Name: detection of rna-binding proteins by in vitro rna pull-down in adipocyte culture
Uploaded: 2016-07-22T15:00:00
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この作品は、シンガポールNRFの交わり（NRF-2011NRF-NRFF001-025）ならびにCBRG（NMRC / CBRGは/ 0070/2014）によって賄われていました。

注：この研究の文脈で目的のRNAは、AR 3&#39;UTRの断片です。 ビオチン標識RNAの調製<ol><li> RNAを得るために、市販のキットを用い、製造業者の指示11を以下のインビトロ転写に続いて、PCRによってT7-AR-オリゴを増幅します。 注：PCR用プライマーは、表4に記載されています：T7-AR-FおよびT7-AR-R。 </li><li>非特異的結合を制御するために、 イ?...

<ol>
	<li>Huot, M. &. #. 2. 0. 1. ;., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sam68+STAR+RNA-binding+protein+regulates+mTOR+alternative+splicing+during+adipogenesis.">The Sam68 STAR RNA-binding protein regulates mTOR alternative splicing during adipogenesis.</a> Mol Cell. 46 (2), 187-199 (2012).</li><li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+noncoding+RNAs+regulate+adipogenesis.">Long noncoding RNAs regulate adipogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (9), 3387-3392 (2013).</li><li>Engreitz, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Xist+lncRNA+exploits+three-dimensional+genome+architecture+to+spread+across+the+X-chromosome.">The Xist lncRNA exploits three-dimensional genome architecture to spread across the X-chromosome.</a> Science. 341 (6147), 1237973 (2013).</li><li>Zhao, X. Y., Li, S., Wang, G. X., Yu, Q., Lin, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+long+noncoding+RNA+transcriptional+regulatory+circuit+drives+thermogenic+adipocyte+differentiation.">A long noncoding RNA transcriptional regulatory circuit drives thermogenic adipocyte differentiation.</a> Mol Cell. 55, 372-382 (2014).</li><li>Alvarez-Dominguez, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+reconstruction+of+adipose+tissue+transcriptomes+reveals+long+non-coding+RNA+regulators+of+brown+adipocyte+development.">De novo reconstruction of adipose tissue transcriptomes reveals long non-coding RNA regulators of brown adipocyte development.</a> Cell Metab. 21, 764-776 (2015).</li><li>Adams, D. J., Beveridge, D. J., van der Weyden, L., Mangs, H., Leedman, P. J., Morris, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HADHB,+HuR,+and+CP1+bind+to+the+distal+3-untranslated+region+of+human+renin+mRNA+and+differentially+modulate+renin+expression.">HADHB, HuR, and CP1 bind to the distal 3-untranslated region of human renin mRNA and differentially modulate renin expression.</a> J Biol Chem. 278 (45), 44894-44903 (2003).</li><li>Yeap, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+binding+of+HuR+and+poly(C)-binding+protein+to+a+conserved+UC-rich+motif+within+the+3&#180;+untranslated+region+of+the+androgen+receptor+messenger+RNA.">Novel binding of HuR and poly(C)-binding protein to a conserved UC-rich motif within the 3&#180; untranslated region of the androgen receptor messenger RNA.</a> J Biol Chem. 277, 27183-27192 (2002).</li><li>K&#246;nig, J., Zarnack, K., Luscombe, N. M., Ule, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-RNA+interactions:+new+genomic+technologies+and+perspectives.">Protein-RNA interactions: new genomic technologies and perspectives.</a> Nat Rev Genet. 13, 77-83 (2012).</li><li>Ferr&#232;, F., Colantoni, A., Helmer-Citterich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revealing+protein-lncRNA+interaction.">Revealing protein-lncRNA interaction.</a> Briefings in Bioinformatics. , 1-11 (2015).</li><li>McHugh, C. A., Russell, P., Guttman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+comprehensive+experimental+identification+of+RNA-protein+interactions.">Methods for comprehensive experimental identification of RNA-protein interactions.</a> Genome Biol. 15 (1), 203 (2014).</li><li>Lee, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AU-rich+element-binding+protein+negatively+regulates+CCAAT+enhancer+binding+protein+mRNA+stability+during+long+term+synaptic+plasticity+in+Aplysia.">AU-rich element-binding protein negatively regulates CCAAT enhancer binding protein mRNA stability during long term synaptic plasticity in Aplysia.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (38), 15520-15525 (2012).</li><li>Hermann, M., Cermak, T., Voytas, D. F., Pelczar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+genome+engineering+using+designer+nucleases.">Mouse genome engineering using designer nucleases.</a> J Vis Exp. (86), (2014).</li><li>Tsai, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+Noncoding+RNA+as+Modular+Scaffold+of+Histone+Modification+Complexes.">Long Noncoding RNA as Modular Scaffold of Histone Modification Complexes.</a> Science. 329 (5992), 689-693 (2010).</li><li>Wan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Landscape+and+variation+of+RNA+secondary+structure+across+the+human+transcriptome.">Landscape and variation of RNA secondary structure across the human transcriptome.</a> Nature. 505, 706-709 (2014).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+mRNA+binding+proteins+that+regulate+the+stability+of+LDL+receptor+mRNA+through+AU+rich+elements.">Identification of mRNA binding proteins that regulate the stability of LDL receptor mRNA through AU rich elements.</a> J Lipid Res. 50 (5), 820-831 (2009).</li><li>McHugh, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Xist+lncRNA+interacts+directly+with+SHARP+to+silence+transcription+through+HDAC3.">The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3.</a> Nature. 521 (7551), 232-236 (2015).</li><li>Chu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+Discovery+of+Xist+RNA+Binding+Proteins.">Systematic Discovery of Xist RNA Binding Proteins.</a> Cell. 161 (2), 404-416 (2015).</li><li>Chu, C., Spitale, R. C., Chang, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technologies+to+probe+functions+and+mechanisms+of+long+noncoding+RNAs.">Technologies to probe functions and mechanisms of long noncoding RNAs.</a> Nat Struct Mol Biol. 22 (1), 29-35 (2015).</li><li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+identification+of+Polycomb-associated+RNAs+by+RIP-seq.">Genome-wide identification of Polycomb-associated RNAs by RIP-seq.</a> Mol Cell. 40 (6), 939-953 (2010).</li></ol>

lncRNAsとRBPsが健康と病気に重要な役割を持っている、しかし、これらの分子の分子メカニズムはあまり理解されていません。 lncRNA分子と相互作用するタンパク質の同定は、調節機構の解明に向けた重要なステップです。 RNAプルダウンアッセイシステムによってRBPsの濃縮は、溶液内の細胞溶解物からのタンパク質は選択的にストレプトアビジン磁気ビーズに結合したビオチン化RNAベイトを用?...

A correction to the author list was made to: <a href="http://www.jove.com/video/54207/detection-rna-binding-proteins-vitro-rna-pull-down-adipocyte">Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture</a>.
The author list has been updated from:
Qianfan Bai1*, Zhiqiang Bai1*, Lei Sun1,2
1Cardiovascular and Metabolic Disorders Program, Duke-NUS Medical School
2Institute of Molecular and Cell Biology, Singapore
*These authors contributed equally
to:
Qianfan Bai1*, Zhiqiang Bai1*, Shaohai Xu3, Lei Sun1,2
1Cardiovascular and Metabolic Disorders Program, Duke-NUS Medical School
2Institute of Molecular and Cell Biology, Singapore
3Division of Bioengineering, School of Chemical &#38; Biomedical Engineering, Nanyang Technological University
*These authors contributed equally

A correction to the author list was made to: Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture.

Erratum: Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

RBPsは、細胞内で二本鎖または一本鎖RNAに結合し、RNA-タンパク質複合体の形成に関与するタンパク質です。 RBPsは、mRNAと長い非コードRNA（lncRNAs）を含むRNA種の多様性を結合し、転写後のレベルで自分の影響力を発揮することができます。 RBPsとlncRNAsの両方が脂肪の発達と機能1,2,3における新規調節因子として浮上しています。細胞経路のRBP-とlncRNA媒介調節のメカニズムを理解するためには、RNAのタンパク質パートナーの完全なスペクトルを識別するために、時々、特定のRNA分子および1つまたはいくつかのRBPsの間の相互作用を検出することがしばしば必要であり、かつ転写産物。しかし、実験が原因脂肪細胞中の脂質の含有量が高いに挑戦することができます。ここで説明するRNAプルダウンプロトコルは、初代培養4,5の脂肪細胞溶解物から特定 ​​のRNAのタンパク質パートナーを取得するために使用することができます。 このプロトの根拠次のようにcolが要約されています。 RNAの餌は、DNAテンプレートから転写された試験管 、ビオチン標識したストレプトアビジンをコーティングした磁気ビーズ4に共役です 。 RNAの餌は、その後、磁気スタンド上にプルダウンされているRNA-タンパク質複合体の形成を可能にするために、細胞溶解物と共にインキュベートします。具体的には、RNAプルダウンプロトコルは、以下に記載のHuRタンパク質、初代培養のtheadipocytelysateから、mRNAを6,7の3&#39;UTRに結合された普遍的に発現RBPを取得するために餌としてAR 3&#39;UTRからRNA断片を使用します。このアッセイの結合特異性を試験するために、非関連RNAasだけでなく、空白のストレプトアビジンビーズを対照として含まれています。このプロトコルは、特定のRBPのキャプチャを確認したり、撮影しRBPs、それぞれ8の完全なレパートリーを識別するために、ウエスタンブロッティングまたは質量分析法（MS）と互換性があります。 いくつかの技術は、RNA-タンパク質相互作用を研究するために利用可能です秒。所与RBPによって拘束RNAを明らかにするために、RIP（RNA免疫沈降）及びCLIP（UV架橋及び免疫沈降）を適用することができます。対照的に、与えられたRNA、RNAプルダウン、チャープ（RNA精製によってクロマチン分離）、グラフ（RNA標的の捕獲ハイブリダイゼーション分析）のタンパク質パートナーを識別し、RAP（RNAアンチセンス精製）を適用することができます。それ以降のものと比較して、RNAプルダウン技術が設定する労力がかかります。 in vitroおよびin vivoでタンパク質を捕捉するために使用することができます。技術的に困難なそのin vitro対応物よりもRNAプルダウンのインビボでのアプローチは、細胞内で架橋することによりRNA-タンパク質相互作用を維持し、細胞からの目的のアプタマータグ付きRNAを捕捉し、その後、結合したRBPsを検出します。 RNAプルダウンは低豊富RBPsを濃縮するために使用することができ、細胞調節9,10を制御することで、多様な機能的役割を有するRNA-タンパク質複合体を単離し、同定するために</s&gt;アップ。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="857">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Major materials used in this study.</td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:72px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEGAscript kit</td>
			<td>&#160;Ambion</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Biotin-14-CTP&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NucAway spin columns&#160;</td>
			<td>Ambion</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dynabeads M-280 Streptavidin&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HuR (3A2) mouse monoclonal antibody (sc-5261)&#160;</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat anti-mouse IgG-HRP(sc-2005)&#160;</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hypure Molecular Biology Grade Water (nuclease-free)&#160;</td>
			<td>HyClone</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate Buffer Saline (1&#215;PBS)</td>
			<td>&#160;HyClone</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNase inhibitor&#160;</td>
			<td>Bioline</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protease inhibitor&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pfu Turbo DNA polymerase&#160;</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TRIsure</td>
			<td>&#160;Bioline</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Major equipment used in this study.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sorvall Legend Micro 21R centrifuge&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sorvall Legend X1R centrifuge&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bio-Rad T100 thermal cycler&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nanodrop 2000&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BOECO rotator Multi Bio RS-24&#160;</td>
			<td>BOECO,Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protein gel electrophoresis and blotting apparatus&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DynaMag-2 magnet&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of rna-binding proteins by in vitro rna pull-down in adipocyte culture

RNA結合タンパク質（RBPs）は、脂肪の発達と機能における規制層として浮上しています。 RBPsは、標的mRNAの安定性および翻訳効率に影響を与えることにより、転写後レベルでの遺伝子発現の調節において重要な役割を果たす。 RNAプルダウン技術が広く機構RBP​​s &#39;ならびに長い非コードRNA」（lncRNAs）機能の根底に解明する必要があるRNA-タンパク質相互作用を研究するために使用されています。しかし、脂肪細胞における高脂質存在量は、この実験を行う際の技術的な課題を提起します。ここで詳細なRNAプルダウンプロトコールは、一次脂肪細胞の培養のために最適化されています。脂肪細胞lystateからアデニル酸ウリジル酸が豊富な、そのRBPパートナーを取得する方法を示すために例として使用elementwas、HuRのタンパク質を含むアンドロゲン受容体の（AR）3 &#39;非翻訳領域（3&#39;UTR）からのRNA断片。ここで説明する方法は、間の相互作用を検出するために適用することができますRBPsおよび非コードRNA、ならびに間RBPsとコーディングRNA。

このデモ実験において、AR RNA断片は、結合タンパク質HuRのを捕捉するために餌として使用しました。両方のHuRタンパク質に非関連であるFLのRNAの餌、およびコンジュゲートされていない空白のストレプトアビジンビーズのアリコートを陰性対照としました。 RNA-タンパク質相互作用は、核または細胞質のいずれかで発生することができ、このプルダウンプロトコールは...

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Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

RNAプルダウンプロトコルは、RNA結合タンパク質（RBPs）および非コードだけでなく、コーディングRNA間の相互作用の検出のためにここに最適化されています。アンドロゲン受容体（AR）からのRNA断片は、一次褐色脂肪細胞のlystateから、そのRBPを取得する方法を示すために例として使用しました。

RNA結合タンパク質の検出によって、<em&gt;インビトロ</em脂肪細胞培養における&gt; RNAプルダウン

RNA-binding proteins (RBPs) are emerging as a regulatory layer in the development and function of adipose. RBPs play a key role in the gene expression ...

Research

JoVE Journal

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