastomeric membranes as dry resists and for dry lift-off.</a> Langmuir. 15 (8), 2973-2984 (1999).</li><li>Folch, A., Jo, B. H., Hurtado, O., Beebe, D. J., Toner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabricated+elastomeric+stencils+for+micropatterning+cell+cultures.">Microfabricated elastomeric stencils for micropatterning cell cultures.</a> J Biomed Mater Res. 52 (2), 346-353 (2000).</li><li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabrication-based+modulation+of+embryonic+stem+cell+differentiation.">Microfabrication-based modulation of embryonic stem cell differentiation.</a> Lab Chip. 7 (8), 1018-1028 (2007).</li><li>Choi, J. H., Lee, H., Jin, H. K., Bae, J. S., Kim, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropatterning+of+neural+stem+cells+and+Purkinje+neurons+using+a+polydimethylsiloxane+(PDMS)+stencil.">Micropatterning of neural stem cells and Purkinje neurons using a polydimethylsiloxane (PDMS) stencil.</a> Lab Chip. 12 (23), 5045-5050 (2012).</li><li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NeuroArray:+a+universal+interface+for+patterning+and+interrogating+neural+circuitry+with+single+cell+resolution.">NeuroArray: a universal interface for patterning and interrogating neural circuitry with single cell resolution.</a> Sci Rep. 4, 4784 (2014).</li><li>Guvanasen, G. S., Mancini, M. L., Calhoun, W. A., Rajaraman, S., DeWeerth, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polydimethylsiloxane+Microstencils+Molded+on+3-D-Printed+Templates.">Polydimethylsiloxane Microstencils Molded on 3-D-Printed Templates.</a> J Microelectromech S. 23 (5), 1045-1053 (2014).</li><li>Palchesko, R. N., Zhang, L., Sun, Y., Feinberg, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+polydimethylsiloxane+substrates+with+tunable+elastic+modulus+to+study+cell+mechanobiology+in+muscle+and+nerve.">Development of polydimethylsiloxane substrates with tunable elastic modulus to study cell mechanobiology in muscle and nerve.</a> PLoS One. 7 (12), 51499 (2012).</li><li>Chowdhury, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Material+properties+of+the+cell+dictate+stress-induced+spreading+and+differentiation+in+embryonic+stem+cells.">Material properties of the cell dictate stress-induced spreading and differentiation in embryonic stem cells.</a> Nat Mater. 9 (1), 82-88 (2010).</li><li>Gjorevski, N., Boghaert, E., Nelson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Epithelial-Mesenchymal+Transition+by+Transmission+of+Mechanical+Stress+through+Epithelial+Tissues.">Regulation of Epithelial-Mesenchymal Transition by Transmission of Mechanical Stress through Epithelial Tissues.</a> Cancer Microenviron. 5 (1), 29-38 (2012).</li><li>Thery, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropatterning+as+a+tool+to+decipher+cell+morphogenesis+and+functions.">Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions.</a> J Cell Sci. 123, 4201-4213 (2010).</li><li>Eroshenko, N., Ramachandran, R., Yadavalli, V. K., Rao, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+substrate+stiffness+on+early+human+embryonic+stem+cell+differentiation.">Effect of substrate stiffness on early human embryonic stem cell differentiation.</a> J Biol Eng. 7 (1), 7 (2013).</li></ol>

تصنيع الإستنسل micropatterning يوفر micropatterning الاستنسل الأسلوب الأمثل لتوليد micropatterns hPSC للتحقيق بوساطة المتخصصة التمايز الزخرفة. إن الميزة الأساسية لتنميط الاستنسل على تقنيات micropatterning أخرى، مثل microcontact الطباعة وphotopatterning، ?...

الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان (hPSCs)، بما في ذلك الخلايا الجذعية الجنينية (hESCs) والتي يسببها الخلايا الجذعية المحفزة (hiPSCs)، وتستغل على نطاق واسع في الطب التجديدي، وكذلك نماذج تجريبية من توالد الطبيعي والمريضة بسبب إمكانية المفاضلة الخاصة بهم في الأنساب خلية من كل ثلاث طبقات جرثومية 1،2. مصير التفريق بين hPSCs شديدة الحساسية للعوامل البيئية المحلية التي يمكن أن تعدل عمليات mechanotransduction autocrine أو نظير الصماوي يشير 1 وكذلك بوساطة الإشارات الجسدية 3-5. يشمل micropatterning خلية مجموعة من التقنيات التي تم تطويرها لتنظيم مكانيا هندسة والمكان من السكان خلية كوسيلة للسيطرة على المكروية الخلوية المحلية، مثل التفاعلات خلية خلية 6 والتفاعلات خلية مصفوفة 3. في سياق hPSCs، واستخدمت micropatterning خلية للحصول على أفكار هامة في كيفية محراب تعتمدوالأنف والحنجرة إشارات autocrine ينظم HESC القرارات تعدد القدرات تمايز 7 والتنظيم في وقت مبكر أنماط التمايز الجنينية 6. وقد استخدمت 2D و 3D hPSCs micropatterned للتحكم في حجم مستعمرة من أنماط متعددة الخلايا، والتي بدورها أثرت على قرارات التمايز في الطبقات الجرثومية الثلاث 8،9. لقد استخدمنا micropatterns hPSC متعددة الخلايا لتعديل حجم خلية خلية والتفاعلات خلية مصفوفة داخل مستعمرة hPSC لمعرفة كيف يمكن للإنتغرين-E-كادهيرين الحديث المتبادل يمكن أن تؤدي إلى مصير خلية التجانس 10. المظاهرات من التقارير المذكورة تفتح مجالات جديدة نحو تطبيق micropatterns متعددة الخلايا من hPSCs كنماذج تجريبية لفحص سمية الدواء للأمراض التنموية 11، لدراسة تأثير عوامل النمو والهرمونات خلال الأنسجة أو تطوير الجهاز، ولكشف تشكيل أنماط النسيج. عدد لا يحصى من micropatter خليةوقد تم تطوير تقنيات نينغ على النحو الذي استعرضه Falconnet وآخرون. آل 12 ولكن فقط حفنة، مثل الصغرى الاتصال الطباعة 7،8،13، ثقافة microwell 14،15، photopatterning تم تنفيذ 6 وmicrostencils 16 بنجاح مع hPSCs. التحدي مع hPSCs micropatterning يكمن في ضعفها والمتطلبات الصارمة للمصفوفات معينة خارج الخلية (ECM) وظروف النمو لمرفق الخلية والبقاء على قيد الحياة. لأنماط 2D hPSC والطباعة الاتصال الصغرى هي واحدة من أكثر الطرق شيوعا لتوليد micropatterns hPSC على زراعة الأنسجة والزجاج ركائز 13. ويمكن استخدام هذه الطريقة لECM المشترك نمط المستخدمة في الثقافة hPSC، بما في ذلك laminin والغشاء القاعدي المصفوفات، مثل Matrigel. ومع ذلك، فإنه عادة ما يتطلب عملية طلاء خطوتين بمساعدة بولي-D-ليسين، ويحتاج الظروف الجوية والرطوبة الخاملة محددة لجعل micropatterns ECM مستقر لhPSCs لنعلق على 6،13. النظر قبل كل شيء من كل طريقة micropatterning هو ما إذا كان نظام تعديل السطح يمكن أن تولد أنماط ECM hPSC لاصقة في القرار الهندسي المطلوب، مع التقليل من مرفق الخلية غير محددة إلى المناطق المحيطة بها. هنا، ونحن التقرير استخدام micropatterning الاستنسل كوسيلة من وسائل بسيطة لتوليد micropatterns hPSC دون خطوات تعديل سطح إضافية قبل جيل من أنماط ECM لاصقة لhPSCs إرفاق جرا. ويضم الاستنسل الخلية من غشاء رقيق، ورقة على سبيل المثال، ثنائي ميثيل بولي سيلوكسان (PDMS)، مع ميكرون إلى ملليمتر حجم من خلال ثقوب مختومة على ركيزة الثقافة الخلية لاحتواء جسديا الطلاءات ECM وhPSCs المصنف في وقت لاحق. كما تعمل الاستنسل الزخرفة بإعاقة جسدية الموقع حيث يمكن hPSC الوصول وإرفاق مباشرة إلى الركيزة ECM الأساسي المغلفة، وهذا الأسلوب هو متوافق مع مختلف ركائز التي يمكن أن تدعم الثقافات hPSC. والاحتياج فقطتي هو أن اختيار المواد الاستنسل يمكن ان تشكل ختم عكسها مع الركيزة. وتشمل هذه الركائز التقليدية البوليسترين زراعة الأنسجة (برنامج التعاون الفني) 17، ركائز مترافق يجند 18، وكذلك ركائز المرنة مع صلابة الانضباطي (على سبيل المثال، PDMS) 19. كما يسمح هذا الأسلوب طلاء ECM مختلفة، مثل vitronectin (أو البروتين VTN)، laminin والمصفوفات الغشاء القاعدي (على سبيل المثال، Matrigel وGeltrax) للسماح لمرفق السليم والتفريق بين hPSCs. ولذلك، فإننا يمكن نقل الأمثل تكوينات ECM-الركيزة للحصول على خط hPSC محددة لالاستنسل micropatterning الأمثل لخلية مصفوفة التصاق والبقاء والتمايز. في الآونة الأخيرة، كما تم الإبلاغ عن طريقة مماثلة لتوجيه التمايز كبدي من hESCs micropatterning باستخدام بولي (ميتاكريليت الميثيل) (PMMA) صفائف الاستنسل الدقيقة 16. الإستنسل خلية يمكن أن تكون ملفقة من مواد مختلفة، بما في ذلك التقى<html> المرض 20،21، بولي (ف xylylene) البوليمرات 22،23، PMMA 16 و الأكثر شيوعا، PDMS 24-28. السيليكون وبولي (ف xylylene) البوليمرات الإستنسل تتطلب الحفر المباشر للمن خلال ثقوب مع المعدات المتخصصة 20-23، الأمر الذي يحد من إمكانية الوصول إليها للمستخدمين البيولوجي. PDMS الإستنسل يمكن أن تكون ملفقة من قبل وسائل مختلفة اعتمادا على حجم الميزة المطلوبة، والتي تتراوح عادة من 3 ميكرون إلى 2000 ميكرومتر 11،26-29. وإذا رغبت الميزات الصغيرة، وصحائف بالستينسيل رقيقة يمكن أن تنتج من قبل الصحافة صب PDMS قبل البوليمر على قالب السيليكون microfabricated تحتوي على نقوش من micropatterns 28. لميزات&gt; 1000 ميكرون، ويوفر قاطع ليزر CO 2 وسيلة سهلة ومنخفضة التكاليف لخفض مباشرة أنماط على ورقة PDMS محمل مسبقا خلال تلفيق الاستنسل. وإعادة التدوير من الإستنسل PDMS أيضا يجعلها فعالة من حيث التكلفة لإجراء سلسلة من التجارب بما يكفي من الاتساق. الحمار = &quot;jove_content&quot;&gt; هنا، نقدم منهجية مفصلة لصنع الاستنسل PDMS مع 1000 ميكرون الميزات بواسطة القطع بالليزر وتوليد micropatterns HESC. واستخدمت هذه micropatterns HESC لتعديل مدى إنتغرين وE-كادهيرين بوساطة التصاقات داخل مستعمرة HESC متماسكة وذلك لمعرفة كيف أدى الاستقطاب المكاني للالتصاق الخلايا في خلية مصير التجانس 10.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="948">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">&#160;2 mm thick PDMS sheet</td>
			<td style="width:191px;">Specialty Silicone Products Inc., USA</td>
			<td style="width:119px;">SSPM823-.005</td>
			<td style="width:423px;">Used to form reservoir for stencil</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">120-150 &#956;m thick PDMS sheet</td>
			<td style="width:191px;">Specialty Silicone Products Inc., USA</td>
			<td style="width:119px;">SSPM823-.040</td>
			<td style="width:423px;">Used to form stencil&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">60 mm petri dish</td>
			<td style="width:191px;">&#160;Nunc Nunclon Delta</td>
			<td style="width:119px;">150326</td>
			<td style="width:423px;">Substrate for micropatterning</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Accutase</td>
			<td style="width:191px;">Accutase, Merck Millipore, Singapore</td>
			<td style="width:119px;">SCR005</td>
			<td style="width:423px;">Enzyme to break H9 Cells into single cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Activin&#160;&#160;</td>
			<td style="width:191px;">R&#38;D Systems, Singapore</td>
			<td style="width:119px;">338-AC-010</td>
			<td style="width:423px;">Growth factor for H9 differentiation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BMP4&#160;</td>
			<td style="width:191px;">R&#38;D Systems, Singapore</td>
			<td style="width:119px;">338-BP-010</td>
			<td style="width:423px;">Growth factor for H9 differentiation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Plasma system&#160;</td>
			<td style="width:191px;">&#160;Femto Science, Korea</td>
			<td style="width:119px;">CUTE-MP</td>
			<td style="width:423px;">For plasma oxidation of stencil</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dispase</td>
			<td style="width:191px;">StemCell&#8482; Technologies, Singapore</td>
			<td style="width:119px;">7923</td>
			<td style="width:423px;">Enzyme used to weaken the cell-ECM adhesion during passaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM/F12</td>
			<td style="width:191px;">GIBCO, USA</td>
			<td style="width:119px;">11330032</td>
			<td style="width:423px;">Basal medium for H9 cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FGF2</td>
			<td style="width:191px;">&#160;R&#38;D Systems, Singapore</td>
			<td style="width:119px;">233&#8211;FB&#8211;025</td>
			<td style="width:423px;">Growth factor for H9 differentiation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">H9 Cell line</td>
			<td style="width:191px;">WiCell Research Institute, Inc., USA</td>
			<td style="width:119px;">WA09</td>
			<td style="width:423px;">Human embryonic stem cells</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">hESC-qualified basement membrane matrix</td>
			<td style="width:191px;">Matrigel, BD Biosciences, Singapore</td>
			<td style="width:119px;">354277</td>
			<td style="width:423px;">Extra-cellular matrix coating to support growth of H9 cells</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Inverted microscope</td>
			<td style="width:191px;">Leica Microsystems, Singapore</td>
			<td style="width:119px;">DMi1</td>
			<td style="width:423px;">For capturing bright-field images</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Laser cutter</td>
			<td style="width:191px;">Epilog Helix 24 Laser System</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:423px;">Used to generate through holes in PDMS sheet</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">mTeSR&#8482;1 medium&#160;</td>
			<td style="width:191px;">StemCell&#8482; Technologies, Singapore</td>
			<td style="width:119px;">5850</td>
			<td style="width:423px;">Maintainence medium for H9 cells</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">PDMS&#160;</td>
			<td style="width:191px;">SYLGARD&#174; 184, Dow Corning Co., USA</td>
			<td style="width:119px;">3097358-1004</td>
			<td style="width:423px;">Used for sticking the PDMS stencil and reservior</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">ROCKi Y27632</td>
			<td style="width:191px;">Calbiochem, Merck Millipore, Singapore</td>
			<td style="width:119px;">688000</td>
			<td style="width:423px;">Maintains H9 cells as single cells&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">STEMdiff&#8482; APEL&#8482; medium&#160;</td>
			<td style="width:191px;">StemCell&#8482; Technologies, Singapore</td>
			<td style="width:119px;">5210</td>
			<td style="width:423px;">Differentiation medium for H9 cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Polyethylene terephthalate film</td>
			<td style="width:191px;">SureMark Singapore</td>
			<td style="width:119px;">SQ-6633</td>
			<td style="width:423px;">Used to form stencil&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cell culture compatible non-ionic surfactant</td>
			<td style="width:191px;">Pluronic acid F-127, Sigma, Singapore</td>
			<td style="width:119px;">P2443</td>
			<td style="width:423px;">Passivating reagent to repel cell adhesion in non-micropatterned substrates</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stencil micropatterning of human pluripotent stem cells for probing spatial organization of differentiation fates

Human pluripotent stem cells (hPSCs), including embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells, have the intrinsic ability to differentiate into all three germ layers. This makes them an attractive cell source for regenerative medicine and experimental modeling of normal and diseased organogenesis. However, the differentiation of hPSCs in vitro is heterogeneous and spatially disordered. Cell micropatterning technologies potentially offer the means to spatially control stem cell microenvironments and organize the resultant differentiation fates. Micropatterning hPSCs needs to take into account the stringent requirements for hPSC survival and maintenance. Here, we describe stencil micropatterning as a method that is highly compatible with hPSCs. hPSC micropatterns are specified by the geometries of the cell stencil through-holes, which physically confine the locations where hPSCs can access and attach to the underlying extracellular matrix-coated substrate. Due to this mode of operation, there is greater flexibility to use substrates that can adequately support hPSCs as compared to other cell micropatterning methods. We also highlight critical steps for the successful generation of hPSC micropatterns. As an example, we demonstrate that stencil micropatterning of hPSCs can be used to modulate spatial polarization of cell-cell and cell-matrix adhesions, which in turn determines mesoendoderm differentiation patterns. This simple and robust method to micropattern hPSCs widens the prospects of establishing experimental models to investigate tissue organization and patterning during early embryonic development.

في هذه الورقة، ونحن تصف تصنيع استنسل خلية باستخدام الليزر القاطع لتوليد 1000 ميكرون الميزات. وتألفت الاستنسل من 2 أجزاء: ورقة بالستينسيل رقيقة (حوالي 100-200 ميكرون سميكة) تحتوي على micropattern من خلال الثقوب، وطوقا PDMS لاحتواء حل ECM طلاء أو تعليق خلية. هنا، تم ا...

Watch this Scientific Journal Video about Stencil Micropatterning of Human Pluripotent Stem Cells for Probing Spatial Organization of Differentiation Fates at JoVE.com

Stencil Micropatterning of Human Pluripotent Stem Cells for Probing Spatial Organization of Differentiation Fates

الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان (hPSCs) لديهم القدرة الذاتية للتمييز وتنظيم الذات في أنماط النسيج متميزة. على الرغم من أن هذا يتطلب عرض التدرجات البيئية المكانية. نقدم الاستنسل micropatterning كوسيلة من وسائل بسيطة وقوية لتوليد التدرجات الكيميائية الحيوية والميكانيكية للسيطرة على أنماط التمايز hPSC.

الاستنسل Micropatterning من الخلايا الجذعية متعددة القدرات البشرية لجس التنظيم المكاني للتمايز الأقدار

Human pluripotent stem cells (hPSCs), including embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells, have the intrinsic ability to differentiate into ...

The overall goal of this stencil-based micropatterning method, for human pluripotent stem cells, is to provide a simple and robust means to generate spatial environmental gradients that control stem cell differentiation patterns. This method can help you answer key questions in tissue patterning using a human stem cell model, such as how spatial gradients in cell-cell and cell matrix adhesion forces can help to organize stem cell differentiation fates. The advantage of this method is that it does not require additional surface modification to generate cell adhesive ECM patterns for cells to attach to.This means the method is compatible with various ECM and substrate configurations, specific for each cell line. Visual demonstration of this method is critical, as the micropatterning steps are difficult to learn. Because it requires precise and careful handling of the stencil and the cells.For this procedure, the PTMS stencils must already be designed and fabricated. Likewise, have human EFC cells growing on basement membrane matrix, such that the colonies will be ready for seeding later in the procedure. To begin, load a dish with 700 microliters of 70%analytical-grade ethanol, in ultra-pure water.Then, place the PDMS stencil on the solution, and set the dish into a bio-safety cabinet to dry out overnight. The next day, check that no bubbles have formed under the stencil. Then, field the dish until the cells can be seeded onto the stencil.Prepare an aliquot of human ESC-quality basement membrane matrix by adding 16.7 milliliters of DMF12, to make a 1.5x solution and keep it on ice. Treat the substrate with 100 watts of oxygen plasma for 90 seconds. Don't open the dish until it is inside the plasma chamber, and quickly cover it up after the treatment.This treatment will prevent bubbles from forming when the substrate is immersed in solution. Now, cover the stencil with 450 microliters of prepared 1.5x basement membrane matrix solution. Then, seal the dish with parafilm and incubate it for five hours.Before proceeding, check over the six well plates of prepared HESC colonies. Identify and aspirate off colonies of differentiated cells that have lost their typical HESC morphology. They should all appear rounded, have a tightly-packed epithelial morphology, and have a high nucleus-to-cytoplasm ratio with prominent nucleoli.Then, wash each well of plated cells with two milliliters of DMF12 two times. After the second wash, add one milliliter of digestive enzymes to each well, such as accutase and incubate the plate for eight minutes at 37 degrees Celsius. After the incubation, tap the plate gently to detach all the colonies from the substrate.Next, rinse each well with at least four milliliters of media for every milliliter of digestive enzyme applied to the well, and collect the cell suspensions into a single 15 milliliter conical tube. Centrifuge the cells at 200 g for three minutes at room temperature to form a cell pellet. Then aspirate the supernatant, and re-suspend the cells in 400 microliters of HESC maintenance media, supplemented with 10 micromolar of rock inhibitor.Triturate the cells gently three times to break up the clumps. Next, correct the suspensions'density. Mix it well, and make a 200 microliter 1:20 dilution in media.Count the cells in the dilution using a hemocytometer. Then, dilute the main suspension as needed, using media with rock inhibitor. To proceed, add the required number of cells onto each prepared stencil.Only a mono-layer of cells should be deposited, so spread them out evenly. Let the stencil sit undisturbed for five minutes, so the cells can settle. Then, carefully transfer the loaded stencils to a incubator, keeping the dishes level throughout the transfer.Let the cells attach to the stencils over an hour-long incubation. After the cells have been allowed to attach, examine them under a microscope to ensure that they did so properly. Transfer the stencil back to the hood, and aspirate the unattached cells off the stencil.Next, add two milliliters of 0.5%compatible non-ionic surfactant in DMF12 to the area surrounding the stencil. Swirl the solution around to cover the stencil. Then, use a pair of autoclaved forceps to gently peel the stencil off the dish.After removing the stencil, inspect the micropatterend cells under a microscope. The non-ionic surfactant prevents these cells from drying out. Let the micropatterend cells incubate in the surfactant-supplemented media solution for 10 minutes at 37 degrees Celsius.After 10 minutes, aspirate away the solution, and wash the plate with two milliliters of normal DMF12 medium, three times. After the washes, add two milliliters of HESC maintenance medium with rock inhibitor. Once again, inspect the cells to check that the micropatterns have formed properly.Then, incubate the cells at 37 degrees Celsius overnight. The next day, aspirate the medium, wash the cells once with DMF12, and then, add two milliliters of supplemented differentiation medium, to induce the cells to undergo mesoendoderm differentiation. Later, analyze the results.The fabrication of the cell stencil using a laser cutter, provided 1000 micron features. The stencil was composed of a thin stenciling sheet with micropatterned through holes, and a PDMS gasket used to contain the cells. Using this tool, micropatterened HESCs were investigated during mesoendoderm differentiation.H9-HESC colony peripheries have higher integrin adhesions than cells at the colony interior. Thus, the cells differentiate into brachiary T-positive mesoendoderm cells, when induced with activan, BMP4, and FGF2. When such cells were patterned into monolayers of different geometries, geometric and isotropiate right angles and at convex curvatures, led to a local concentration of integrin mediated traction forces, and resulted in increased mesoendoderm differentiation.T expression intensity at different localities within a single colony showed that the extent of meso endoderm induction was indeed higher in sharp corners of square and rectangular colonies, and at the convex curvatures of a semi-circular arc. This demonstrates that cell adhesion mediated mechanical forces can be modulated using the described method. Before attempting the procedure, it is important to optimize the matrix coating time, the cell digestion and attachment time, for the specific human pluripotent stem cell line that you are working with.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

إنتاج واسع النطاق العضلية من الخلايا الجذعية متعددة القدرات البشرية باستخدام تكرار للغاية الصغيرة وبناء جزيء بروتوكول التمايز

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Aggregate Size Optimization in Microwells for Suspension-based Cardiac Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells

إجمالي الحجم الأمثل في Microwells لالقائم على تعليق القلب تمايز الخلايا الجذعية متعددة القدرات البشرية

Cardiac differentiation of human pluripotent stems cells (hPSCs) is typically carried out in suspension cell aggregates.  Conventional aggregate formation ...

Rapid Neuronal Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells for Measuring Network Activity on Micro-electrode Arrays

السريع العصبية تمايز الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات لقياس نشاط الشبكة على المصفوفات الدقيقة الكهربائي

Neurons derived from human induced Pluripotent Stem Cells (hiPSCs) provide a promising new tool for studying neurological disorders. In the past decade, ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

وجه التفريق بين فروعه المكونة للدم البدائي والنهائي من الخلايا الجذعية Pluripotent البشرية

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

التمايز كفاءة الخلايا الجذعية المحفزة لNKX6-1<sup&gt; +</sup&gt; البنكرياس أسلاف

Pluripotent stem cells have the ability to self renew and differentiate to multiple lineages, making them an attractive source for the generation of ...

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

في المختبر تمايز متعددة القدرات البشرية الخلايا الجذعية إلى خلايا الأرومة الغاذية

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

التفريق بين الخلايا الظهارية الصبغية الشبكية من الخلايا الجذعية Pluripotent المستحث أو الجنينية البشرية سريعة وموجهة

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

التمايز الفعال للخلايا الجذعية البشرية متعددة القوى في خلايا الكبد

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

في المختبر توليد المشتقات سميط من البشرية التي يسببها الخلايا الجذعية Pluripotent

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Mapping the Emergent Spatial Organization of Mammalian Cells using Micropatterns and Quantitative Imaging

رسم خرائط التنظيم المكاني الناشئ للخلايا الثديية باستخدام الأنماط الدقيقة والتصوير الكمي

A fundamental goal in biology is to understand how patterns emerge during development. Several groups have shown that patterning can be achieved in vitro ...