Name: a rapid strategy for the isolation of new faustoviruses from environmental samples using vermamoeba vermiformis
Uploaded: 2016-06-04T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis at JoVE.com

The authors have no acknowledgements to make.

אוסף דוגמאות 1. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף 70 דגימות מסביבות ואזורים שונים. במקרה זה, השתמש בנוסחה הבאה: 5 דגימות המים המלוכלכים מהכפר סנט פייר דה Meyzoargues (צרפת), 15 דגימות מהאגם Parc Borely במרסיי (צרפת); 15 דגימות מי ים עם משקעים מן המפרצונים הסלעיים ב ...

<ol>
	<li>Raoult, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+1.2-megabase+genome+sequence+of+Mimivirus.">The 1.2-megabase genome sequence of Mimivirus.</a> Science. 306 (5700), 1344-1350 (2004).</li><li>Claverie, J. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+viruses+in+the+oceans:+the+4th+Algal+Virus+Workshop.">Giant viruses in the oceans: the 4th Algal Virus Workshop.</a> Virol J. 2, 52-52 (2004).</li><li>Monier, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marine+mimivirus+relatives+are+probably+large+algal+viruses.">Marine mimivirus relatives are probably large algal viruses.</a> Audio, Transactions of the IRE Professional Group on. 5, 12-12 (2007).</li><li>Monier, A., Claverie, J. M., Ogata, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taxonomic+distribution+of+large+DNA+viruses+in+the+sea.">Taxonomic distribution of large DNA viruses in the sea.</a> Genome Biol. , (2008).</li><li>Claverie, J. -. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mimivirus+and+Mimiviridae:+Giant+viruses+with+an+increasing+number+of+potential+hosts,+including+corals+and+sponges.">Mimivirus and Mimiviridae: Giant viruses with an increasing number of potential hosts, including corals and sponges.</a> J Invertebr Pathol. 101 (3), 9-9 (2009).</li><li>Colson, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+the+megavirome+in+humans.">Evidence of the megavirome in humans.</a> J Clin Virol. 57 (3), 191-200 (2013).</li><li>La Scola, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tentative+characterization+of+new+environmental+giant+viruses+by+MALDI-TOF+mass+spectrometry.">Tentative characterization of new environmental giant viruses by MALDI-TOF mass spectrometry.</a> Intervirology. 53 (5), 344-353 (2010).</li><li>Boughalmi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+isolation+of+giant+viruses+of+the+Mimiviridae+and+Marseilleviridae+families+in+the+Tunisian+environment.">High-throughput isolation of giant viruses of the Mimiviridae and Marseilleviridae families in the Tunisian environment.</a> Environ Microbiol. , (2012).</li><li>Pagnier, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+decade+of+improvements+in+mimiviridae+and+marseilleviridae+isolation+from+amoeba.">A decade of improvements in mimiviridae and marseilleviridae isolation from amoeba.</a> Intervirology. 56 (6), 354-363 (2012).</li><li>Philippe, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pandoraviruses:+Amoeba+Viruses+with+Genomes+Up+to+2.5+Mb+Reaching+That+of+Parasitic+Eukaryotes.">Pandoraviruses: Amoeba Viruses with Genomes Up to 2.5 Mb Reaching That of Parasitic Eukaryotes.</a> Science. 341 (6143), 281-286 (2013).</li><li>Legendre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thirty-thousand-year-old+distant+relative+of+giant+icosahedral+DNA+viruses+with+a+pandoravirus+morphology.">Thirty-thousand-year-old distant relative of giant icosahedral DNA viruses with a pandoravirus morphology.</a> PNAS. , (2014).</li><li>Saadi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+Isolation+of+Mimivirus+in+a+Patient+With+Pneumonia.">First Isolation of Mimivirus in a Patient With Pneumonia.</a> Clin Infect Dis. , (2013).</li><li>Saadi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shan+virus:+a+new+mimivirus+isolated+from+the+stool+of+a+Tunisian+patient+with+pneumonia.">Shan virus: a new mimivirus isolated from the stool of a Tunisian patient with pneumonia.</a> Intervirology. 56 (6), 424-429 (2013).</li><li>Claverie, J. -. M., Abergel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mimivirus:+the+emerging+paradox+of+quasi-autonomous+viruses.">Mimivirus: the emerging paradox of quasi-autonomous viruses.</a> Trends Genet : TIG. 26 (10), 431-437 (2010).</li><li>Colson, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viruses+with+more+than+1,000+genes:+Mamavirus,+a+new+Acanthamoeba+polyphaga+mimivirus+strain,+and+reannotation+of+Mimivirus+genes.">Viruses with more than 1,000 genes: Mamavirus, a new Acanthamoeba polyphaga mimivirus strain, and reannotation of Mimivirus genes.</a> Genome Biol Evol. 3, 737-742 (2010).</li><li>Claverie, J. -. M., Abergel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Open+questions+about+giant+viruses.">Open questions about giant viruses.</a> Adv Virus Res. 85, 25-56 (2013).</li><li>Fischer, M. G. M., Allen, M. J. M., Wilson, W. H. W., Suttle, C. A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+virus+with+a+remarkable+complement+of+genes+infects+marine+zooplankton.">Giant virus with a remarkable complement of genes infects marine zooplankton.</a> PNAS. 107 (45), 19508-19513 (2010).</li><li>Van Etten, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Another+really,+really+big+virus.">Another really, really big virus.</a> Viruses. 3 (1), 32-46 (2011).</li><li>Reteno, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Faustovirus,+an+asfarvirus-related+new+lineage+of+giant+viruses+infecting+amoebae.">Faustovirus, an asfarvirus-related new lineage of giant viruses infecting amoebae.</a> J.Virol. , (2015).</li><li>Co&#351;kun, K. A., Oz&#231;elik, S., Tutar, L., Elald&#305;, N., Tutar, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+identification+of+free-living+amoebae+from+tap+water+in+Sivas,+Turkey.">Isolation and identification of free-living amoebae from tap water in Sivas, Turkey.</a> Biomed res Int. 2013, 675145 (2013).</li><li>Bradbury, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free-living+amoebae+recovered+from+human+stool+samples+in+Strongyloides+agar+culture.">Free-living amoebae recovered from human stool samples in Strongyloides agar culture.</a> J Clin microbiol. 52 (2), 699-700 (2014).</li><li>Pagnier, I., Valles, C., Raoult, D., La Scola, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Vermamoeba+vermiformis+and+associated+bacteria+in+hospital+water.">Isolation of Vermamoeba vermiformis and associated bacteria in hospital water.</a> Microb Pathog. 80, 14-20 (2015).</li><li>Ogata, H., Toyoda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remarkable+sequence+similarity+between+the+dinoflagellate-infecting+marine+girus+and+the+terrestrial+pathogen+African+swine+fever+virus.">Remarkable sequence similarity between the dinoflagellate-infecting marine girus and the terrestrial pathogen African swine fever virus.</a> Virol J. 6, 178-178 (2008).</li><li>Tarutani, K., Nagasaki, K., Itakura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+virus+infecting+the+novel+shellfish-killing+dinoflagellate+Heterocapsa+circularisquama.">Isolation of a virus infecting the novel shellfish-killing dinoflagellate Heterocapsa circularisquama.</a> Aquat Microb Ecol. 23, 103-111 (2001).</li></ol>

האפשרות Faustovirus יכול להיות החבר הראשון של משפחה חדשה Megavirales קרוב ASFV הוצע לראשונה על ידי Reteno et al., 19 אבל כמה הבדלים עדיין ניתן להבחין. נראה ברור אם Faustovirus צריך להצטרף למשפחת Asfarviridae או שמא במקום ליצור משפחה ויראלי המשוערת חדש. בעיה זו תדרוש חקירה נוספת, בפרט אפיו?...

גילוי וירוסים ענקים, במיוחד אלה השייכים לסדר Megavirales, שינה לחלוטין את עולם הווירוסים מבחינת גודל חלקיקים ואת המורכבות הגנום. הווירוסים היו בעבר חשבו להיות ישויות קטנות, ואת Mimivirus הופיע לשבור את כל הכללים. 1 נתוני metagenomic מצביעים על ההמצאות בכל המקום של וירוסים ענקים לא רק בסביבה, 2-5 אלא גם בבני אדם. 6 לכן, יש עדיין צורך לחפש וירוסים אלה בקנה מידה גדול. המגוון של וירוסים הענקים אלה הוערך באמצעות דגימה לא רק במגוון סביבות מימיות ומשקעים הקשורים בם ברחבי העולם, 7-11 אלא גם על ידי הקרנת מגוון של דגימות אנושיות 12,13 ו דגימות סביבתיות. 7,9 mimivirus polyphaga Acanthamoeba היה מבודד על-ידי שיתוף התרבות באמצעות הפרוטיסטים phagocytic, spp Acanthamoeba בעיקר. 14-16 אוסף שלם של וירוסים ענקים היה אז גםשבודד מארח לפרוטיסטים שצוין זה, מה שהפך את הקהילה המדעית להגביל הליך מחקר בידודה עבור spp Acanthamoeba. ברור הסתמכות זו על זן לארח אחת הביאה חלק גדול של וירוסים מתעלמים ממנה. עובדת הווירוס הענק, CroV, היה מבודד עם roenbergensis קפיטריה פרוטוזואה הימי הניע מאוד, 17,18 ממחיש את הצורך להשתמש במגוון רחב יותר של פרוטוזואה על מנת לגלות שושלות חדשות או משפחות של וירוסים ענקים. Reteno et al. הצליח לבחור פרוטוזואה אחר כמארחי תא אשר מעולם לא נעשה בה שימוש בעבר, ומבודד את שושלת אספר הקשורות החדשה של וירוסים ענקים (את Faustovirus בשם החדש). 19 בניסיון לבודד גנוטיפים Faustovirus חדשים כדי להרחיב את חברי שושלת ויראלי זה, שינינו נהלי הבידוד שלנו והשתמשנו בם כדי להקרין דגימות סביבתיות מסוגלות קצירת Faustoviruses החדש. לאחר מכן, אנותאר את הפרוטוקול כולו לאפיין את הבידודים החדשים. החוקרים העריכו vermiformis Vermamoeba, את לפרוטיסטים חסרת חיים השכיח ביותר בקרב בסביבות האדם, 20-22 שכבר משמש את בידודה של אבטיפוס Faustovirus הראשון E12. 19 זה לפרוטיסטים כרגע עדיין לארח ספציפי עבור Faustovirus. ידענו שאף אחד הווירוסים הענקים הידועים היה פתוגניים עבור אמבה זה, כי אף ניסיונות לגדל וירוסים ענקים אחרים במעבדה שלנו הראתה תמוגה אמבה או צמיחת ויראלי. מסיבה זו, אנו מאמינים כי V. vermiformis היא התמיכה הסלולרית הטובה ביותר והייחודית ביותר הידועים לבודד Faustoviruses חדש.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="751">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">LSR FORTESSA cytometer&#160;</td>
			<td style="width:231px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">France&#160;</td>
			<td style="width:167px;">649225B4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">TECNAI G2 F20</td>
			<td style="width:231px;">FEI</td>
			<td style="width:119px;">Germany&#160;</td>
			<td>5027/11</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Optical inverted microscope</td>
			<td style="width:231px;">leica&#160;</td>
			<td style="width:119px;">France</td>
			<td>72643</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:235px;">DNA extraction</td>
			<td style="width:231px;">Qiagen EZ1 Advanced XL Extraction Robot</td>
			<td style="width:119px;">France&#160;</td>
			<td>L106A0452</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">PCR Cycler CFX96</td>
			<td style="width:231px;">Bio rad</td>
			<td style="width:119px;">France</td>
			<td>785BR06298</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:235px;">PYG medium , PAS, Starvation medium</td>
			<td style="width:231px;">In house laboratory production&#160;</td>
			<td style="width:119px;">Marseille URMITE</td>
			<td>x</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Amoeba strain CDC-19</td>
			<td style="width:231px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">France</td>
			<td>50237</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Plates</td>
			<td style="width:231px;">Cellstar</td>
			<td style="width:119px;">France</td>
			<td>655180</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">PCR materials, primers.&#160;</td>
			<td style="width:231px;">eurogentec</td>
			<td style="width:119px;">France</td>
			<td>Primers cited in manuscript</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">glasstic slide 10 with grids</td>
			<td style="width:231px;">Kova&#160;</td>
			<td style="width:119px;">USA</td>
			<td style="width:167px;">H899871441F</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Eosin/ blue Azur-Hemacolor stain</td>
			<td style="width:231px;">Merck milipore&#160;</td>
			<td style="width:119px;">France</td>
			<td>111955,6,57,109468</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Vacuum driven filters</td>
			<td style="width:231px;">Thermo scientific</td>
			<td style="width:119px;">France</td>
			<td>BPV4550 / 20170115</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td style="width:231px;">Thermo Fisher scientific&#160;</td>
			<td style="width:119px;">France&#160;</td>
			<td>10010-023</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">DAPI stain</td>
			<td style="width:231px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">France&#160;</td>
			<td>D1306</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">cytospin&#160; 4 cytocentrifuge</td>
			<td style="width:231px;">Thermo Fisher scientific&#160;</td>
			<td style="width:119px;">France&#160;</td>
			<td>10522013JT184-31</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Single cytology tunnel</td>
			<td style="width:231px;">Biomedical polymers inc.</td>
			<td style="width:119px;">France</td>
			<td>BMP-cyto-S50</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Carbon grids&#160;</td>
			<td style="width:231px;">Euromedex</td>
			<td style="width:119px;">France&#160;</td>
			<td>FCF400NI</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Ammonium molibdate</td>
			<td style="width:231px;">VWR internationanl&#160;</td>
			<td style="width:119px;">France&#160;</td>
			<td>21276185</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Flasks&#160;</td>
			<td style="width:231px;">SARSTEDT</td>
			<td style="width:119px;">Germany</td>
			<td>833911</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">0.22&#956;m filters&#160;</td>
			<td style="width:231px;">Milex millipor&#160;</td>
			<td style="width:119px;">France</td>
			<td>SE2M229104</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Ultracentrifuge Sorval WX 80</td>
			<td style="width:231px;">Thermo scientific</td>
			<td style="width:119px;">France</td>
			<td>9102448</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Rapid-flow filters</td>
			<td style="width:231px;">Nalgene</td>
			<td style="width:119px;">France</td>
			<td>450-0020</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a rapid strategy for the isolation of new faustoviruses from environmental samples using vermamoeba vermiformis

בידודו של וירוסים ענקים הוא עניין רב בעידן החדש הזה של וירולוגיה, במיוחד מאז וירוסים הענקים אלה קשורים הפרוטיסטים. וירוסים ענקים עשויים להיות פתוגניים פוטנציאליים עבור מינים רבים של הפרוטיסטים. הם שייכים הסדר המתואר לאחרונה Megavirales. השושלת החדשה Faustovirus כי כבר מבודד דגימות שפכים הוא קרוב רחוק של נגיף קדחת החזירים אפריקה יונקים הפתוגן. וירוס זה הוא גם ספציפי לאותו המחשב שלה amoebal, vermiformis Vermamoeba, לפרוטיסטים נפוצים במערכות מי בריאות. זה חיוני כדי להמשיך לבודד גנוטיפים Faustovirus חדשים כדי להגדיל אוסף גנוטיפ שלה וללמוד הפאן הגנום שלו. פתחנו אסטרטגיות חדשות עבור הבידוד של זנים נוספים על ידי שיפור שימוש שילובי אנטיביוטיקה נגד פטריות על מנת למנוע זיהומי חיידקים ופטריות של שיתוף תרבות האמבה ו לטובת כפל הווירוס. גם אנחנו יישמנו starvatio חדשn בינוני לשמור V. vermiformis בתנאים אופטימליים עבור וירוסים שיתוף תרבות. לבסוף, השתמשנו cytometry זרימה במקום תצפית מיקרוסקופית, וזה זמן רב, כדי לזהות את השפעת cytopathogenic. השגנו שני בידודים ממדגמים ביוב, להוכיח את היעילות של שיטה זו, ובכך להרחיב את אוסף Faustoviruses, כדי להבין טוב יותר את סביבתם, סגולי המארח תוכן גנטי.

המערכת למדה בכתב היד הזה תוקפת הוכחה של מושג על ידי בידוד השני Faustoviruses החדש. מבין 70 הדגימות שנבדקו, שני פרקים לתמס אותרו, בניגוד לביקורות השליליות האמינות שלנו. השליטה השלילית עבור תמוגה הכילה אוכלוסיית אמבת 86%. לעומת זאת, דגימות חיוביות (ST1 עבור סנט פ?...

Watch this Scientific Journal Video about A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis at JoVE.com

A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis

We describe here the latest advances in viral isolation for the characterization of new genotypes of Faustovirus, a new asfarvirus-related lineage of giant viruses. This protocol can be applied to the high throughput isolation of viruses, especially giant viruses infecting amoeba.

אסטרטגית ראפיד עבור הבידוד של ניו Faustoviruses ממדגמים סביבת שימוש<em&gt; Vermiformis Vermamoeba</em

The isolation of giant viruses is of great interest in this new era of virology, especially since these giant viruses are related to protists. Giant ...

The overall goal of this new isolation strategy is to widen the number of new virus isolates in order to study the pan-genome of this new viral family, and to better understand their ecosystems and potential pathogenicity to humans. This method can answer key questions in the virology field, to help virologists world wide interested in prospecting giant viruses and faustoviruses in particular. The main advantage of this technique is that it show new improvement to many stage like the antibiotic and antifungal mixture.The new starvation medium adapted for the amoeba and the use of floss-cytometry for faster and more sensitive lysis detection. After collecting dirty water samples according to the text protocol, prepare the host cell, V.vermiformis by adding the amoebae to a 75 square centimeter cell culture flask with 30 milliliters of protease peptone yeast extract glucose, or PYG medium and incubate at 28 degrees Celsius for 48 hours. Use counting slides to count the amoebae and when they reach a concentration of five times 10 to the 5th, to 10 to the 6th cells per milliliter, harvest the cells by centrifugation at 720 times g for 10 minutes.Aspirate the supernatant, and use 30 milliliters of sterile pages amoebal saline or PAS to resuspend the amoebae pellet. After rinsing the pellet a second time, use 30 milliliters of starvation medium, containing an antibiotic and an antifungal to resuspend the cells to approximately 10 to the 6th amoeba per milliliter. Starvation medium enables the amoebae to stay alive without encystment or multiplication.Next, seed 200 microliters of amoeba in the wells of a 96 well flat bottom plate and incubate at 30 degrees Celsius for 30 minutes. Then, after vortexing the water samples for one minute at room temperature, innoculate 25 microliters of each sample onto the amoebae cells, leaving two wells without sample as negative controls. To avoid evaporation, place the plate containing the primo culture into a bag with a wet compress, and place the humidified chamber with plate into an incubator at 30 degrees Celsius.Three days after the first innoculation, sub-culture the primo culture plate onto a fresh 96 well plate of amoebae as just demonstrated, without any microscopic observation. Incubate at 30 degrees Celsius for three days. Then, using the subculture, innoculate a third plate as just described, and incubate for two days.To detect lysis in the final cocultured plate, turn on the cytometer and run a clean and rinse according to the manufacturer's protocol to reduce the background noise. To carry out a 40 minute completely automated acquisition, launch the high throughput sampler or HTS to automatically load samples from the 96 well plate according to the manufacturer's protocol. Program the HTS settings as listed here.That include a sample volume of 150 microliters, a mixing volume of 50 microliters, a mixing speed of 180, the number of mixes as 5, a washing volume between samples of 400 microliters, a flow rate of 2.5 microliters per second, and the number of recorded events as 10, 000. Click on home to allow the HTS to spot or locate the plate. Then assess the negative control wells containing the host amoeba cells first.In order to gate the amoeba population, and to determine the cell percentage according to their physical characteristics. Be sure to have a homogeneous amoeba population and a second population of lower events corresponding to debris and noise. Next, start the gating by clicking acquire sample.Then, using the arrow, which defines the gates, localize the amoeba population of interest. After gating at least 10, 000 events, click on run to allow the HTS to automatically run the entire plate. Perform data acquisition and analysis according to the size parameter forward scatter and the structure parameter side scatter.Refer to the text for additional details. Following licence detection by flow-cytometry, pipette the lysed cocultures to suspend the remaining amoebae. After pipetting 50 microliters of each sample onto slides, directly cytocentrifuge the suspension at 800 times g for 10 minutes.Next, use pure methanol to fix the slides, then leave the slides to dry at room temperature. After fixation, plunge the slides into ESN solution three times for four seconds each before placing the slides into blue azur for six seconds. Finally, plunge the slides into PBS for 45 seconds.Leave the slides to dry at room temperature before proceeding to observation. To stain new fixed slides with DAPI, pipette 15 microliters of DAPI into the dry slides. Observe the slides under a light microscope at 1000x magnification in order to check for the presence of virus factories.To carry out electron microscopy, deposit five microliters of the positive sample onto a glow-discharged grid, and incubate at room temperature for approximately 20 minutes. Carefully dry the grid, then add a small amount of 1%ammonium molybdate and incubate for 10 seconds. After carefully removing the drop, allow the grid to dry for five minutes.Next, set the electron microscope to 200 kiloelectron volts. Then, place the grid on the holder and introduce the holder into the microscope. Click on the vacuum overview icon and check the vacuum.Then, close the valves, and set a spot size of five, and a magnification of 25, 000 before beginning observation. After locating a giant virus on the acquisition screen, use the measure tool to measure the virus. Carry out molecular biology and viral genome sequencing according to the text protocol.This figure shows results from the detection of two faustoviruses compared to the reliable negative controls. The negative control for lysis contained an 86%amoeba population. By contrast, more than 60%of the amoebae were lysed with the highest percentage of debris in the positive samples.As seen here, Eus and blue azur stains the nuclei of uninfected and infected amoebae cells, and the presence of virus factories inside the infected cells. DAPI staining also confirms the presence of virus factories inside amoebae. In these images, electron microscopy reveals the presence of faustovirus with the typical appearance of megavirals composed of an icosadedral capsid that lacks fibrils and a size of 200 nanometers.Once mastered and after the coculture, this technique of lysis detection and virus characterization can be done in an hour, if it's performed properly. While attempting this procedure, it is important to remember to control the amoebal viability and to check any probable contaminations. Following this procedure, other methods like molecular biology targeting giant viruses can be performed in order to answer additional questions like the virus family and or genotype.After its development, this technique paved the way for researchers in the field of virology to explore this viral family, their specific host, and their potential pathogenicity. After watching this video, you should have a good understanding of how to easily isolate giant viruses by widening the number and types of samples and by choosing the best host cell and the best control conditions. Don't forget that working with viruses potentially pathogenic for humans can be extremely hazardous, specially with huge samples.So precautions such as working in an SB2 labs with secure conditions should always be taken while performing this procedure.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis

Separation of Single-stranded DNA, Double-stranded DNA and RNA from an Environmental Viral Community Using Hydroxyapatite Chromatography

ההפרדה של ה-DNA חד גדילי, פעמיים תקועים DNA ו-RNA מהקהילה ויראלי הסביבה באמצעות כרומטוגרפיה hydroxyapatite

Viruses, particularly bacteriophages (phages), are the most numerous biological entities on Earth1,2.  Viruses modulate host cell abundance and diversity, ...

Multiplex Detection of Bacteria in Complex Clinical and Environmental Samples using Oligonucleotide-coupled Fluorescent Microspheres

Multiplex זיהוי של חיידקים דוגמאות מורכבות קלינית הסביבה באמצעות oligonucleotide מצמידים פלורסנט microspheres

Bacterial vaginosis (BV) is a recurring polymicrobial syndrome that is characterized by a change in the "normal" microbiota from Lactobacillus-dominated ...

Isolation and Genome Analysis of Single Virions using 'Single Virus Genomics'

בידוד ואנליזה של הגנום virions יחיד באמצעות &#39;נומיקס וירוס אחד &quot;

Whole genome amplification and sequencing of single microbial cells enables genomic characterization without the need of cultivation 1-3. Viruses, which ...

Right Ventricular Systolic Pressure Measurements in Combination with Harvest of Lung and Immune Tissue Samples in Mice

מדידות נכונות חדרית סיסטולי לחץ בשילוב עם קציר של ריאה ודגימות רקמה חיסוניות בעכברים

The function of the right heart is to pump blood through the lungs, thus linking right heart physiology and pulmonary vascular physiology. Inflammation is ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

זיהוי מהיר של חיידקים גראם שליליים מהדם תרבות מרק שימוש MALDI-TOF המוני ספקטרומטריית

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH

ניתוח מהיר של סטיות כרומוזום בעכבר לימפוציטים מסוג B על ידי הרשות הפלסטינית-FISH

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency ...

Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

בידוד של לויקוציטים מרקמות Murine בממשק האם והעובר

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

האף מגבונים לשפעת זיהוי וירוסים ובידוד מחזירים

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles Produced by Iron-limited Mycobacteria

בידוד ואפיון מסחטות ושלפוחיות מתוצרת ברזל-בקטריה מוגבלת

Mycobacteria, including Mycobacterium tuberculosis (Mtb), the causative agent of human tuberculosis, naturally release extracellular vesicles (EVs) ...