Name: antibody binding specificity for kappa (v&#954;) light chain-containing human (igm) antibodies: polysialic acid (psa) attached to ncam as a case study
Uploaded: 2016-06-29T14:00:00
Duration: 11 min 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Antibody Binding Specificity for Kappa VÃŽÂº Light Chain-containing Human IgM Antibodies: Polysialic Acid PSA Attached to NCAM as a Case Study at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמוסד הלאומי לבריאות (R01 GM092993, R01 NS048357 ו R21 NS073684), הקרן הלאומית למדע (פרס קריירה), פרס שותפות מינסוטה לביוטכנולוגיה והרפואי Genomics, האגודה לטרשת הלאומית המרובה (CA1060A) , ואת המרכז המרפא מאיו למדע קליני Translational (CCaTS). המחברים מודים תמיכה מן אפלבאום, הילטון, פיטרסון ומקרנות סנפורד, הירח ומרילין פארק קרן מנהלות ומשפחת McNeilus.

Patents for antibodies that promote remyelination and CNS repair are issued and owned by Mayo Clinic. Authors have a potential conflict of interest.

נוגדנים עצמיים IgM טבעיים אדם פונים מועמדי immunotherapies ו הוכיחו פוטנציאל טיפולי לטיפול במחלות שונות, כולל סרטן והפרעות במערכת עצבים מרכזיים 1-7. לתועלתו, נוגדנים אלה לא לעורר תגובה חיסונית אשר הדור של נוגדנים מנטרלים מפחית את המינון טיפולי האפקטיבי משמעותי ויעילות. חשוב לציין, כל הנוגדנים עם פוטנציאל טיפולי היו של אלוטיפ IgM ושייכים הרפרטואר NAB 3-5,8,9,37,40,42-45. משוכה גדולה עבור היישום הקליני הפוטנציאל של נוגדני IgM היא זיהוי של אנטיגנים שלהם, אשר לא ידועים במקרים רבים. טכניקות סטנדרטיות מועסקות נוגדני IgG הן בדרך כלל לא ישים לזהות אנטיגן של IgM. פרוטוקול זה מתאר את זיהוי של PSA-NCAM כמו אנטיגן עבור HIgM12 נוגדני IgM אדם רגנרטיבית, יעיל במודלים של בעלי חייםשל MS ו- ALS 15-18. המתודולוגיה בשימוש ישימה בעיקר לכל נוגדנים אנושיים עם שרשראות אור Vκ ספציפיים VκI, VκIII ו VκIV ונוגדנים העכבר עם שרשראות אור VκI, ללא קשר אלוטיפ של נוגדן. השלב הקריטי ביותר בפרוטוקול זה הוא השימוש נוגדני IgM ביישומי כרומטוגרפיה זיקה. באופן ספציפי יותר, נוגדנים מוצלחים נדרשים לפעול כסוכנים הנפתח ב immunoprecipitations לבודד או להעשיר אנטיגן מתוך lysates רקמות או תרבית תאים המורכב. שברי אנטיגן מועשרים ניתן להשוות immunoprecipitations מ נוגדנים לשלוט אלוטיפ ובהמשך נתחו להבדלים ידי ספקטרומטריית מסה. אחת דרישה הכרחית או הגבלה של שלב זה היא הנוכחות של שרשרת אור מארח הנכון נוגדן Vκ (אדם, העכבר) כדי לאפשר נוגדן מחייב agarose חלבון L. שימוש חלבון mannan מחייב בהכרח agarose (גם Calleד מנוז מחייב לקטינים) במקום agarose חלבון L היא אלטרנטיבה פוטנציאל immunoprecipitate IgMs ללא שרשראות אור ספציפי Vκ. עם זאת, כאמור על ידי ארנולד et al. 35, נוגדנים IgM הנכנס אנטיגן לא להיקשר לחלבון mannan מחייב, כמו glycan היעד נראה הופכים נגישים פעם IgM הכפיף אותו אנטיגן שלה. בהתבסס על ממצאים אלו mannan מחייב חלבון לא ניתן להשתמש כמטריצה ​​מחייב immunoprecipitate טעון אנטיגן IgM מולקולות 35. חלופות אפשריות אחרות עשויות להיות שימוש נוגדנים אנטי-IgM agarose הנכנס משני IgG 46,47 או שימוש חרוזים מגנטיים המופעל משטח 48. נוגדני IgG מכוונים נגד IgMs יכולים להיות crosslinked כימי agarose A או agarose G על מנת לצמצם את היקף נוגדן eluted יחד עם האנטיגן של עניין. השוואה נכונה בין גרסאות שונות של immunoprecipitation IgM ביחס אנטיגנים זיהו בהצלחה iזה קשה כי רוב immunoprecipitations בוצע כדי לבודד או לרוקן IgMs ללא ריבית נוספת אנטיגנים שלהם. בנוסף, immunoprecipitations באמצעות IgMs שמש בעיקר כדי לאשר אנטיגן כבר ידוע או צפוי יחיד עם חשיפת נוגדנים לאנטיגנים מטוהרים 49. חסרון של IgGs מצמיד agarose מכוון נגד אדם IgMs הוא תשואה נמוכה מאוד (10 - 15%) של מולקולות immunoprecipitated בסרום IgM כשמשווה את החומר המוצא 50. לעומת זאת, חרוזים מגנטיים המופעל משטח יושמו בהצלחה לנוגדנים של isotypes השונה כולל IgM כדי immunoprecipitate סיבים הקשורים scrapie 48. שיטה זו אינה מצטמצמת אך קאפה ספציפי (Vκ) או למבדה (λ) שרשרות או שורה מסוימת ועשויה להרחיב בצורה ניכרת את הספקטרום של נוגדני IgM המשמשים immunoprecipitations. צעד חשוב נוסף בפרוטוקול הוא היכולת של הנוגדן לתפקד בתור detecting נוגדן (נוגדן ראשוני) ב כתמים מערביים או פלטפורמות סריקה אחרות. נוגדנים מוצלחים חייבים למקד אנטיגן שלהם עם זיקה גבוהה מספיק כדי לאפשר אנטיגן מחייב בנוכחות דטרגנטים שאינם יונים או אולי יוניים. נוגדני זיקה גבוהים נפוצים בקרב נוגדני IgG-maturated זיקה, אבל פחות נפוצים בקרב נוגדנים של אלוטיפ IgM, שהיא אחת הסיבות מדוע יש יחסית מעט נוגדני IgM זמינים מסחרי כמו גילוי סוכנים במסגרות ביוכימיים. זיקה גבוהה המחייבת של נוגדנים מהווה דרישה immunoprecipitations של אנטיגנים מולקולרי עבור מערבי סופג. הפחתת ריכוזי חומר ניקוי או ההעדר המוחלט של דטרגנטים מאגרי IP או מאגר תמוגה מאפשרת אנטיגן מיקוד ידי נוגדנים נמוך זיקה באמצעות תחום Fab שלה. לעומת זאת, היכולת של הנוגדן למקד agarose חלבון L באמצעות חלק Fc שלו אינה מושפעת באופן משמעותי בקרב שולטת אלוטיפ על פני טווח של concen חומר ניקוי השונהtrations. עם זאת, ריכוז חומר ניקוי נמוך במאגר תמוגה חיץ IP מונע הפרעת קרום תא ובידוד של מולקולות ספציפיות. באופן דומה, ריכוז חומר ניקוי נמוך מאגרי כביסת כתם מערביים (למשל, PBS-T) מאפשר אנטיגן מחייב של נוגדנים בעלת זיקה נמוכה אך בעת ובעונה האחת מגדיל את הלא ספציפי מחייב ולכן הוא לא אופציה. הנוכחות של ליבת חלבון אנטיגן היא דרישה נוספת עבור שיטה זו. חלבונים עם שינויי posttranslational (למשל, גליקופרוטאינים, ליפופרוטאינים) וחלבונים ללא שינוי, אך לא שומנים בלעדיים או פחמימות, ניתנים לזיהוי ב כתמים מערביים. זה לא ניתן immunoprecipitate שומנים (למשל, ספינגוליפיד) מ lysates רקמות או תאים בנוכחות או בהיעדר דטרגנטים. מאפייני physicochemical של דטרגנטים ושומנים דומים מכדי לאפשר אינטראקציות שומנים-נוגדן סלקטיבי, בעוד באותו הזמן דטרגנטים חיוניים לשבשממברנות כדי לאפשר בידוד סלקטיבי של מולקולות ספציפיות. למיטב ידיעתנו, immunoprecipitations המורכב אך ורק של פחמימות, בהעדר גרעין חלבון, לא דווח בעבר. זה הופך רלוונטי במיוחד בגלל נוגדנים IgM לעתים קרובות למקד פחמימות glycolipids, אשר אינן צמודות בהכרח ליחידת חלבון. טכניקות chromatographic אחרות נדרשות לזיהוי ההפרדה אימונולוגית של שומנים ופחמימות בהיעדר גרעין חלבון. לדוגמא, כרומטוגרפיה בשכבה דקה (TLC) של שומנים הסלולר עם זיהוי נוגדן עוקב על צלחת TLC (החיסונית TLC) ניתן ליישם 51,52. נוגדנים נגד ה- PSA אחרים תוארו במחקרים קודמים ותוצאות לעומת HIgM12 וכן IgM אנטי PSA הזמין המסחרי (שיבוט 2-2B). הנוגדן הנפוץ ביותר בתחום ה- PSA הוא נוגדן IgG (שיבוט 735) זמין עכבר monoclonal או ארנב polyclonal נוגדן 53. נוגדן אנטי PSA IgG זה מזהה PSA על SynCAM ו NCAM על תאים מסוגים שונים במערכת העצבים המרכזית כולל תאים microglial 41. בניגוד הנוגדן IgG אנטי PSA, נוגדנים IgM האדם HIgM12, HIgM42 ואת IgM העכבר אנטי PSA (שיבוט 2-2B) אינם מסוגלים למקד PSA על SynCAM (אבל על NCAM) בשעה שלבי הלידה העוברית המוקדמת שונים בעכברים ואילו SynCAM הלא polysialylated ניתן לזהות בקלות 15. הנוגדנים IgM בהם נעשה שימוש הם גם לא מסוגל לזהות PSA על תאים microglial (איורים 3 + 4). הסבר אפשרי ההבדלים שנצפו בין isotypes נוגדנים עשוי להיות רמות נמוכות PSA-SynCAM לעומת רמות של PSA-NCAM בשילוב עם זיקה פוטנציאלית נמוכה יותר מחייב של נוגדנים IgM לעומת IgG אנטי-PSA. כדי לבחון השערה זו, ביצענו immunoprecipitations בחיות NCAM KO בשלב העוברי E17 עם כמויות עצומות של ההווה SynCAM והשתמשו HIgM12 בתור &quot;סוכן הנפתח&quot; &lt;sup&gt; 15. בשנת להמלטה WT E17 שולטת HIgM12 immunoprecipitated PSA-NCAM במידה שהראו בעוצמות דומות של &quot;הוריד&quot; PSA-NCAM לעומת שרשרת IgMs כבד כפי שזוהו על ידי צפיפות ב כתם המערבי לאחר מכן באמצעות אנטיגנים eluted. תוצאה זו הציעה לפחות זיקה מספקת של HIgM12 כדי PSA היעד שלה. בניגוד להמלטה WT שולט HIgM12 לא לזהות PSA המצורפת SynCAM בחיות KO NCAM. תוצאות זהות התקבלו immunoprecipitations באמצעות IgM HIgM42 אנטי PSA האדם. HIgM12 ו HIgM42, כמו גם את העכבר אנטי PSA IgM (שיבוט 2-2B) לא הצליחו למקד PSA על SynCAM ב כתמים המערבי מחיות WT ו NCAM KO בשלבים התפתחותיים עובריים לאחר הלידה. בהתחשב בכמות הנמוכה של HIgM12 נדרשה (0.1 מיקרוגרם / מיליליטר) כדי לזהות PSA מצורפת NCAM דווקא כתמים מערביים באמצעות כמויות קטנות של רקמת מערכת עצבים המרכזית (CNS 0.1 מיקרוגרם רקמה לכל טוב) 15 זה נראה סביר כי זיקות נמוכות לבד הםאחראי חוסר מוחלט של זיהוי PSA-SynCAM ידי HIgM12 בשלוש שיטות שונות. אנו מסיקים כי ישנם הבדלים משמעותיים בין נוגדנים נגד ה- PSA IgM ואת נוגדן IgG אנטי PSA המפורסם התדיר (שיבוט 735). לא ברור מדוע זמינים מסחרי נוגדנים נגד ה- PSA IgM לא היו רגילים בתדירות גבוהה יותר בעבר לאשר את תוצאות שהושגו עם antiPSA IgG נוגדנים 735. זה מעניין במיוחד משום HIgM12 כבר הוכיח יעיל במודלי מחלה שונים. בעוד נוגדנים נגד ה- PSA IgM אחרים עשויים להיות השפעות טיפוליות דומות עדיין לא ברור האם נוגדן IgG אנטי PSA (שיבוט 735) יש תוצאה טיפולית דומה במודלים של טרשת הנפוצה ALS. בקיצור, השיטות שתוארו כאן שימשו בעיקר כדי לזהות את האנטיגן של HIgM12 נוגדן אנושי משובי לתמוך בניסויים קליניים פוטנציאל MS ואולי מחלות ניווניות אחרות. זיהוי של נמלהigens נוגדנים בעלי פעילות ביולוגית הוא צעד חיוני כדי להבין את מנגנון הפעולה שלהם. זה הופך רלוונטי במיוחד בהקשר של נוגדנים חד שבטיים רבים בימים אלה נבדקים על בטיחות ויעילות בניסויים בבני אדם. בעוד מספר נוגדנים IgM נבדק קלינית עד כה הוא קטן, השיפורים האחרונים בטכנולוגיה hybridoma יחד עם מספר גדל והולך של מחקרים המדגיש את הפוטנציאל הטיפולי של הכיתה נוגדן זה 1-10,37,40,42-45 קורא מפיתוח מוצרים חדשים וחדשניים או שיטות שונות ישים לזהות אנטיגנים IgM הלא חלבון.

נוגדנים של אלוטיפ IgM להפגין פוטנציאל טיפולי רב לטיפול במחלות שונות, כולל סרטן והפרעות במערכת העצבים המרכזית 1-7. הקבוצה &#39;Vollmers זיהתה נוגדנים רבים בקרב חולי סרטן לשימוש פוטנציאל לשמש כסמנים ביולוגיים או רפוי פעיל-גידולים ספציפיים המסוגלים להרוג תאים ממאירים על ידי גרימת מסלולי אפופטוטיים 4,8,9. המעניין לשים לב שכל הנוגדנים המזוהים עם פוטנציאל טיפולי הם של אלוטיפ IgM ולהשתייך לקבוצה &quot;נוגדנים עצמיים טבעיים&quot; (חטיף). בדומה לכך, הקבוצה של רודריגז מזוהה עכבר נוגדנים אנושיים המעודדים מיאלין מחדש בנגעי חוט שדרת demyelinated הכרוני במודלים של טרשת נפוצה (MS). זהה נוגדנים עם השפעות נוגדות סרטן, כל הנוגדנים לקידום מיאלין מחדש הם nabs ושל אלוטיפ IgM 1,6,7,10. אנטיגנים המדויק IgMs המזוהה ביותר עדיין undetermineד כולל נוגדן אנושי לקידום מיאלין מחדש rHIgM22, כרגע בשלב הראשון של הניסויים הקליניים של חולים בטרשת נפוצה 11. למרות מאמצים חוזרים ונשנים על ידי מומחים בתחום של מחקר שומנים פחמימות הן את ההגדרה האקדמית בשיתוף עם התעשייה 11, מנסה לזהות אנטיגן של rHIgM22 לא הוכתרו בהצלחה. הכישלון של טכניקות סטנדרטיות המשמשות לזיהוי אנטיגנים של נוגדני IgG לעבוד עם נוגדני IgM מזהה צורך קריטי כדי לחדד שיטות ספציפיות נוגדנים אלה כי היעד הסביר ביותר אנטיגנים פחמימות או שומנים. ההתמקדות של כתב היד הזה היא נוגדן משובי אדם HIgM12 ואת הפרוצדורות המשמשות לזיהוי אנטיגן שלה. נוגדן HIgM12 זוהה מחולים עם macroglobulinemia של Waldenstrom, מגרה תולדה neurite במבחנה 12-14 וממקד חומצה polysialic (PSA) מחוברת מולקולת הידבקות התא העצבי (PSA-NCAM) 15,16. HIgM12 ומאריכה את תוחלת חיים במודל של עכברים של ALS 17 ומשפרת תוצאה תפקודית בנגיף encephalomyelitis בעכברים של Theiler (TMEV) עכברי -infected. באופן ספציפי, HIgM12 מגרה פעילות מוטורית אופקית ואנכית ספונטנית demyelinated כרוני מספרי עכברים ועליות של אקסונים בחוט השדרה בקוטר קטן ובינוני שמונה שבועות לאחר מנה אחת, נמוכה של intraperitoneal מוזרקת נוגדן 18. מולקולת הידבקות תא העצבית (NCAM) היא גליקופרוטאין של אימונוגלובולינים (איג) הביעו superfamily על פני התא של הנוירונים, גליה, שרירי שלד, תאי הרג טבעי 19-25. השלושה isoforms NCAM הגדול כינת NCAM180, NCAM140, ו NCAM120, הם וריאנטים אחוי חלופה של תמליל עיקרי להשתנות רק בתחום ציטופלסמית שלהם. בתוך מערכת העצבים המרכזית, NCAM היא מולקולת polysialylated הגדולות (&gt; 95%) עם ארוך, homopolymers חומצה sialic טעונים שלילית. PolysialicCID עם n&gt; 10 נקרא PSA אבל מבני oligomeric קצרים קיימים כי הם גם ביולוגיים רלוונטיים. חלבונים polysialylated אחרים הביעו במערכת העצבים המרכזית הם SynCAM1 26, Neuropilin-2 (מפד&quot;ל-2) 27,28 ו למקטע ערוץ נתרן 25 (לסקירה ראה 29). השיטות שתוארו כאן ניתן לזהות אנטיגן עבור אימונוגלובולינים האדם והעכבר המכיל ספציפי קאפה (Vκ) שרשראות אור (VκI, VκIII או VκIV שרשראות אור עבור נוגדנים אנושיים ורשתות אור VκI נוגדנים העכבר) אינו מותנה של אלוטיפ של נוגדן (למשל, IgG, IgM , IgA, IGD או IgE). מגבלה זו מבוססת על שימוש של agarose L חלבון עבור immunoprecipitations עם נוגדנים של אלוטיפ IgM. אסטרטגיות חלופיות יכולות לכלול לקטינים מחייב מנוז ונוגדנים אנטי-IgM IgG משני קשור קוולנטית agarose חרוזים, אשר עשוי להרחיב את תחולת בשיטה זו כדי נוגדנים יותר IgM including אלה עם למבדה (λ) שרשראות אור (ראה דיון). יחסי חלק מרשתות אור בסרום IgM Vκ לעומת שרשראות אור λ IgM נגזר אנשים בריאים הם 1.5: 1 30. בהתבסס על המתודולוגיה chromatographic משמשת כאן כדי להפריד, להעשיר אימונולוגית לזהות מולקולות מסוימות 31, כל אנטיגנים נדרשים לכלול לפחות תחום חלבון קטן אחד. את epitope מחייב הספציפי של הנוגדן יכול להיות בתוך או מחוץ לתחום החלבון (לדוגמא, ב גליקופרוטאינים, ליפופרוטאינים). צעדים ביוכימיים ראשוני המשמש לזיהוי אנטיגן ספציפי עבור HIgM12, בהתאמה כדי לצמצם את רשימת המועמדים הפוטנציאליים, הם הצעדים החשובים ביותר בשיטה זו. סוג תא הכנות ספציפיות אפיונים מבוססי תאי מורפולוגיה מתוארות ביחס ותאי גלייה אבל מתודולוגיה זו ניתן להסיק על להכיל סוגי תאים אחרים בתוך או מחוץ למערכת העצבים המרכזית. ישן דחוףצריך לפתח טכניקות חדשות או שונות ישימות עבור המספר הולך וגדל של נוגדני IgM עם פוטנציאל טיפולי להפרעות אנושיות שונות במיוחד באותם מקרים (רוב אנטיגנים IgM) שבו הנוגדן המכוון הם מבני פחמימות או שומנים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1072">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM</td>
			<td style="width:235px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">MT-10-013-CVRF</td>
			<td style="width:503px;">HIGH GLUCOSE, with glutamine, with sodium pyruvate, 500 ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM/F-12, HEPES</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11330-032</td>
			<td>500 ml, L-glutamine, sodium pyruvate, high glucose</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>10,000 U/mL, 100 ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N-2 Supplement (100X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>5 ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B-27 Supplement (50X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>serum free, 10 ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum - Optima</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S12450</td>
			<td>500 ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">STERILE WATER FOR IRRIGATION</td>
			<td>Baxter Healthcare</td>
			<td>#2F7114</td>
			<td>USP-1000 ml, 12/CA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Poly-D-lysine hydrobromide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7886-50MG</td>
			<td>D-Lys-(D-Lys)n-D-Lys &#183; xHBr, Molecular Weight 30,000-70,000 g/mol, 50 mg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">bovine serum albumin fraction V</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-3294-100G</td>
			<td>heat shock fraction, protease free, pH 7,&#160; purity 98%, 100 g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5767-500G</td>
			<td>C6H12O6, 
			 
			Molecular Weight: 180.16 g/mol, ACS reagent, 500 g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9935-100mg</td>
			<td>essentially salt-free, lyophilized powder, =9,000 BAEE units/mg protein,</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Deoxyribonuclease I from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5025-150KU</td>
			<td>Type IV, lyophilized powder, =2,000 Kunitz units/mg protein</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant Rat FGF basic Protein</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>3339-FB-025</td>
			<td>BSA as a carrier protein, 25 ug, lyophilized, &#62;95%, 16.2 kDa</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant Rat PDGF-AA Protein</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>1055-AA-50</td>
			<td>carrier free, 50 ug, lypphilized, &#62;97%, E.coli-derived, 12.5 kDa</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Neurobasal-A</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10888-022</td>
			<td>500 ml, No Glutamine, No Aspartic Acid, No Glutamic Acid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148-1KG</td>
			<td>crystalline, 1 kg, reagent grade, Molecular Weight 30.03 g/mol (as monomer)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris[hydroxymethyl]aminomethane (Tris bas</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>#1610719</td>
			<td>1 kg, 99.8% pure, powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>#1610302</td>
			<td>1 kg, powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP-381-5</td>
			<td>C2H5NO2, Molecular weight: 75.07 g/mol, White crystalline Powder, 5 kg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7653-5KG</td>
			<td>NaCl, Molecular Weight: 58.44 g/mol, 5 kg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0751-500G</td>
			<td>NaH2PO4, Molecular Weight: 119.98 g/mol, 500 g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate-buffered Solution 1X (PBS)</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>MT-21-040-CV</td>
			<td>Without Calcium and Magnesium, 6 x 500 ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon 60mm TC-Treated Cell Culture Dish</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>#353002</td>
			<td>60 mm Cell Culture Dish, TC-treated polystyrene, 20/pack, sterile</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon 60 mm x 15 mm Petri dish</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>#351007</td>
			<td>Not TC-Treated Bacteriological Petri Dish, 20/Pack</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6 well cell culture plates</td>
			<td>Corning Costar</td>
			<td>CLS3516</td>
			<td>6 well, flat bottom (Individually wrapped), gamma-irradiated, growth area 9.5 c</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">75cm&#178; tissue culture flask</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>430720U</td>
			<td>75cm&#178; U-Shaped Canted Neck Cell Culture Flask with Plug Seal Cap</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pierce&#8482; Protein L Plus Agarose</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>#20520</td>
			<td>2 ml, crosslinked 6% beaded agarose (CL-6B), binding capacity: 10 to 20 mg IgG</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4-20% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>456-1094</td>
			<td>10-well, 50 &#181;l, for use with Mini-PROTEAN electrophoresis cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immobilon-P Membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td>PVDF, 0.45 &#181;m, 26.5 cm x 3.75 m roll</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-Polysialic Acid-NCAM Antibody, clone</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB5324</td>
			<td>50 microliters, Host: mouse, monoclonal IgM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">XT sample buffer (Western blot)</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>#1610791</td>
			<td>10 ml, 4 x premixed protein sample buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-mercaptoethanol</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>#1610710</td>
			<td>25 ml, 98 % pure, 14.2 M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Endoneuraminidase-N (Endo-N)</td>
			<td>ABC Scientific</td>
			<td>ABC0020</td>
			<td>50 microliters, 200 &#181;g/ml, 3500 U/mg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">25 mm glass coverslips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-102</td>
			<td>Circles No. 1; Thickness: 0.13 to 0.17mm; Size: 25mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES buffer solution</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15630-080</td>
			<td>100 ml, 1M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hanks&#39; Balanced Salt Solution 1X (HBSS)</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>MT-21-022-CV</td>
			<td>500 ml, without Calcium, Magnesium, Phenol Red</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Papain</td>
			<td>Worthington Biochemical Cooperation</td>
			<td>LS003119</td>
			<td>lyophilized powder, 100 mg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesiumsulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M-2643-500G</td>
			<td>powder, 500 g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>#25030-081</td>
			<td>100 ml, 200 mM&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

antibody binding specificity for kappa (v&#954;) light chain-containing human (igm) antibodies: polysialic acid (psa) attached to ncam as a case study

Antibodies of the IgM isotype are often neglected as potential therapeutics in human trials, animal models of human diseases as well as detecting agents in standard laboratory techniques. In contrast, several human IgMs demonstrated proof of efficacy in cancer models and models of CNS disorders including multiple sclerosis (MS) and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Reasons for their lack of consideration include difficulties to express, purify and stabilize IgM antibodies, challenge to identify (non-protein) antigens, low affinity binding and fundamental knowledge gaps in carbohydrate and lipid research. 
This manuscript uses HIgM12 as an example to provide a detailed protocol to detect antigens by Western blotting, immunoprecipitations and immunocytochemistry. HIgM12 targets polysialic acid (PSA) attached to the neural cell adhesion molecule (NCAM). Early postnatal mouse brain tissue from wild type (WT) and NCAM knockout (KO) mice lacking the three major central nervous system (CNS) splice variants NCAM180, 140 and 120 was used to evaluate the importance of NCAM for binding to HIgM12. Further enzymatic digestion of CNS tissue and cultured CNS cells using endoneuraminidases led us to identify PSA as the specific binding epitope for HIgM12.

סעיף זה ממחיש דוגמאות של התוצאות ניתן להשיג על ידי לימוד האדם IgM ספציפיים PSA-אנטיגנים של מערכת העצבים המרכזית. שימוש נוגדנים אנושיים IgM המכילים שרשרות אור ספציפיות Vκ במסגרות ביוכימיות ידי immunocytochemistry ניאון מוצג. HIgM12 immunoprecipitates אנטיגן שלה מ lysates מוח המוחין ופועל כסוכן גילוי (נוגדן ראשוני) ב כתמים מערביים. לא נוגדן אלוטיפ ולא חרוזים L agarose immunoprecipitate אנטיגן דומה, אשר מביא לידי ביטוי את הספציפיות של לנתץ (איור 1). כתמים מערביים באמצעות lysates CNS מעכברי WT ו NCAM KO להפגין את הספציפיות של HIgM12-קשירת PSA המכיל NCAM (איור 2 א). עיכול אנזימתי של רקמת מערכת עצבים מרכזית מעכברי WT באמצעות Endo-NF מזהה PSA מצורפת NCAM כמו epitope מחייב הספציפי HIgM12 (תרשים 2B). בשיטה שהותוותה לעיל, תרבויות microglial עכברוש IBA-1-החיובי של טוהר גבוה מתקבלות (איור 3). זמין מסחרי נוגדן אנטי PSA (שיבוט 2-2B) לא לתייג פני תא או ברכות PSA פנימיות קבוע permeabilized תאי microglial IBA-1-חיוביים על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. בקנה אחד עם מחקרים שפורסמו בעבר, שמדווח אין ביטוי על פני קרום התא של PSA-NCAM ב microglia 16,41 HIgM12 לא לתייג אנטיגנים פני התא ב microglia עכברוש מטוהרים. מעניין, תיוג HIgM12 של תוצאות microglia קבועים permeabilized בתוך תאיים, דפוס perinuclear כי אינו מוגבל אברונים ספציפי (איור 3). תוצאות הן בניגוד לאלה שהושגו באמצעות נוגדן אנטי PSA IgG (שיבוט 735) 26, אשר מטרות PSA-SynCAM ב microglia ברמה של Golgi 41. בניגוד microglia, HIgM12ותא A2B5 יעד אנטיגנים משטח בתרבויות OPC העכברוש מועשרות בתנאי תא חיים (איור 4). תרבויות OPC מכילים ~ 5% מזהם תאים microglial. איור 5 מדגים דפוס מכתים פני קרום התא כמעט זהה בין HIgM12 ואנטי-PSA מב (שיבוט 2-2B) האסטרוציטים GFAP חיובי (איור 5 א). תיוג Immunofluorescent של האסטרוציטים Endo-NF-מתעכל WT לעומת חיץ האסטרוציטים WT שטופלו שליטה באמצעות HIgM12 מדגים את הנוכחות של PSA astrocytic (איור 5). הנוכחות של האסטרוציטים PSA חיובי in vivo עדיין יש לקבל אישור. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54139/54139fig1.jpg" /> איור 1: HIgM12 מעשים כמו &quot;נפתח&quot; סוכן ב Immunoprecipitations Immunoprecipitations מ lysate המוח הכולל של עכברים שלושה חודשים ישנים באמצעות HIgM12, בקרת isotype אדם HIgM.חרוזים L 126 או agarose רק בתור &quot;לנתץ&quot; סוכנים. חלבוני eluted נוהלו כתמים מערביים עם ממברנות נחקרו נגד HIgM12. משקולות מולקולרית של חלבונים eluted מן חרוזים מצופים HIgM12 היו בטווח של 160 - 200 kDa בנוסף שרשרת כבדה IgMs (~ 65 - 73 KDA). נתון זה יש הבדל בין J. Neurochem. 15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54139/54139fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54139/54139fig2.jpg" /> איור 2: HIgM12 מטרות חומצת Polysialic (PSA) מחצית על NCAM. Homogenates מוח א &#39;מבית P7, P13, P16 ו P27 NCAM להסתכם עכברי KO ובקרות להמלטת הטרוזיגוטיים נוהלו כתמים מערביים עם ממברנות נחקרו נגד HIgM12, PSA ו- β-יקטין כמו טעינה מלאה. <strong&gt; B. 10 מיקרוגרם של lysate המוח עכבר בוגר WT ב NP40 1% ב- PBS, pH 6.5 טופלה endoneuraminidase N (Endo-N) (exo) נורמינידאז עם ייחוד פולימר חומצה polysialic α2-3 (Sialidase) או PBS לילה בשעה 37 ºC, לרוץ כמו כפילויות ב כתמים מערביים ומשש נגד HIgM12, PSA ו- β-יקטין כמו טעינה מלאה. נתון זה יש הבדל בין J. Neurochem. 15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54139/54139fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/54139/54139fig3.jpg" /> איור 3: בהעדר PSA על עכברוש Microglia משתקף בחוסר HIgM12 תיוג microglia עכברוש היו בתרבית למשך 48 שעות על coverslips זכוכית מצופה poly-D- ליזין ואו שכותרתו חי על קרח עם HIgM12 או לאחר קיבוע עם HIgM12 או אנטי. -PSA מב (שיבוט 2-2B). התאים היו triple שכותרתו עם microglia סמן IBA-1 (ירוק), HIgM12 / PSA (אדום) ו DAPI (כחול). תמונות להראות חוסר פני התא microglial מחייב שימוש HIgM12 (בשורה העליונה) וחוסר אנטי PSA מחייב (שיבוט 2-2B) אל פני התא וחנויות הפנימית microglia עכברוש הראשי (בשורה התחתונה). בהתבסס על מורפולוגיה בהעדר דו קוטביות של מכתים IBA-1, תא PSA החיובי הקטן (בשורה תחתונה) הוצע להיות OPC. בתאים קבוע, מכתים HIgM12 הביא לדפוס punctated, perinuclear כי לא הוגבל אברונים ספציפיים ונחשב הלא ספציפית מחייב (בשורה האמצעית). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54139/54139fig3large.jpg" target="_blank">נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/54139/54139fig4.jpg" /> איור 4: HIgM12 מטרות Cell Surface PSA-NCAM על עכברוש OPCs עכברוש OPCs ו microglia היו cultu.אדום עבור 4 ימים במדיום התפשטות על coverslips זכוכית מצופה poly-D- ליזין ומשולשים שכותרתו חי על קרח עם HIgM12 או A2B5 (ירוק), CD68 סמן מקרופאג / מונוציטים פנימי (שיבוט ED-1) (אדום) ו DAPI (כחול) . תמונות להראות אוכלוסיות תאים חיובית majorly עבור OPC סמן A2B5 (בשורה העליונה) ו HIgM12 (בשורה התחתונה) עם כמה microglia CD68 חיובי (~ 5%). בניגוד שלב ותמונות DAPI נוספו לחשוף שלמות התא מספרים סלולריים עבור כל האוכלוסייה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54139/54139fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/54139/54139fig5.jpg" /> איור 5: HIgM12 ו מב אנטי PSA שיתוף לסימון subpopulation astrocytic עכבר מעורבת גליה. א מאוס מעורבים ותאי גלייה מ WT ו NCAM להסתכם חיות KO המכילות האסטרוציטים, תאי שושלת oligodendrocyte ו מיקרוגרםליה היו בתרבית במשך 3 ימים ומסומן חי על קרח עם HIgM12 (ירוק), אנטי-PSA מב (שיבוט 2-2B) (אדום), ובהמשך עבור סמן astrocytic GFAP (סגול) ו DAPI (כחול). HIgM12 ו-PSA אנטי לחשוף דפוס מכתים זהה ווירטואלי על האסטרוציטים WT GFAP חיוביים, אך עדיין חסרי מחייב האסטרוציטים תרבותיים מעכברי KO NCAM. נתון זה יש הבדל בין J. Neurochem. 15. ב מעורבת גליה היו בתרבית זהה כמתואר תחת א והתייחסו לילה עם endoneuraminidase-NF (בתנאי בחביבות על ידי ד&quot;ר מרטינה Muehlenhoff) או שליטה PBS. תאים תויגו חי על קרח עם HIgM12 (ירוק) ובהמשך מוכתם עבור GFAP סמנים פנימי (אדום) ו DAPI (כחול). HIgM12 מטרות אנטיגנים פני תא על שליטת PBS שטופל תרבויות גליה מעורבות אבל לא endoneuraminidase-NF מטופלי גליה מעורבת. נתון זה יש הבדל בין 16 JNSCI. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54139/54139fig5large.jpg" target="_blank">Pl</a>להקל לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. כל התמונות צולמו בהגדלה 60X באמצעות אותן הגדרות מכשירות ומעובד באופן זהה. <img alt="שולחן 1" src="/files/ftp_upload/54139/54139table1.jpg" /> טבלה 1:. הצפת פתרון מתכונים <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54139/Table1.xls">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הטבלה.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> רקמת מערכת העצבים המרכזית </td><td> Endo-NF / PBS </td><td> חיץ תמוגה </td><td> נפח כולל </td></tr><tr><td> 1. עכבר WT </td><td> 67 מיקרוגרם (0.45 μl) </td><td> 2 μl (12 מיקרוגרם) Endo-NF </td><td> 7.55 μl </td><td> 10 μl </td></tr><tr><td> 2. עכבר WT </td><td> 67 מיקרוגרם (0.45 μl) </td><td> 2 μl PBS </td><td> 7.55 μl </td><td> 10 μl </td></tr><tr><td> 3. עכבר WT </td><td> 67 מיקרוגרם (0.45 μl) </td><td> לא PBS או Endo-NF </td><td> 9.55 μl </td><td> 10 μl </td></tr><tr><td> 4. NCAM KO העכבר </td><td> 67 מיקרוגרם (0.45 μl) </td><td> 2 μl (12 מיקרוגרם) Endo-NF </td><td> 7.55 μl </td><td> 10 μl </td></tr><tr><td> 5. NCAM KO העכבר </td><td> 67 מיקרוגרם (0.45 μl) </td><td> 2 μl PBS </td><td> 7.55 μl </td><td> 10 μl </td></tr><tr><td> 6. NCAM KO העכבר </td><td> 67 מיקרוגרם (0.45 μl) </td><td> לא PBS או Endo-NF </td><td> 9.55 μl </td><td> 10 μl </td></tr></tbody></table> טבלה 2: Endo-NF העיכול של רקמת מערכת העצבים המרכזית מ P7 WT ו NCAM KO עכברים.

Watch this Scientific Journal Video about Antibody Binding Specificity for Kappa VÃŽÂº Light Chain-containing Human IgM Antibodies: Polysialic Acid PSA Attached to NCAM as a Case Study at JoVE.com

Antibody Binding Specificity for Kappa VÃƒÅ½Ã‚Âº Light Chain-containing Human IgM Antibodies: Polysialic Acid PSA Attached to NCAM as a Case Study

We present a protocol to identify protein moieties containing antigens for human and mouse IgM antibodies with specific kappa (V&#954;) light chains. This protocol is not limited to IgM class antibodies but applies to all immunoglobulin isotypes that target their antigen with sufficiently high affinity during immunoprecipitations.

ספציפי כריכת נוגדן עבור קאפה (Vκ) שרשרת המכילה באור אנושי (IgM) נוגדנים: Polysialic החומצה (PSA) מצורפים NCAM כמקרה מבחן

Antibodies of the IgM isotype are often neglected as potential therapeutics in human trials, animal models of human diseases as well as detecting agents ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Antibody Binding Specificity for Kappa (V&#954;) Light Chain-containing Human (IgM) Antibodies: Polysialic Acid (PSA) Attached to NCAM as a Case Study

Recognition of Epidermal Transglutaminase by IgA and Tissue Transglutaminase 2 Antibodies in a Rare Case of Rhesus Dermatitis

Recognition of Epidermal Transglutaminase by IgA and Tissue Transglutaminase 2 Antibodies in a Rare Case of Rhesus Dermatitis

הכרה Transglutaminase עוריות על ידי IgA ו Transglutaminase רקמות 2 נוגדנים במקרה נדיר של רזוס דרמטיטיס

Tissue transglutaminase 2 (tTG2) is an intestinal digestive enzyme which deamidates already partially digested dietary gluten e.g. gliadin peptides. In ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

היכרות עם מתח שאר בחקר הדבקה חיידקית

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

<em&gt; במבחנה</em&gt; מודל ללמוד ההטרוגניות של בידול Macrophage אדם וקיטוב

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

שימוש<em&gt; Mellonella Galleria</em&gt; כאורגניזם מודל לחקר<em&gt; הלגיונלה pneumophila</em&gt; זיהום

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and ...

A Semi-automated Approach to Preparing Antibody Cocktails for Immunophenotypic Analysis of Human Peripheral Blood

גישה אוטומטית-למחצה הכנת קוקטיילי נוגדן עבור ניתוח Immunophenotypic של אדם דם היקפי

Immunophenotyping of peripheral blood by flow cytometry determines changes in the frequency and activation status of peripheral leukocytes during disease ...

A Miniaturized Glycan Microarray Assay for Assessing Avidity and Specificity of Influenza A Virus Hemagglutinins

Assay Microarray מיניאטורי glycan להערכת הלהיטות וספציפיות של Hemagglutinins וירוס שפעת A

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the ...

Developing a Salivary Antibody Multiplex Immunoassay to Measure Human Exposure to Environmental Pathogens

פיתוח Immunoassay רוק נוגדן Multiplex כדי לאמוד את חשיפת אדם לפתוגנים הסביבה

The etiology and impacts of human exposure to environmental pathogens are of major concern worldwide and, thus, the ability to assess exposure and ...

The Isolation, Differentiation, and Quantification of Human Antibody-secreting B Cells from Blood: ELISpot as a Functional Readout of Humoral Immunity

הבידוד, בידול, וכימות של האדם נוגדן מפריש תאים B מדם: ELISPOT בתור Readout פונקציונלי של חסינות הלחות

The hallmark of humoral immunity is to generate functional ASCs, which synthesize and secrete Abs specific to an antigen (Ag), such as a pathogen, and are ...

In Vitro Methods for Comparing Target Binding and CDC Induction Between Therapeutic Antibodies: Applications in Biosimilarity Analysis

In Vitro Methods for Comparing Target Binding and CDC Induction Between Therapeutic Antibodies: Applications in Biosimilarity Analysis

שיטות ויטרו להשוואת יעד מחייב CDC אינדוקציה בין נוגדנים טיפוליים: יישומים ניתוח Biosimilarity

Therapeutic monoclonal antibodies (mAbs) are relevant to the treatment of different pathologies, including cancers. The development of biosimilar mAbs by ...

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to A(H3N2) Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to AH3N2 Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

מבחני מדידת שפעת בנטרול תגובות נוגדנים וירוסים A(H3N2) סרה האנושי על-ידי Microneutralization באמצעות תאים MDCK-SIAT1

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for ...