Name: detection of rna-binding proteins by in vitro rna pull-down in adipocyte culture
Uploaded: 2016-07-22T15:00:00
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Este trabajo fue financiado por Singapur NRF comunión (NRF-2011NRF-NRFF001-025), así como CBRG (NMRC / CBRG / 0070/2014).

NOTA: El ARN de interés en el contexto de este estudio es un fragmento de AR 3&#39;UTR. 1. Preparación de ARN marcado con biotina <ol><li> Para obtener el ARN, amplificar T7-AR-oligo por PCR, seguido por la transcripción in vitro utilizando un kit comercial y siguiendo las instrucciones del fabricante 11. NOTA: Los cebadores para PCR se enumeran en la Tabla 4: T7-AR-F y T7-AR-R. </li><li> Para el control de la unión no específica, a...

<ol>
	<li>Huot, M. &. #. 2. 0. 1. ;., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sam68+STAR+RNA-binding+protein+regulates+mTOR+alternative+splicing+during+adipogenesis.">The Sam68 STAR RNA-binding protein regulates mTOR alternative splicing during adipogenesis.</a> Mol Cell. 46 (2), 187-199 (2012).</li><li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+noncoding+RNAs+regulate+adipogenesis.">Long noncoding RNAs regulate adipogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (9), 3387-3392 (2013).</li><li>Engreitz, J. 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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+reconstruction+of+adipose+tissue+transcriptomes+reveals+long+non-coding+RNA+regulators+of+brown+adipocyte+development.">De novo reconstruction of adipose tissue transcriptomes reveals long non-coding RNA regulators of brown adipocyte development.</a> Cell Metab. 21, 764-776 (2015).</li><li>Adams, D. J., Beveridge, D. J., van der Weyden, L., Mangs, H., Leedman, P. J., Morris, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HADHB,+HuR,+and+CP1+bind+to+the+distal+3-untranslated+region+of+human+renin+mRNA+and+differentially+modulate+renin+expression.">HADHB, HuR, and CP1 bind to the distal 3-untranslated region of human renin mRNA and differentially modulate renin expression.</a> J Biol Chem. 278 (45), 44894-44903 (2003).</li><li>Yeap, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+binding+of+HuR+and+poly(C)-binding+protein+to+a+conserved+UC-rich+motif+within+the+3&#180;+untranslated+region+of+the+androgen+receptor+messenger+RNA.">Novel binding of HuR and poly(C)-binding protein to a conserved UC-rich motif within the 3&#180; untranslated region of the androgen receptor messenger RNA.</a> J Biol Chem. 277, 27183-27192 (2002).</li><li>K&#246;nig, J., Zarnack, K., Luscombe, N. 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A., Russell, P., Guttman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+comprehensive+experimental+identification+of+RNA-protein+interactions.">Methods for comprehensive experimental identification of RNA-protein interactions.</a> Genome Biol. 15 (1), 203 (2014).</li><li>Lee, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AU-rich+element-binding+protein+negatively+regulates+CCAAT+enhancer+binding+protein+mRNA+stability+during+long+term+synaptic+plasticity+in+Aplysia.">AU-rich element-binding protein negatively regulates CCAAT enhancer binding protein mRNA stability during long term synaptic plasticity in Aplysia.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (38), 15520-15525 (2012).</li><li>Hermann, M., Cermak, T., Voytas, D. F., Pelczar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+genome+engineering+using+designer+nucleases.">Mouse genome engineering using designer nucleases.</a> J Vis Exp. (86), (2014).</li><li>Tsai, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+Noncoding+RNA+as+Modular+Scaffold+of+Histone+Modification+Complexes.">Long Noncoding RNA as Modular Scaffold of Histone Modification Complexes.</a> Science. 329 (5992), 689-693 (2010).</li><li>Wan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Landscape+and+variation+of+RNA+secondary+structure+across+the+human+transcriptome.">Landscape and variation of RNA secondary structure across the human transcriptome.</a> Nature. 505, 706-709 (2014).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+mRNA+binding+proteins+that+regulate+the+stability+of+LDL+receptor+mRNA+through+AU+rich+elements.">Identification of mRNA binding proteins that regulate the stability of LDL receptor mRNA through AU rich elements.</a> J Lipid Res. 50 (5), 820-831 (2009).</li><li>McHugh, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Xist+lncRNA+interacts+directly+with+SHARP+to+silence+transcription+through+HDAC3.">The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3.</a> Nature. 521 (7551), 232-236 (2015).</li><li>Chu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+Discovery+of+Xist+RNA+Binding+Proteins.">Systematic Discovery of Xist RNA Binding Proteins.</a> Cell. 161 (2), 404-416 (2015).</li><li>Chu, C., Spitale, R. C., Chang, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technologies+to+probe+functions+and+mechanisms+of+long+noncoding+RNAs.">Technologies to probe functions and mechanisms of long noncoding RNAs.</a> Nat Struct Mol Biol. 22 (1), 29-35 (2015).</li><li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+identification+of+Polycomb-associated+RNAs+by+RIP-seq.">Genome-wide identification of Polycomb-associated RNAs by RIP-seq.</a> Mol Cell. 40 (6), 939-953 (2010).</li></ol>

lncRNAs y las prácticas comerciales restrictivas tienen un papel vital en la salud y la enfermedad, sin embargo los mecanismos moleculares de estas moléculas son poco conocidos. Identificación de proteínas que interactúan con moléculas lncRNA es un paso clave para dilucidar los mecanismos de regulación. El enriquecimiento de las prácticas comerciales restrictivas por el sistema de ensayo desplegable ARN se basa en la captura en solución de interactuar complejo de manera que las proteínas de un lisado de célul...

A correction to the author list was made to: <a href="http://www.jove.com/video/54207/detection-rna-binding-proteins-vitro-rna-pull-down-adipocyte">Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture</a>.
The author list has been updated from:
Qianfan Bai1*, Zhiqiang Bai1*, Lei Sun1,2
1Cardiovascular and Metabolic Disorders Program, Duke-NUS Medical School
2Institute of Molecular and Cell Biology, Singapore
*These authors contributed equally
to:
Qianfan Bai1*, Zhiqiang Bai1*, Shaohai Xu3, Lei Sun1,2
1Cardiovascular and Metabolic Disorders Program, Duke-NUS Medical School
2Institute of Molecular and Cell Biology, Singapore
3Division of Bioengineering, School of Chemical &#38; Biomedical Engineering, Nanyang Technological University
*These authors contributed equally

A correction to the author list was made to: Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture.

Erratum: Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

Prácticas comerciales restrictivas son proteínas que se unen al ARN de doble o de cadena sencilla en las células y participan en la formación de complejos de ARN-proteína. Las prácticas comerciales restrictivas pueden unir una variedad de especies de ARN, incluyendo ARN no codificantes de ARNm y largos (lncRNAs), y ejercer su influencia a nivel post-transcripcional. Ambas prácticas comerciales restrictivas y lncRNAs están surgiendo como nuevos reguladores en el desarrollo adiposo y funcionan 1,2,3. Para entender el mecanismo de RBP- y regulación lncRNA mediada de vías celulares, a menudo es necesario para detectar la interacción entre una molécula de ARN específico y una o varias prácticas comerciales restrictivas, y, a veces, para identificar el espectro completo de proteínas asociados de un ARN transcripción. Sin embargo, el experimento puede ser difícil debido al alto contenido de lípidos en los adipocitos. El protocolo desplegable RNA descrito aquí se puede emplear para recuperar los compañeros de la proteína de un ARN específico de los lisados ​​de adipocitos de cultivos primarios 4,5. Justificación de este protoCol se resume de la siguiente manera. Un cebo de ARN es transcrito in vitro a partir de un molde de ADN, marcado con biotina y conjugado a perlas magnéticas recubiertas con estreptavidina 4. El cebo de ARN se incuba con lisados ​​celulares para permitir la formación de complejos de ARN-proteína, que se extraen posteriormente hacia abajo en un soporte magnético. Más específicamente, el protocolo desplegable RNA describe a continuación utilizar un fragmento de ARN de AR 3&#39;UTR como el cebo para recuperar proteína Hur, un RBP expresado universalmente unido a 3&#39;UTR de ARNm de 6,7, de theadipocytelysate de cultivo primario. Para probar la especificidad de unión de este ensayo, un RNAas no relevantes así como perlas de estreptavidina en blanco se incluyen como control. Este protocolo es compatible con el Western Blot o espectrometría de masas (MS) para confirmar la captura de un RBP específica o para identificar el repertorio completo de las prácticas comerciales restrictivas capturados 8, respectivamente. Hay disponibles varias técnicas para estudiar la interacción proteína-ARNs. Para revelar los ARN unidos por un determinado RBP, RIP (ARN inmunoprecipitación) y CLIP (reticulación UV e inmunoprecipitación) se puede aplicar. Por el contrario, para identificar proteínas asociados de un determinado ARN, ARN desplegable, Chirp (cromatina aislamiento mediante la purificación del ARN), gráfico (análisis de hibridación de captura de dianas de ARN) y el PAR (purificación de ARN antisentido) se puede aplicar. En comparación con los posteriores, la técnica desplegable ARN requiere menos esfuerzo de configurar. Puede ser empleado para capturar proteínas in vitro e in vivo. El enfoque in vivo de ARN desplegable, que es técnicamente más difícil que su homólogo in vitro, preserva las interacciones ARN-proteína por reticulación en las células, capta los ARN aptamer etiquetado de interés a partir de células, y, posteriormente, detecta las prácticas comerciales restrictivas consolidados. ARN desplegable se puede utilizar para enriquecer las prácticas comerciales restrictivas bajas abundantes, y para aislar e identificar los complejos de proteínas y ARN que tienen diversos roles funcionales en el control de la regulación celular 9,10 </sarriba&gt;.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="857">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Major materials used in this study.</td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:72px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEGAscript kit</td>
			<td>&#160;Ambion</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Biotin-14-CTP&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NucAway spin columns&#160;</td>
			<td>Ambion</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dynabeads M-280 Streptavidin&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HuR (3A2) mouse monoclonal antibody (sc-5261)&#160;</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat anti-mouse IgG-HRP(sc-2005)&#160;</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hypure Molecular Biology Grade Water (nuclease-free)&#160;</td>
			<td>HyClone</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate Buffer Saline (1&#215;PBS)</td>
			<td>&#160;HyClone</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNase inhibitor&#160;</td>
			<td>Bioline</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protease inhibitor&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pfu Turbo DNA polymerase&#160;</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TRIsure</td>
			<td>&#160;Bioline</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Major equipment used in this study.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sorvall Legend Micro 21R centrifuge&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sorvall Legend X1R centrifuge&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bio-Rad T100 thermal cycler&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nanodrop 2000&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BOECO rotator Multi Bio RS-24&#160;</td>
			<td>BOECO,Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protein gel electrophoresis and blotting apparatus&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DynaMag-2 magnet&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of rna-binding proteins by in vitro rna pull-down in adipocyte culture

proteínas de unión a ARN (prácticas comerciales restrictivas) están emergiendo como una capa de regulación en el desarrollo y la función del tejido adiposo. Prácticas comerciales restrictivas juegan un papel clave en la regulación de la expresión génica a nivel posttranscriptional al afectar la eficiencia de la estabilidad y de la traducción de ARNm diana. técnica desplegable RNA ha sido ampliamente utilizado para estudiar la interacción de ARN-proteína, que es necesaria para dilucidar el mecanismo de la función de las prácticas comerciales restrictivas &quot;, así como largos ARN no codificante&quot; (lncRNAs) subyacente. Sin embargo, la alta abundancia de lípidos en los adipocitos plantea un desafío técnico en la realización de este experimento. Aquí un protocolo desplegable ARN detallada está optimizado para el cultivo de adipocitos primaria. Un fragmento de ARN a partir de (AR) 3 &#39;no traducida del receptor de andrógenos (3&#39;UTR) que contiene un elementwas adenilato-uridylate ricos utilizados como un ejemplo para demostrar cómo recuperar su socio RBP, proteínas Hur, de lystate adipocito. El método descrito aquí se puede aplicar para detectar las interacciones entrePrácticas comerciales restrictivas y ARN no codificantes, así como entre las prácticas comerciales restrictivas y ARN de codificación.

En este experimento de demostración, un fragmento de ARN AR se utilizó como cebo para capturar su proteína de unión Hur. Tanto un ARN cebo FL que no es relevante para la proteína Hur, y una alícuota de perlas de estreptavidina en blanco no conjugados sirvieron como controles negativos. interacciones ARN-proteína puede ocurrir ya sea en el núcleo o citoplasma, y ​​este protocolo desplegable se puede aplicar a total o fraccionado lisados ​​celulares (citoplásmicos o nuclea...

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Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

Un protocolo desplegable ARN se optimiza aquí para la detección de interacciones entre proteínas de unión a ARN (prácticas comerciales restrictivas) y no codificante, así como los ARN de codificación. Un fragmento de ARN de receptor de andrógenos (AR) se utilizó como un ejemplo para demostrar cómo recuperar su RBP de lystate de adipocitos marrones primarios.

La detección de las proteínas de unión a ARN por<em&gt; In Vitro</em&gt; ARN desplegable de adipocitos Cultura

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