Name: detection of rna-binding proteins by in vitro rna pull-down in adipocyte culture
Uploaded: 2016-07-22T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture at JoVE.com

Diese Arbeit wurde von Singapur NRF Gemeinschaft (NRF-2011NRF-NRFF001-025) sowie CBRG (NMRC / CBRG / 0070/2014) finanziert.

HINWEIS: Die RNA von Interesse im Rahmen dieser Studie ist ein Fragment von AR 3&#39;UTR. 1. Herstellung von Biotin-markierter RNA <ol><li> Um die RNA zu erhalten, T7-AR-Oligos durch PCR, gefolgt von in vitro Transkription unter Verwendung eines kommerziellen Kits und nach den Anweisungen des Herstellers 11 amplifizieren. HINWEIS: T7-AR-F und T7-AR-R: Primer für die PCR sind in Tabelle 4 aufgeführt. </li><li> Für nicht-spezifische Bindungskont...

<ol>
	<li>Huot, M. &. #. 2. 0. 1. ;., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sam68+STAR+RNA-binding+protein+regulates+mTOR+alternative+splicing+during+adipogenesis.">The Sam68 STAR RNA-binding protein regulates mTOR alternative splicing during adipogenesis.</a> Mol Cell. 46 (2), 187-199 (2012).</li><li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+noncoding+RNAs+regulate+adipogenesis.">Long noncoding RNAs regulate adipogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (9), 3387-3392 (2013).</li><li>Engreitz, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Xist+lncRNA+exploits+three-dimensional+genome+architecture+to+spread+across+the+X-chromosome.">The Xist lncRNA exploits three-dimensional genome architecture to spread across the X-chromosome.</a> Science. 341 (6147), 1237973 (2013).</li><li>Zhao, X. Y., Li, S., Wang, G. X., Yu, Q., Lin, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+long+noncoding+RNA+transcriptional+regulatory+circuit+drives+thermogenic+adipocyte+differentiation.">A long noncoding RNA transcriptional regulatory circuit drives thermogenic adipocyte differentiation.</a> Mol Cell. 55, 372-382 (2014).</li><li>Alvarez-Dominguez, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+reconstruction+of+adipose+tissue+transcriptomes+reveals+long+non-coding+RNA+regulators+of+brown+adipocyte+development.">De novo reconstruction of adipose tissue transcriptomes reveals long non-coding RNA regulators of brown adipocyte development.</a> Cell Metab. 21, 764-776 (2015).</li><li>Adams, D. J., Beveridge, D. J., van der Weyden, L., Mangs, H., Leedman, P. J., Morris, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HADHB,+HuR,+and+CP1+bind+to+the+distal+3-untranslated+region+of+human+renin+mRNA+and+differentially+modulate+renin+expression.">HADHB, HuR, and CP1 bind to the distal 3-untranslated region of human renin mRNA and differentially modulate renin expression.</a> J Biol Chem. 278 (45), 44894-44903 (2003).</li><li>Yeap, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+binding+of+HuR+and+poly(C)-binding+protein+to+a+conserved+UC-rich+motif+within+the+3&#180;+untranslated+region+of+the+androgen+receptor+messenger+RNA.">Novel binding of HuR and poly(C)-binding protein to a conserved UC-rich motif within the 3&#180; untranslated region of the androgen receptor messenger RNA.</a> J Biol Chem. 277, 27183-27192 (2002).</li><li>K&#246;nig, J., Zarnack, K., Luscombe, N. M., Ule, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-RNA+interactions:+new+genomic+technologies+and+perspectives.">Protein-RNA interactions: new genomic technologies and perspectives.</a> Nat Rev Genet. 13, 77-83 (2012).</li><li>Ferr&#232;, F., Colantoni, A., Helmer-Citterich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revealing+protein-lncRNA+interaction.">Revealing protein-lncRNA interaction.</a> Briefings in Bioinformatics. , 1-11 (2015).</li><li>McHugh, C. A., Russell, P., Guttman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+comprehensive+experimental+identification+of+RNA-protein+interactions.">Methods for comprehensive experimental identification of RNA-protein interactions.</a> Genome Biol. 15 (1), 203 (2014).</li><li>Lee, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AU-rich+element-binding+protein+negatively+regulates+CCAAT+enhancer+binding+protein+mRNA+stability+during+long+term+synaptic+plasticity+in+Aplysia.">AU-rich element-binding protein negatively regulates CCAAT enhancer binding protein mRNA stability during long term synaptic plasticity in Aplysia.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (38), 15520-15525 (2012).</li><li>Hermann, M., Cermak, T., Voytas, D. F., Pelczar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+genome+engineering+using+designer+nucleases.">Mouse genome engineering using designer nucleases.</a> J Vis Exp. (86), (2014).</li><li>Tsai, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+Noncoding+RNA+as+Modular+Scaffold+of+Histone+Modification+Complexes.">Long Noncoding RNA as Modular Scaffold of Histone Modification Complexes.</a> Science. 329 (5992), 689-693 (2010).</li><li>Wan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Landscape+and+variation+of+RNA+secondary+structure+across+the+human+transcriptome.">Landscape and variation of RNA secondary structure across the human transcriptome.</a> Nature. 505, 706-709 (2014).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+mRNA+binding+proteins+that+regulate+the+stability+of+LDL+receptor+mRNA+through+AU+rich+elements.">Identification of mRNA binding proteins that regulate the stability of LDL receptor mRNA through AU rich elements.</a> J Lipid Res. 50 (5), 820-831 (2009).</li><li>McHugh, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Xist+lncRNA+interacts+directly+with+SHARP+to+silence+transcription+through+HDAC3.">The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3.</a> Nature. 521 (7551), 232-236 (2015).</li><li>Chu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+Discovery+of+Xist+RNA+Binding+Proteins.">Systematic Discovery of Xist RNA Binding Proteins.</a> Cell. 161 (2), 404-416 (2015).</li><li>Chu, C., Spitale, R. C., Chang, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technologies+to+probe+functions+and+mechanisms+of+long+noncoding+RNAs.">Technologies to probe functions and mechanisms of long noncoding RNAs.</a> Nat Struct Mol Biol. 22 (1), 29-35 (2015).</li><li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+identification+of+Polycomb-associated+RNAs+by+RIP-seq.">Genome-wide identification of Polycomb-associated RNAs by RIP-seq.</a> Mol Cell. 40 (6), 939-953 (2010).</li></ol>

lncRNAs und RBPs haben eine lebenswichtige Rolle in Gesundheit und Krankheit, aber die molekularen Mechanismen dieser Moleküle schlecht verstanden werden. Identifizierung von Proteinen, die mit lncRNA Molekülen interagieren ist ein wichtiger Schritt in Richtung auf die Regulationsmechanismen aufzuklären. Anreicherung von RBPs durch die RNA-Pull-Down-Assay-System wird in-Lösung auf Basis von Erfassung von komplexen interagieren, so dass Proteine, die aus einem Zelllysat selektiv extrahiert werden können biotinyliert...

A correction to the author list was made to: <a href="http://www.jove.com/video/54207/detection-rna-binding-proteins-vitro-rna-pull-down-adipocyte">Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture</a>.
The author list has been updated from:
Qianfan Bai1*, Zhiqiang Bai1*, Lei Sun1,2
1Cardiovascular and Metabolic Disorders Program, Duke-NUS Medical School
2Institute of Molecular and Cell Biology, Singapore
*These authors contributed equally
to:
Qianfan Bai1*, Zhiqiang Bai1*, Shaohai Xu3, Lei Sun1,2
1Cardiovascular and Metabolic Disorders Program, Duke-NUS Medical School
2Institute of Molecular and Cell Biology, Singapore
3Division of Bioengineering, School of Chemical &#38; Biomedical Engineering, Nanyang Technological University
*These authors contributed equally

A correction to the author list was made to: Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture.

Erratum: Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

RBPs sind Proteine, die bei der Bildung von RNA-Protein-Komplexe in Zellen zur Doppel- oder Einzelstrang-RNA binden und zu beteiligen. RBPs kann eine Vielzahl von RNA-Spezies binden, einschließlich mRNA und lange nichtkodierende RNAs (lncRNAs) und deren Einfluss auf posttranskriptionales Ebenen ausüben. Beide RBPs und lncRNAs sind , sich als neue Aufsichtsbehörden bei adipösen Entwicklung und Funktion 1,2,3. Um zu verstehen, den Mechanismus der RBP- und lncRNA vermittelte Regulation der zellulären Wege, ist es oft notwendig ist, die Wechselwirkung zwischen einem spezifischen RNA-Moleküls und eines oder mehrere RBPs zu erfassen, und manchmal das gesamte Spektrum von Proteinpartner einer RNA zu identifizieren, Transkript. Jedoch kann der Versuch aufgrund des hohen Gehaltes an Lipiden in Adipozyten schwierig sein. Die RNA - Pull-Down - Protokoll hier beschrieben werden eingesetzt 4,5 die Proteinpartner eines spezifischen RNA aus den Adipozyten Lysaten von Primärkulturen zu erhalten. Rationale für dieses Protocol wird wie folgt zusammengefasst. Ein RNA - Köder in vitro aus einem DNA - Template transkribiert ist, Biotin-markierte und konjugiert an Streptavidin-beschichteten magnetischen Kügelchen 4. Die RNA Köder wird mit Zelllysaten inkubiert für die Bildung von RNA-Protein-Komplexen zu ermöglichen, die anschließend gezogen werden, auf einem Magnettreten. Mehr die RNA - Pull-Down - Protokoll unten beschrieben speziell, verwenden Sie ein RNA - Fragment von AR 3&#39;UTR als Köder HuR Protein, ein universell ausgedrückt RBP gebunden 3&#39;UTR von mRNAs 6,7, von theadipocytelysate der Primärkultur zu erhalten. Um die Bindungsspezifität dieses Assays testen, wurde eine nicht-relevanten RNAas auch blank Streptavidin-Kügelchen als Kontrolle eingeschlossen. Dieses Protokoll ist kompatibel mit Western - Blot oder Massenspektrometrie (MS) die Erfassung eines bestimmten RBP zu bestätigen oder das gesamte Repertoire der erfassten RBPs bzw. 8 zu identifizieren. Verschiedene Techniken sind verfügbar RNA-Protein-Wechselwirkung zu untersuchens. Offenbaren RNAs gebunden durch eine gegebene RBP, RIP (RNA Immunpräzipitation) und CLIP (UV-Vernetzung und Immunpräzipitation) angewendet werden kann. Im Gegensatz dazu kann zu identifizieren angewendet werden Proteinpartner eines bestimmten RNA, RNA Pull-Down-Chirp (Chromatin Isolierung von RNA-Reinigung), CHART (Capture-Hybridisierungsanalyse von RNA-Targets) und RAP (RNA-Antisense-Reinigung). Im Vergleich zu den späteren, RNA-Pull-down-Technik dauert weniger Aufwand einzurichten. Es kann zu erfassen Proteine ​​in vitro verwendet werden , und in vivo. Die in - vivo - Ansatz von RNA - Pull-down, die technisch anspruchsvoller als seine in - vitro - Gegenstück ist, RNA-Protein - Interaktionen bewahrt durch in Zellen Vernetzung erfasst Aptamer-markierte RNAs von Interesse von Zellen und erkennt anschließend gebunden RBPs. RNA - Pull-down kann zu bereichern niedrig reichlich RBPs verwendet werden, und die RNA-Protein - Komplexe zu isolieren und zu identifizieren , die bei der Kontrolle der zellulären Regulation 9,10 diversen funktionalen Rollen haben </sup&gt;.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="857">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Major materials used in this study.</td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:72px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEGAscript kit</td>
			<td>&#160;Ambion</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Biotin-14-CTP&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NucAway spin columns&#160;</td>
			<td>Ambion</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dynabeads M-280 Streptavidin&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HuR (3A2) mouse monoclonal antibody (sc-5261)&#160;</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat anti-mouse IgG-HRP(sc-2005)&#160;</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hypure Molecular Biology Grade Water (nuclease-free)&#160;</td>
			<td>HyClone</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate Buffer Saline (1&#215;PBS)</td>
			<td>&#160;HyClone</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNase inhibitor&#160;</td>
			<td>Bioline</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protease inhibitor&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pfu Turbo DNA polymerase&#160;</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TRIsure</td>
			<td>&#160;Bioline</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Major equipment used in this study.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sorvall Legend Micro 21R centrifuge&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sorvall Legend X1R centrifuge&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bio-Rad T100 thermal cycler&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nanodrop 2000&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BOECO rotator Multi Bio RS-24&#160;</td>
			<td>BOECO,Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protein gel electrophoresis and blotting apparatus&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DynaMag-2 magnet&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of rna-binding proteins by in vitro rna pull-down in adipocyte culture

RNA-bindende Proteine ​​(RBPs) entstehen als regulatorischer Ebene in der Entwicklung und Funktion von Fettgewebe. RBPs spielen eine wichtige Rolle bei der Genregulation bei posttranskritionelle Ebenen durch die Stabilität und Translationseffizienz von Ziel-mRNAs beeinflussen. RNA pull-down-Technik weit verbreitet RNA-Protein-Wechselwirkung zu untersuchen ist, die notwendig ist, den Mechanismus zugrunde liegende RBPs &#39;sowie lange nicht-kodierenden RNAs&#39; (lncRNAs) Funktion aufzuklären. Jedoch stellt die hohe Lipid Fülle in Adipozyten eine technische Herausforderung, dieses Experiment in der Durchführung. Hier ist eine detaillierte RNA Pull-Down-Protokoll wird für die primäre Adipozyten Kultur optimiert. Ein RNA-Fragment von Androgen-Rezeptors (AR) 3 &#39;untranslatierten Region (3&#39;-UTR), die eine Adenylat-uridylat reichen elementwas verwendet als ein Beispiel enthält, zu zeigen, wie ihre RBP Partner HuR Protein von Adipozyten lystate abzurufen. Das hier beschriebene Verfahren kann um die Wechselwirkungen zu detektieren angewendet werden zwischenRBPs und nicht-kodierenden RNAs sowie zwischen RBPs und kodierenden RNAs.

In dieser Demo-Experiment wurde ein AR-RNA-Fragment als Köder verwendet, um seine bindende Protein HuR zu erfassen. Sowohl ein FL RNA Köder, die HuR Protein und ein Aliquot von unkonjugiertem blank Streptavidinbeads dienten als negative Kontrollen nicht relevant ist. RNA-Protein-Wechselwirkungen können entweder im Kern oder Cytoplasma auftreten, und das Pull-Down-Protokoll kann entweder insgesamt oder fraktionierte (Kern- oder cytoplasmatische) Zelllysate angewendet werden. Analyse vo...

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Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

Ein RNA-Pull-down-Protokoll wird für den Nachweis von Interaktionen zwischen RNA-Bindeproteine ​​(RBPs) und nicht-codierende sowie kodierenden RNAs hier optimiert. Ein RNA-Fragment von Androgen-Rezeptor (AR) wurde als Beispiel verwendet, zu zeigen, wie ihre RBP aus lystate primärer braunen Fettzellen zu erhalten.

Nachweis von RNA-bindenden Proteinen durch<em&gt; In Vitro</em&gt; RNA Pull-down in Adipocyte Kultur

RNA-binding proteins (RBPs) are emerging as a regulatory layer in the development and function of adipose. RBPs play a key role in the gene expression ...

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