Name: detection of rna-binding proteins by in vitro rna pull-down in adipocyte culture
Uploaded: 2016-07-22T15:00:00
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Este trabalho foi financiado por Singapura NRF comunhão (NRF-2011NRF-NRFF001-025), bem como CBRG (NMRC / CBRG / 0070/2014).

NOTA: O ARN de interesse no contexto do presente estudo é um fragmento da 3&#39;UTR AR. 1. Preparação de ARN-biotina marcado <ol><li> Para obter o RNA, amplificar T7-AR-oligo por PCR, seguida por transcrição in vitro utilizando um estojo comercial e seguindo as instruções do fabricante 11. NOTA: Os primers para PCR estão listadas na Tabela 4: T7-AR-F e T7-AR-R. </li><li> Para o controlo de ligação não específico, amplificar uma sequê...

<ol>
	<li>Huot, M. &. #. 2. 0. 1. ;., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sam68+STAR+RNA-binding+protein+regulates+mTOR+alternative+splicing+during+adipogenesis.">The Sam68 STAR RNA-binding protein regulates mTOR alternative splicing during adipogenesis.</a> Mol Cell. 46 (2), 187-199 (2012).</li><li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+noncoding+RNAs+regulate+adipogenesis.">Long noncoding RNAs regulate adipogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (9), 3387-3392 (2013).</li><li>Engreitz, J. 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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+reconstruction+of+adipose+tissue+transcriptomes+reveals+long+non-coding+RNA+regulators+of+brown+adipocyte+development.">De novo reconstruction of adipose tissue transcriptomes reveals long non-coding RNA regulators of brown adipocyte development.</a> Cell Metab. 21, 764-776 (2015).</li><li>Adams, D. J., Beveridge, D. J., van der Weyden, L., Mangs, H., Leedman, P. J., Morris, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HADHB,+HuR,+and+CP1+bind+to+the+distal+3-untranslated+region+of+human+renin+mRNA+and+differentially+modulate+renin+expression.">HADHB, HuR, and CP1 bind to the distal 3-untranslated region of human renin mRNA and differentially modulate renin expression.</a> J Biol Chem. 278 (45), 44894-44903 (2003).</li><li>Yeap, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+binding+of+HuR+and+poly(C)-binding+protein+to+a+conserved+UC-rich+motif+within+the+3&#180;+untranslated+region+of+the+androgen+receptor+messenger+RNA.">Novel binding of HuR and poly(C)-binding protein to a conserved UC-rich motif within the 3&#180; untranslated region of the androgen receptor messenger RNA.</a> J Biol Chem. 277, 27183-27192 (2002).</li><li>K&#246;nig, J., Zarnack, K., Luscombe, N. 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A., Russell, P., Guttman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+comprehensive+experimental+identification+of+RNA-protein+interactions.">Methods for comprehensive experimental identification of RNA-protein interactions.</a> Genome Biol. 15 (1), 203 (2014).</li><li>Lee, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AU-rich+element-binding+protein+negatively+regulates+CCAAT+enhancer+binding+protein+mRNA+stability+during+long+term+synaptic+plasticity+in+Aplysia.">AU-rich element-binding protein negatively regulates CCAAT enhancer binding protein mRNA stability during long term synaptic plasticity in Aplysia.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (38), 15520-15525 (2012).</li><li>Hermann, M., Cermak, T., Voytas, D. F., Pelczar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+genome+engineering+using+designer+nucleases.">Mouse genome engineering using designer nucleases.</a> J Vis Exp. (86), (2014).</li><li>Tsai, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+Noncoding+RNA+as+Modular+Scaffold+of+Histone+Modification+Complexes.">Long Noncoding RNA as Modular Scaffold of Histone Modification Complexes.</a> Science. 329 (5992), 689-693 (2010).</li><li>Wan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Landscape+and+variation+of+RNA+secondary+structure+across+the+human+transcriptome.">Landscape and variation of RNA secondary structure across the human transcriptome.</a> Nature. 505, 706-709 (2014).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+mRNA+binding+proteins+that+regulate+the+stability+of+LDL+receptor+mRNA+through+AU+rich+elements.">Identification of mRNA binding proteins that regulate the stability of LDL receptor mRNA through AU rich elements.</a> J Lipid Res. 50 (5), 820-831 (2009).</li><li>McHugh, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Xist+lncRNA+interacts+directly+with+SHARP+to+silence+transcription+through+HDAC3.">The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3.</a> Nature. 521 (7551), 232-236 (2015).</li><li>Chu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+Discovery+of+Xist+RNA+Binding+Proteins.">Systematic Discovery of Xist RNA Binding Proteins.</a> Cell. 161 (2), 404-416 (2015).</li><li>Chu, C., Spitale, R. C., Chang, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technologies+to+probe+functions+and+mechanisms+of+long+noncoding+RNAs.">Technologies to probe functions and mechanisms of long noncoding RNAs.</a> Nat Struct Mol Biol. 22 (1), 29-35 (2015).</li><li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+identification+of+Polycomb-associated+RNAs+by+RIP-seq.">Genome-wide identification of Polycomb-associated RNAs by RIP-seq.</a> Mol Cell. 40 (6), 939-953 (2010).</li></ol>

lncRNAs RBPs e desempenham um papel vital na saúde e na doença, no entanto, os mecanismos moleculares destas moléculas são mal compreendidos. Identificação de proteínas que interagem com moléculas lncRNA é um passo fundamental para elucidar os mecanismos de regulação. Enriquecimento de RBPs por o sistema de ensaio suspenso ARN baseia-se na captura em solução de complexo interagir de modo que as proteínas a partir de um lisado celular pode ser selectivamente extraído usando iscas de ARN biotinilados ligado...

A correction to the author list was made to: <a href="http://www.jove.com/video/54207/detection-rna-binding-proteins-vitro-rna-pull-down-adipocyte">Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture</a>.
The author list has been updated from:
Qianfan Bai1*, Zhiqiang Bai1*, Lei Sun1,2
1Cardiovascular and Metabolic Disorders Program, Duke-NUS Medical School
2Institute of Molecular and Cell Biology, Singapore
*These authors contributed equally
to:
Qianfan Bai1*, Zhiqiang Bai1*, Shaohai Xu3, Lei Sun1,2
1Cardiovascular and Metabolic Disorders Program, Duke-NUS Medical School
2Institute of Molecular and Cell Biology, Singapore
3Division of Bioengineering, School of Chemical &#38; Biomedical Engineering, Nanyang Technological University
*These authors contributed equally

A correction to the author list was made to: Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture.

Erratum: Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

RBPs são proteínas que se ligam ao ARN de cadeia dupla ou simples em células e participam na formação de complexos de ARN-proteína. RBPs pode ligar-se uma variedade de espécies de ARN, incluindo ARNm e ARN não codificantes longos (lncRNAs), e exercem a sua influência aos níveis pós-transcricional. Ambos os RBPs e lncRNAs estão emergindo como novos reguladores no desenvolvimento adiposo e funcionar 1,2,3. Para compreender o mecanismo de RBP- e regulação mediada por lncRNA de vias celulares, é muitas vezes necessário para detectar a interacção entre uma molécula de ARN específica e um ou vários RBPs, e, por vezes, para identificar o espectro completo de parceiros proteicos de um ARN transcrição. No entanto, a experiência pode ser um desafio devido ao seu elevado teor de lípidos em adipócitos. O ARN protocolo suspenso descrito aqui pode ser utilizado para recuperar os parceiros de proteína de um RNA específico a partir dos lisados ​​de culturas de adipócitos primários 4,5. Justificativa para este protoCol é resumido como se segue. Um isco ARN é transcrito in vitro a partir de um molde de ADN, e conjugado com estreptavidina-revestida esferas magnéticas 4 marcado com biotina. O isco de ARN é incubada com lisados ​​celulares para permitir a formação de complexos de ARN-proteína, que são subsequentemente puxadas para baixo sobre um suporte magnético. Mais especificamente, o ARN protocolo suspenso descrito abaixo utilizar um fragmento de ARN de AR 3&#39;UTR como a isca para recuperar proteína Hur, uma RBP universalmente expresso ligado a 3&#39;UTR do ARNm de 6,7, a partir de uma cultura primária theadipocytelysate. Para testar a especificidade de ligação deste ensaio, um RNAas não-relevantes bem como em branco esferas de estreptavidina é incluído como controlo. Este protocolo é compatível com western blot ou espectrometria de massa (MS) para confirmar a captura de um RBP específico ou para identificar o repertório cheio de RBPs capturados, respectivamente 8. Estão disponíveis várias técnicas para estudar a interacção RNA-proteínas. Para revelar RNAs ligados por um determinado RBP, RIP (imunoprecipitação RNA) e CLIP (reticulação UV e imunoprecipitação) pode ser aplicado. Em contraste, para identificar parceiros de proteína de um determinado ARN, ARN suspenso, CHIRP (isolamento cromatina por purificação de ARN), QUADRO (análise de hibridação de captura de alvos de ARN) e RAP (purificação de ARN anti-sentido) pode ser aplicado. Em comparação com os posteriores, a técnica de pull-down RNA leva menos esforço para configurar. Pode ser empregue para capturar as proteínas in vitro e in vivo. A abordagem in vivo de RNA pull-down, que é tecnicamente mais exigente do que o seu homólogo in vitro, preserva interações RNA-proteína por reticulação nas células, capta RNAs marcado com aptâmeros de interesse a partir de células e, posteriormente detecta RBPs encadernados. ARN pull-down pode ser utilizado para enriquecer baixas RBPs abundantes, e para isolar e identificar os complexos de ARN-proteína que têm diversos papéis funcionais no controlo de regulação celular 9,10 </s-se&gt;.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="857">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Major materials used in this study.</td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:72px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEGAscript kit</td>
			<td>&#160;Ambion</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Biotin-14-CTP&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NucAway spin columns&#160;</td>
			<td>Ambion</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dynabeads M-280 Streptavidin&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HuR (3A2) mouse monoclonal antibody (sc-5261)&#160;</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat anti-mouse IgG-HRP(sc-2005)&#160;</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hypure Molecular Biology Grade Water (nuclease-free)&#160;</td>
			<td>HyClone</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate Buffer Saline (1&#215;PBS)</td>
			<td>&#160;HyClone</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNase inhibitor&#160;</td>
			<td>Bioline</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protease inhibitor&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pfu Turbo DNA polymerase&#160;</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TRIsure</td>
			<td>&#160;Bioline</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Major equipment used in this study.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sorvall Legend Micro 21R centrifuge&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sorvall Legend X1R centrifuge&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bio-Rad T100 thermal cycler&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nanodrop 2000&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BOECO rotator Multi Bio RS-24&#160;</td>
			<td>BOECO,Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protein gel electrophoresis and blotting apparatus&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DynaMag-2 magnet&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of rna-binding proteins by in vitro rna pull-down in adipocyte culture

proteínas de ligação a ARN (RBPs) estão a emergir como uma camada reguladora no desenvolvimento e função do tecido adiposo. RBPs desempenhar um papel-chave na regulação da expressão de genes aos níveis pós-transcricional por afectar a estabilidade e eficiência de translação de ARNm alvo. técnica pull-down ARN tem sido amplamente utilizado para estudar a interacção RNA-proteína, que é necessário para elucidar o mecanismo subjacente a função &#39;, bem como RNAs não-codificantes longos&#39; RBPs (lncRNAs). No entanto, a abundância de lípidos alta nos adipócitos representa um desafio técnico na realização deste experimento. Aqui, um protocolo de pull-down RNA detalhada é otimizado para a cultura de adipócitos primário. Um fragmento de RNA a partir de (AR) «Região do receptor de andrógeno 3 não traduzida (3&#39;UTR) contendo um elementwas rica adenilato-uridilato usados ​​como exemplo para demonstrar como recuperar seu parceiro RBP, proteína Hur, de lystate adipócitos. O método descrito aqui pode ser aplicado para detectar as interacções entreRBPs e RNAs não codificadoras, bem como entre RBPs e RNAs de codificação.

Nesta experiência de demonstração, um fragmento de ARN de AR foi utilizado como isco para capturar a sua proteína de ligação Hur. Tanto uma isca FL ARN que não é relevante para a proteína Hur, e uma alíquota de esferas de estreptavidina em branco não conjugados serviram como controlos negativos. interacções ARN-proteína podem ocorrer quer no núcleo ou citoplasma, e este protocolo de pull-down pode ser aplicado a total ou fraccionado (nucleares ou citoplasmáticas) lisados ...

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Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

Um protocolo de pull-down ARN é optimizado aqui para a detecção de interacções entre proteínas de ligação a ARN (RBPs) e não-codificante, bem como ARN de codificação. Um fragmento de ARN a partir do receptor de androgénio (AR) foi usado como um exemplo para demonstrar como recuperar a sua RBP de lystate de adipócitos primários castanhos.

Detecção de proteínas de ligação a ARN pela<em&gt; In Vitro</em&gt; RNA Pull-down em Cultura adipócito

RNA-binding proteins (RBPs) are emerging as a regulatory layer in the development and function of adipose. RBPs play a key role in the gene expression ...

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