Name: applying fluorescence resonance energy transfer (fret) to examine effector translocation efficiency by coxiella burnetii during sirna silencing
Uploaded: 2016-07-06T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer FRET to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing at JoVE.com

This work was supported by National Health and Medical Research Council (NHMRC) grants (Grant ID 1062383 and 1063646) awarded to HJN. EAL is supported by an Australian Postgraduate Award.

Remarque: Toutes les procédures impliquant la croissance ou la manipulation de Coxiella burnetii RSA439 NMII doivent être effectuées dans un niveau de confinement physique 2 laboratoire et dans une enceinte de sécurité biologique dans le respect des directives locales. Un diagramme schématique de la transfection et l&#39; analyse de la translocation flux inverse de celui décrit ci - dessous est représentée sur la figure 2. 1. Préparation de C. burnetii</...

Les systèmes de sécrétion, et les protéines effectrices bactériennes ces systèmes de transport dans le cytoplasme des cellules hôtes sont une composante importante de virulence que de nombreuses bactéries pathogènes utilisent pour établir une infection dans des niches réplicatives uniques. L&#39;objectif de nombreux groupes de recherche a été d&#39;étudier l&#39;interaction entre les effecteurs bactériens et protéines de l&#39;hôte et l&#39;influence de ces effecteurs ont sur les voies cellulaires hôte...

Coxiella burnetii est un pathogène intracellulaire unique qui provoque la zoonotique infection humaine fièvre Q. Cette maladie est associée à un large éventail de présentations cliniques s&#39;étendant de séroconversion asymptomatique à une infection chronique potentiellement mortelle qui se manifeste souvent endocardite ans après l&#39; exposition 1. L&#39;infection humaine se produit principalement par l&#39;inhalation d&#39;aérosols contaminés avec ruminants le principal réservoir d&#39;infection, en particulier, les vaches laitières, les moutons et les chèvres. Bien que l&#39; infection Coxiella chez ces animaux est généralement subclinique, l&#39;infection peut déclencher l&#39; avortement et la charge bactérienne considérable dans le fluide de l&#39; accouchement et le placenta peut contaminer l&#39;environnement local 1. Un exemple de l&#39;énorme fardeau telle contamination peut avoir sur la santé publique et l&#39;industrie de l&#39; agriculture a récemment été observée dans l&#39;épidémie de fièvre Q qui a eu lieu aux Pays - Bas 2. Entre 2007 et2010, plus de 4000 cas humains de fièvre Q ont été diagnostiqués et cette épidémie était liée à une contamination importante des exploitations caprines 3. En outre, Coxiella est une arme biologique potentielle, classé par les US Centers for Disease Control and Prevention, en raison de la stabilité de l&#39; environnement des bactéries et une faible dose infectieuse nécessaire pour provoquer la morbidité et de la mortalité 4 sévère. Coxiella existe en deux phases: Phase I organismes, isolées à partir de sources naturelles, sont extrêmement virulents et les organismes de la Phase II sont fortement atténués in vivo. Par exemple, après quelques passages in vitro dans des Coxiella burnetii phase I Nine Mile organismes, les bactéries de phase II ont été produits qui contiennent une délétion chromosomique irréversible résultant en un lipopolysaccharide tronqué (LPS) 5. Cette souche, C. burnetii NMII, est phénotypiquement similaire à la phase I dans les modèles de culture de tissus et fournit un mode plus sûrl pour les chercheurs pour étudier la pathogenèse Coxiella dans les laboratoires 5. Au cours des dernières années , plusieurs avancées ont rapidement fait progresser le domaine de la génétique Coxiella. Plus particulièrement, le développement des médias axénique (acidifié milieu de cystéine citrate - ACCM-2) a permis la croissance sans cellule de Coxiella à la fois liquide et sur ​​des supports solides 6,7. Cela a entraîné des améliorations directes des outils génétiques disponibles pour Coxiella , y compris un système d&#39;expression génique inductible, des vecteurs navettes et des systèmes de transposon aléatoires 8-11. Plus récemment, deux méthodes d&#39;inactivation du gène ciblé ont également été mis au point, ouvrant la voie à l&#39; examen des gènes candidats de virulence spécifiques 12. Après intériorisation par les macrophages alvéolaires, Coxiella réplique à un nombre élevé dans un compartiment lié à la membrane appelée Coxiella- contenant des vacuoles (CCV). Le CCV nécessite le trafic d&#39;endocytose hôte eendosomes précoces et tardives rugueux jusqu&#39;à ce qu&#39;il arrive à maturité dans un organite lysosome dérivé 13. Tout au long de ce processus, le CCV acquiert des facteurs hôtes qui soit apparaissent transitoirement ou restent associés à la vacuole, y compris, mais sans s&#39;y limiter, Rab5, Rab7, CD63 et LAMP-13 à 15 janvier. Réplication de Coxiella dans les cellules hôtes est entièrement dépendante d&#39; un type Dot / Icm système entièrement fonctionnel IVB Sécrétion (T4SS) 8,16,17. Ce système de sécrétion est une structure multi-protéique héréditairement liés aux systèmes de conjugaison et englobe à la fois les membranes bactériennes et vacuolaires pour délivrer des protéines bactériennes, appelées effecteurs, dans le cytoplasme de l&#39; hôte 18. Le Coxiella T4SS est fonctionnellement très similaire au type IVB Dot / Icm système Sécrétion bien caractérisé de Legionella pneumophila 19,20. Fait intéressant, l&#39; activation de l&#39;effecteur translocation T4SS et ultérieure ne se produit pas jusqu&#39;à ce que Coxiella atteint le lysosome dérivé acideorganite, environ 8 heures post-infection 17,21. À ce jour, plus de 130 effecteurs Dot / Icm ont été identifiés 9,17,22-24. Beaucoup de ces effecteurs jouent probablement un rôle important lors de la réplication de Coxiella dans les cellules hôtes; cependant, seuls quelques effecteurs ont été caractérisées fonctionnellement 25-29. Dans cette étude , nous utilisons une translocation dosage par fluorescence à base qui repose sur le clivage du substrat FRET CCF2-AM (ci - après dénommé le substrat BlaM) via l&#39; activité β-lactamase dans le cytoplasme de la cellule hôte (figure 1). Le gène d&#39;intérêt est fusionnée à TEM-1 β-lactamase (BlaM) sur un plasmide rapporteur qui permet une expression constitutive. Le substrat BlaM est composé de deux fluorophores (coumarine et fluorescéine) qui forment une paire FRET. L&#39;excitation des résultats de la coumarine dans la case de la fluorescéine et le vert émission de fluorescence en l&#39;absence d&#39;effecteur translocation; cependant, si le BlaM effecteur protéine de fusion subit une translocation dans le cytoplasme de l&#39;hôte, la résultante β-lactamase activité clive la bague β-lactame du substrat BlaM, séparant la paire de FRET produisant une émission de fluorescence bleue après excitation. Ce test de translocation a été éprouvée comme une approche pour identifier les protéines effectrices à partir d&#39; une gamme de différentes bactéries intracellulaires et extracellulaires, y compris C. burnetii, L. pneumophila, L. longbeachae, Chlamydia trachomatis, entéropathogènes E. coli, Salmonella et Brucella 17,30-35. Pour déterminer le rôle des facteurs de l&#39; hôte spécifiques sur Coxiella effecteur translocation nous utilisons une méthode bien établie pour l&#39; inactivation de gène connu comme l&#39; interférence ARN, en particulier les petits ARN interférents (siRNA). Initialement identifié dans Caenorhabditis elegans, l&#39; interférence ARN est un processus cellulaire endogène conservé utilisé pour defe innéense contre les virus, ainsi que régulation des gènes 36,37. Après la liaison de siRNA spécifique de la séquence, la dégradation de l&#39; ARNm se produit à travers RISC (complexe taire induite par l&#39; ARN) conduisant à l&#39; inactivation de gène spécifique ou knockdown 38. Dans cette étude, l&#39;ARNsi a été utilisé pour cibler deux protéines de l&#39;hôte, et RAB5A Rab7A, qui sont des régulateurs importants de la voie d&#39;endocytose. L&#39;impact du silence RAB5A et Rab7A sur effecteur translocation a été établie à l&#39; aide C. burnetii pBlaM-CBU0077. CBU0077 a été choisi car il a été montré précédemment translocation par le système de sécrétion de point / Icm de Coxiella 17. Utilisant à la fois siRNA silençage génique et le test de translocation fluorescencebased décrit ici, nous commençons à établir un rôle de facteurs de l&#39; hôte dans la translocation des protéines effectrices par Coxiella. Cette approche peut être appliquée à un large éventail de bactéries intracellulaires et extracellulaires qui possèdent secretio similairesLes systèmes responsables de la translocation de protéines effectrices n.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="760">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Reagents</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Citric acid</td>
			<td style="width:87px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C0759</td>
			<td style="width:211px;">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Sodium citrate</td>
			<td style="width:87px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S4641</td>
			<td style="width:211px;">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Potassium phosphate</td>
			<td style="width:87px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">60218</td>
			<td style="width:211px;">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Magnesium chloride</td>
			<td style="width:87px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:119px;">442611</td>
			<td style="width:211px;">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Calcium chloride</td>
			<td style="width:87px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C5080</td>
			<td style="width:211px;">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Iron sulfate</td>
			<td style="width:87px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">S93248</td>
			<td style="width:211px;">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:87px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S9625</td>
			<td style="width:211px;">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">L-cysteine</td>
			<td style="width:87px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C6852</td>
			<td style="width:211px;">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Bacto-neopeptone</td>
			<td style="width:87px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">211681</td>
			<td style="width:211px;">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Casamino acids</td>
			<td style="width:87px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP1424</td>
			<td style="width:211px;">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Methyl beta cyclodextrin</td>
			<td style="width:87px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C4555</td>
			<td style="width:211px;">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:343px;">RPMI + Glutamax</td>
			<td style="width:87px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">61870-036</td>
			<td style="width:211px;">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Chloramphenicol</td>
			<td style="width:87px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C0378</td>
			<td style="width:211px;">For bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">ON-TARGETplus Non-targeting Control Pool (OTP)</td>
			<td style="width:87px;">Dharmacon</td>
			<td style="width:119px;">D-001810-10-05</td>
			<td style="width:211px;">Non-targeting control</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:343px;">siGENOME Human PLK1 (5347) siRNA - SMARTpool</td>
			<td style="width:87px;">Dharmacon</td>
			<td style="width:119px;">M-003290-01-005</td>
			<td style="width:211px;">Causes cell death; measure of transfection efficiency</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">siGENOME Human RAB5A (5968) siRNA - SMARTpool</td>
			<td style="width:87px;">Dharmacon</td>
			<td style="width:119px;">M-004009-00-0005</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">siGENOME Human RAB7A (7879) siRNA - SMARTpool</td>
			<td style="width:87px;">Dharmacon</td>
			<td style="width:119px;">M-010388-00-0005</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:343px;">5X siRNA buffer</td>
			<td style="width:87px;">Dharmacon</td>
			<td style="width:119px;">B-002000-UB-100</td>
			<td style="width:211px;">Use sterile RNase-free water to dilute 5X siRNA buffer to 1X siRNA buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">DharmaFECT-1 Transfection Reagent</td>
			<td style="width:87px;">Dharmacon</td>
			<td style="width:119px;">T-2001-01</td>
			<td style="width:211px;">For transfection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:343px;">Opti-MEM + GlutaMAX</td>
			<td style="width:87px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">51985-034</td>
			<td style="width:211px;">Reduced-serum medium used for transfection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:343px;">DMEM + GlutaMAX</td>
			<td style="width:87px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">10567-014</td>
			<td style="width:211px;">For cell culture and infection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:343px;">Heat-inactivated fetal calf serum (FCS)</td>
			<td style="width:87px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">SH30071.03</td>
			<td style="width:211px;">Can use alternate equivalent product</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">DMSO</td>
			<td style="width:87px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D8418</td>
			<td style="width:211px;">For storage of Coxiella strain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">PBS</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:211px;">For cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:343px;">0.05% Trypsin + EDTA</td>
			<td style="width:87px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">25300-054</td>
			<td style="width:211px;">For cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:343px;">dH2O</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:211px;">For dilution of samples and standards for qPCR</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:343px;">Quick-gDNA Mini Prep</td>
			<td style="width:87px;">ZYMO Research</td>
			<td style="width:119px;">D3007</td>
			<td style="width:211px;">Can use alternate equivalent product to extract gDNA</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:343px;">SensiFAST SYBR No-ROX Kit</td>
			<td style="width:87px;">Bioline</td>
			<td style="width:119px;">BIO-98020</td>
			<td style="width:211px;">Can use alternate equivalent qPCR master mix product for qPCR reaction</td>
		</tr>
		<tr height="120">
			<td height="120" style="height:120px;width:343px;">LiveBLAzer FRET-B/G Loading kit with CCF2-AM</td>
			<td style="width:87px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">K1032</td>
			<td style="width:211px;">For measurement of translocation using fluorescence and generation of the 6X loading solution (contains Solution A, B, C and DMSO)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Sodium hydroxide</td>
			<td style="width:87px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">106469</td>
			<td style="width:211px;">Probenicid solution component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Sodium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:87px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">71505</td>
			<td style="width:211px;">Probenicid solution component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">di-Sodium hydrogen orthophosphate</td>
			<td style="width:87px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">106586</td>
			<td style="width:211px;">Probenicid solution component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Probenicid</td>
			<td style="width:87px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P8761</td>
			<td style="width:211px;">Probenicid solution component</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:343px;">DRAQ5 Fluorescent Probe Solution (5 mM)</td>
			<td style="width:87px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">62251</td>
			<td style="width:211px;">Nuclei stain to determine cell viablity. Use 1:4000 diluted in PBS.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:343px;">4% PFA (paraformaldehyde) solution in PBS</td>
			<td style="width:87px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P6148</td>
			<td style="width:211px;">Fixing solution for HeLa 229 cells</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:343px;">25cm2 tissue culture flask with vented cap</td>
			<td style="width:87px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">430639</td>
			<td style="width:211px;">For growth of bacterial strain</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:343px;">96 Well Flat Clear bottom Black Polystyrene TC-Treated Microplates, Individually wrapped, with Lid, Sterile</td>
			<td style="width:87px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">3603</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:343px;">75cm2 tissue culture flask with vented cap</td>
			<td style="width:87px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">430641</td>
			<td style="width:211px;">For growth of HeLa 229 cells</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:343px;">175cm2 tissue culture flask with vented cap</td>
			<td style="width:87px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">431080</td>
			<td style="width:211px;">For growth of HeLa 229 cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Haemocytometer</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:211px;">For quantification of HeLa 229 cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Tear-A-Way 96 Well PCR plates</td>
			<td style="width:87px;">4titude</td>
			<td style="width:119px;">4ti-0750/TA</td>
			<td style="width:211px;">For qPCR reaction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">8-Lid chain, flat</td>
			<td style="width:87px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:119px;">65.989.002</td>
			<td style="width:211px;">For qPCR reaction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Equipment</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Bench top microfuge</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Bench top vortex</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Orbital mixer</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:87px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5810 R</td>
			<td style="width:211px;">For pelleting bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Nanodrop</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:211px;">For gDNA quantification</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:343px;">Mx3005P QPCR machine</td>
			<td style="width:87px;">Aligent Technologies</td>
			<td style="width:119px;">401456</td>
			<td style="width:211px;">For quantification of Coxiella genomes in 7 day culture</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:343px;">ClarioSTAR microplate reader</td>
			<td style="width:87px;">BMG LabTech</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:211px;">For measurement of fluorescence</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

applying fluorescence resonance energy transfer (fret) to examine effector translocation efficiency by coxiella burnetii during sirna silencing

Coxiella burnetii, l&#39;agent causal de la fièvre Q, est un pathogène intracellulaire qui repose sur un type IV Dot / Icm Système Sécrétion d&#39;établir une niche réplicative. Une cohorte de effecteurs sont transloqué à travers ce système dans la cellule hôte pour manipuler les processus d&#39;accueil et de permettre l&#39;établissement d&#39;une vacuole lysosome dérivé unique pour la réplication. La méthode présentée ici implique la combinaison de deux techniques bien établies: silençage génique spécifique en utilisant le siRNA et la mesure de la translocation d&#39;effecteur au moyen d&#39;un substrat à base de FRET qui repose sur l&#39;activité β-lactamase. L&#39;application de ces deux approches, nous pouvons commencer à comprendre le rôle des facteurs de l&#39;hôte en fonction du système de sécrétion bactérienne et effecteur translocation. Dans cette étude, nous avons examiné le rôle de RAB5A et Rab7A, à la fois des régulateurs importants de la voie de trafic endocytose. On démontre que l&#39;inhibition de l&#39;expression d&#39;un des deux protéines à une diminution effecteur translocation efficacité. Ces méthodes peuvent être facilement modifiés pour examiner d&#39;autres pathogènes intracellulaires et extracellulaires qui utilisent également des systèmes de sécrétion. De cette manière, une image globale des facteurs de l&#39;hôte impliqués dans la translocation bactérienne effecteur peut être révélée.

Pour cette étude, le C. souche burnetii pBlaM-CBU0077 a été choisi comme CBU0077 a été précédemment montré pour être un effecteur translocation du système de sécrétion Coxiella Dot / Icm 17. Avant l&#39;infection, le nombre de génomes / ml dans les sept jours C. culture burnetii pBlaM-CBU0077 a été dénombrée en utilisant qPCR. La figure 4 montre un exemple du cycle seuil (Ct) des valeurs attendues d...

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Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer FRET to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

L&#39;étude des interactions entre les bactéries pathogènes et leurs hôtes est un domaine important de la recherche biologique. Ici, nous décrivons les techniques nécessaires pour mesurer la translocation effecteur par Coxiella burnetii lors de l&#39; inactivation de gène siRNA en utilisant un substrat BlaM.

Application Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) pour examiner effecteur translocation efficacité par<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Pendant siRNA Silencing

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a ...

The overall goal of this experimental procedure is to examine the impact of specific host processes on the ability of bacterial pathogens to translocate effector proteins. This method can help answer key questions in the field of cellular microbiology. Specifically how the host is involved in either blocking or promoting the delivery of bacterial virulence effectors into the host cell.The main advantage of this technique is that it combines two established techniques. Namely, siRNA gene silencing and reporter essay to measure bacterial protein translocation. To investigate the interplay between pathogens and the eukaryotic cell.This method provides insight into coxiella pathogensis and can also be applied to investigate the host pathogen interactions of other bacteria that depend on efficient protein translocation. For example, chlamydia, salmonella, and attaching interfacing E.coli. After culturing C.burnetii expressing CBU0077, fuse the betalactamase according to the text protocol in a 25 centimeter squared culture flask with a vented cap.Inoculate 10 milliliters of pre-warmed ACCM2 containing three micrograms per milliliter of chloramphenical with 20 microliters of the bacteria. Grow the culture at 37 degrees celsius with five percent carbon dioxide and 2.5 percent oxygen for seven days. To reverse transfect hela cells with siRNA and after preparing the siRNA according to the text protocol, place DMEM plus 10%FCS, 05 percent trypsin EDTA, and PBS in a 37 degrees celsius water bath for 30 minutes to warm prior to use.For each experimental siRNA transfection, combine 0.4 microliters of transfection reagent and 63.6 microliters of reduced serum media in an individual microfuge tube. Vortex all microfuge tubes and allow the components to complex for five minutes at room temperature. Add 16 microliters of each experimental siRNA to the corresponding microfuge tubes containing the transfection complex.Then vortex and incubate at room temperature for 20 minutes. During the 20 minutes incubation, add 20 microliters of the transfection reagent, reduced serum medium and siRNA mix into the appropriate wells of a sterile black, flat, clear bottomed 96 well tray. Also during the 20 minute incubation, use 10 milliliters of pre-warmed PBS to wash a monolayer of confluent or subconfluent hela cells in a 75 centimeter squared flask.Add one milliliter of 05 percent trypsin EDTA solution to the flask and incubate at 37 degrees celsius and five percent carbon dioxide for three to five minutes to detach the cells. Collect the cells in nine milliliters of pre-warmed DMEM with 10%FCS. Using a hemocytometer to count the cells.Then with DMEM 10%FCS, bring the cells to a final density of 4.9 times 10 to the four cells per milliliter. Immediately following the 20 minute incubation, pipette 80 microliters of the cells into each well of the 96 well plate containing the siRNA transfection mixture which will bring the cell density to 3.92 times 10 to the third cells per well. This is the most critical step in the procedure.It is very important that the hela cells are added to the siRNA transfection mixture immediately following the 20 minute incubation. Otherwise transfection efficiency can be compromised. Ensure the blank wells contain only 80 microliters of DMEM plus 10%FCS.Incubate the plate for 24 hours. Then, with a multi-channel adapter attached to a vacuum source, and a pipette, replace the medium with 100 microliters of fresh DMEM plus 10%FCS. Incubate the cells for an additional 48 hours.After seven days of growth in ACCM2, centrifuge the 10 milliliters of C.burnetii P BlaM CBU0077 culture at 15, 000 times g and room temperature for 15 minutes. After removing the supernatant, use 10 milliliters of pre-warmed DMEM FCS to re-suspend the pellet. Then use water to prepare one in ten and one in one hundred dilutions in a final volume of 100 microliters of the culture and set up QPCR according to the text protocol.After calculating the total genomes per milliliter in the C.burnetii P BlaM CBU0077 culture, use pre-warmed DMEM FCS to adjust the volume of the culture to two milliliters for a concentration of 1.88 times 10 to the eight bacteria per milliliter. Next, remove the medium from the blank and reverse transfected cells. Then add 50 microliters of the diluted bacteria to the appropriate wells and add 50 microliters of DMEM FCS to the blank and uninfected wells.After preparing the solutions for the BlaM substrate according to the text protocol, prepare a master mix by combining 1.8 microliters of solution A and 16.2 microliters of solution B.Mix the tube well by vortexing. Then add 237 microliters of solution C and 45 microliters of 0.1 molar probenecid. Vortex the tube again.Add 10 microliters of the Six X loading solution directly into all the blank and reverse transfected wells without removing the existing medium. Incubate the plate in the dark at room temperature for two hours. To determine the level of translocation, on a microplate reader, create a fluorescence intensity protocol using Endpoint as the reading mode.Select 96 well microplate, then under optic settings, select two multichromatics and for the first number preset, input 410-10 nanometers excitation and 520-10 emission. For the second number preset, input 410-10 nanometers excitation and 450-10 emission. Then ensure Well multichromatics is selected.Next, select Orbital Averaging with a diameter of three millimeters. Under Optic, select Bottom optic. Then under Speed and Precision, select Precise.This corresponds to eight regions per well. Adjust the plate layout by selecting the appropriate wells as blanks and sample wells. Then, select Start measurement.Remove the lid and place the tray into the plate reader. Ensure the gain value is adjusted to avoid reaching maximum fluorescence values by performing a gain adjustment on one of the infected wells that has been reverse transfected with OTP siRNA. Select Start measurement to measure all the appropriate wells using Bottom fluorescence at an excitation of 410 nanometers and emission of both 450 nanometers and 520 nanometers for blue and green fluorescence respectively.Analyze the results according to the text protocol. This figure demonstrates an example of the cycle threshold value expected from both standards and samples following QPCR to determine the total number of genomes per milliliter in the seven day C.burnetii culture. Based on this data, there were 2.31 times 10 to the eight genomes per milliliter in the 10 milliliter re-suspended bacterial culture.The result to silencing either Rab5A or Rab7A on effector translocation from three independent experiments after incubation of the reversed transfected cells with BlaM substrate is shown here. A significant decrease in the level of BlaM CBU0077 translocation occurred during silencing of both Rab5A and Rab7A compared to OTP control. As demonstrated in this graph, although treatment with either Rab5A or Rab7A results in a reduction in cell viability compared to OTP control, this reduction is not as severe as treatment with PLK1, a gene known to cause cell death when silenced.After watching this video, you should have a good understanding of how to silence specific host targets using siRNA, and subsequently investigate the impact this has on bacterial effector protein translocation using FRET based reporter assay. This protocol has been optimized for both silencing of Rab GTPases in coxieller infection of hela cells. To utilize this method to target other host proteins, transfection conditions require optimization to ensure efficient gene silencing.Similarly to use this method with other bacterial pathogens, infection condition require optimization.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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