This protocol development was supported by the Bill and Melinda Gates Foundation Grand Challenges in Global Health grant 37774. Real-time PCR reagents and advice were provided by Abbott Molecular Inc. Des Plaines, IL. 8E5-LAV cells were provided by the Virology Quality Assurance Laboratory, Rush Presbyterian; St. Luke's Medical Center. HIV-1 negative blood was provided by Core Lab, NorthShore University HealthSystems, Evanston, IL. Thanks to Mark Fisher for photography help.

Ethiek statement: De gehele bloedmonsters die in deze studie worden niet beschouwd als onderzoek waarbij menselijke proefpersonen zijn. De monsters werden verkregen voor klinische diagnostische doeleinden, die zijn voldaan en het resterende gedeelte van deze monsters werd bepaald de FINA onderzoekstest. De monsters werden zodanig dat de onderzoekers waren niet in staat om de identiteit van personen gemakkelijk vaststellen gecodeerd. 1. Voorbereiding van de FINA Monstervoorbereiding Module <ol><li> Bereid vloei...

<ol>
	<li>Byrnes, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+purification+and+concentration+of+DNA+in+porous+membranes+for+point-of-care+applications.">One-step purification and concentration of DNA in porous membranes for point-of-care applications.</a> Lab Chip. 15 (12), 2647-2659 (2015).</li><li>Connelly, J. T., Rolland, J. P., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="Paper+Machine"+for+Molecular+Diagnostics.">"Paper Machine" for Molecular Diagnostics.</a> Anal Chem. 87 (15), 7595-7601 (2015).</li><li>Govindarajan, A. V., Ramachandran, S., Vigil, G. D., Yager, P., Bohringer, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+low+cost+point-of-care+viscous+sample+preparation+device+for+molecular+diagnosis+in+the+developing+world;+an+example+of+microfluidic+origami.">A low cost point-of-care viscous sample preparation device for molecular diagnosis in the developing world; an example of microfluidic origami.</a> Lab Chip. 12 (1), 174-181 (2012).</li><li>Linnes, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paper-based+molecular+diagnostic+for.">Paper-based molecular diagnostic for.</a> RSC Adv. 4 (80), 42245-42251 (2014).</li><li>Rodriguez, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paper-Based+RNA+Extraction,+in+Situ+Isothermal+Amplification,+and+Lateral+Flow+Detection+for+Low-Cost,+Rapid+Diagnosis+of+Influenza+A+(H1N1)+from+Clinical+Specimens.">Paper-Based RNA Extraction, in Situ Isothermal Amplification, and Lateral Flow Detection for Low-Cost, Rapid Diagnosis of Influenza A (H1N1) from Clinical Specimens.</a> Anal Chem. 87 (15), 7872-7879 (2015).</li><li>Peeling, R. W., Holmes, K. K., Mabey, D., Ronald, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+tests+for+sexually+transmitted+infections+(STIs):+the+way+forward.">Rapid tests for sexually transmitted infections (STIs): the way forward.</a> Sex Transm Infect. 82, 1-6 (2006).</li><li>Mabey, D., Peeling, R. W., Ustianowski, A., Perkins, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostics+for+the+developing+world.">Diagnostics for the developing world.</a> Nat Rev Microbiol. 2 (3), 231-240 (2004).</li><li>Jangam, S. R., Agarwal, A. K., Sur, K., Kelso, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+point-of-care+PCR+test+for+HIV-1+detection+in+resource-limited+settings.">A point-of-care PCR test for HIV-1 detection in resource-limited settings.</a> Biosens Bioelectron. 42, 69-75 (2013).</li><li>Jangam, S. R., Yamada, D. H., McFall, S. M., Kelso, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+point-of-care+extraction+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+proviral+DNA+from+whole+blood+for+detection+by+real-time+PCR.">Rapid point-of-care extraction of human immunodeficiency virus type 1 proviral DNA from whole blood for detection by real-time PCR.</a> J Clin Microbiol. 47 (8), 2363-2368 (2009).</li><li>Kelso, D. M., Jangam, S., Yamada, D., McFall, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Google Patents. , (2012).</li><li>McFall, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+and+Rapid+DNA+Extraction+Method+from+Whole+Blood+for+Highly+Sensitive+Detection+and+Quantitation+of+HIV-1+Proviral+DNA+by+Real-Time+PCR.">A Simple and Rapid DNA Extraction Method from Whole Blood for Highly Sensitive Detection and Quantitation of HIV-1 Proviral DNA by Real-Time PCR.</a> Journal of Virological Methods. 214, 37-42 (2015).</li><li>Boom, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+simple+method+for+purification+of+nucleic+acids.">Rapid and simple method for purification of nucleic acids.</a> J Clin Microbiol. 28 (3), 495-503 (1990).</li><li>Radstrom, P., Knutsson, R., Wolffs, P., Lovenklev, M., Lofstrom, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-PCR+processing:+strategies+to+generate+PCR-compatible+samples.">Pre-PCR processing: strategies to generate PCR-compatible samples.</a> Mol Biotechnol. 26 (2), 133-146 (2004).</li><li>Schrader, C., Schielke, A., Ellerbroek, L., Johne, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR+inhibitors+-+occurrence,+properties+and+removal.">PCR inhibitors - occurrence, properties and removal.</a> J Appl Microbiol. 113 (5), 1014-1026 (2012).</li><li>Folks, T. M., Powell, D. M., Martin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Google Patents. , (1991).</li><li>Violari, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+Antiretroviral+Therapy+and+Mortality+among+HIV-Infected+Infants.">Early Antiretroviral Therapy and Mortality among HIV-Infected Infants.</a> N Engl J Med. 359 (21), 2233-2244 (2008).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> World Health Organization. , (2010).</li><li>Gruner, N., Stambouli, O., Ross, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dried+blood+spots--preparing+and+processing+for+use+in+immunoassays+and+in+molecular+techniques.">Dried blood spots--preparing and processing for use in immunoassays and in molecular techniques.</a> J Vis Exp. (97), (2015).</li><li>Maiers, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+investigation+of+fingerstick+blood+collection+for+point-of-care+HIV-1+viral+load+monitoring+in+South+Africa.">An investigation of fingerstick blood collection for point-of-care HIV-1 viral load monitoring in South Africa.</a> S Afr Med J. 105 (3), 228-231 (2015).</li></ol>

EID gekoppeld aan een snelle behandeling toegang is aangetoond kindersterfte verminderen door HIV infectie 16. Vanwege de aanhoudende maternale antilichamen in het bloed van een kind, zijn snelle HIV antilichamentests beperkt nut bij het bepalen van de status van HIV-blootgestelde zuigelingen. De WHO beveelt aan dat alle baby&#39;s van HIV-1-positieve moeders moeten worden getest bij 4-6 weken oud, met een virologisch onderzoek 17. We hebben gemeld de ontwikkeling van een test voor de detectie en k...

Verschillende rapporten hebben de ontwikkeling van papier- of een membraan extractiemethoden voor gebruik behandeld in point-of-care (POC) inrichtingen 1-5 met als doel de uitstekende gevoeligheid en specificiteit van moleculaire diagnostiek voor alle. De World Health Organization (WHO) Seksueel Overdraagbare Aandoeningen Diagnostics initiatief bedacht de term VERZEKERD (Betaalbaar, gevoelig, specifiek, Gebruiksvriendelijk, Snel en Robuust, Apparatuur-vrij en geleverd aan degenen die het nodig hebben) om te beschrijven de ideale kenmerken van een POC -test 6. Van deze richtlijnen, de apparatuur-vrije eigenschap is bijzonder moeilijk te bereiken voor moleculaire diagnostiek. Toch zal elke innovatie op het gebied van de doelstelling van het bereiken van die in de meeste behoefte te bevorderen, en er is hoop voor verbeteringen op korte termijn in testprestaties door aanpassing van bestaande technologie 7. Hier beschrijven we een eenvoudig protocol voor het extraheren van DNA uit vol bloeddat betekent complexe chemie of laboratorium instrumentatie niet nodig. De FINA (filtratie isolatie van nucleïnezuren) monstervoorbereiding methode werd oorspronkelijk ontwikkeld om leukocyt DNA uit volbloed extraheren om de HIV-1 provirus detecteren van een monster te beantwoorden point-of-care (POC) kwantitatieve PCR (qPCR) vroeg zuigeling diagnostische (EID) platform voor gebruik in beperkte resource-instellingen 8-11. FINA extractie verschilt van conventionele zuiveringsmethoden die silicamembranen of met siliciumdioxide beklede paramagnetische deeltjes om reversibel binden van DNA in de aanwezigheid van chaotrope middelen 12. In plaats daarvan gebruikt FINA verticale filtratie via een scheidingsmembraan om cellulaire DNA uit volbloed direct extraheren. Het membraan dat de ingevangen DNA kan direct in een PCR-buis en ofwel direct gebruikt in een PCR-reactie of lucht gedroogd latere amplificatie 9. Nr chaotrope middelen, fenol, of alcoholen gebruikt in de monstername, EliminaTing het uitgebreid wassen stappen die nodig zijn om krachtige qPCR remmers afgeleid van het extractieproces 13,14 verwijderen. De FINA membraan kan zowel cellen 9 of genomisch DNA vrijgemaakt door cellysis 11 voordat het monster wordt toegevoegd aan het membraan vast te leggen. Voor de cel opname, wordt bloed direct toegevoegd aan het membraan. De cellen worden vervolgens in het membraan gelyseerd door toevoeging van 10 mM NaOH. Het voordeel van deze methode is dat het gaat slechts 3 stappen: 1) toevoegen van het monster; 2) cellysis / was en 3) filter disk plaatsing in qPCR buis. Het nadeel van deze methode is dat het membraan slechts een bepaald aantal cellen direct evenredig met de diameter van de membraanschijf kan bevatten. De detectielimiet vereist voor EID bereikt, wordt 100 gl volbloed vereist voor monster ingang die een filter die te groot in een qPCR buis geplaatst meebrengt. Lyseren van de bloedcellen met detergent voor het toevoegen van het monster aan de collectiemembraan ligt een verwerkingsstap, maar maakt het gebruik van een kleinere filter voor dezelfde steekproef. We konden hoge reproduceerbaarheid, enkel exemplaar detectie en kwantificering van slechts 10 kopieën van HIV-1 provirale DNA van 100 pl bloed af met de testconfiguratie 11 tonen. In dit rapport beschrijven we de FINA protocol zoals oorspronkelijk ontwikkeld voor gebruik in het laboratorium. Het membraan / filter sandwich zogenaamde FINA monstervoorbereiding module kunnen worden bereid in grote partijen en opgeslagen voor later gebruik. Wanneer specimens worden geëxtraheerd dit duurt 2 min en kunnen worden uitgevoerd in verschillende grootte batches. De qPCR kan onmiddellijk worden uitgevoerd of de filters die de ingebedde DNA kan worden opgeslagen totdat het handig om qPCR voeren. Deze methode is erg handig voor routine-analyse van monsters in zowel lage als hoge resource-instellingen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="860">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:432px;">Fusion 5</td>
			<td style="width:179px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:104px;">8151-9915</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">707 blotting pad</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>28298-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PARAFILM M</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>52858-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3M Double-Coated Polyester Diagnostic Tape&#160;</td>
			<td>3M Medical Specialties</td>
			<td>9965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">200 &#181;l qPCR strip tubes</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>401428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">optical strip caps</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>401425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mx3005p qPCR System</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>401456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221465</td>
			<td>A.C.S. Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td>BioXtra</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td>for molecular biology</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">fetal bovine serum, certified, U.S. origin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hammer driven small hole punch 3/16&#34; hole diameter (5.1 mm)</td>
			<td>McMaster Carr</td>
			<td>3424A16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hammer driven small hole punch 1/4&#34; hole diameter (7.14 mm)</td>
			<td>McMaster Carr</td>
			<td>3424A19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hammer driven small hole punch 5/16&#34; hole diameter (8.35 mm)</td>
			<td>McMaster Carr</td>
			<td>3424A23</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

filtration isolation of nucleic acids:  a simple and rapid dna extraction method

FINA, filtratie isolatie van nucleïnezuren, is een nieuwe extractie methode die gebruik maakt van verticale filtering via een scheidingsmembraan en absorberend kussen cellulaire DNA uit volbloed extract in minder dan 2 minuten. Het bloedmonster wordt behandeld met detergens, kort gemengd en pipet aangebracht op het scheidingsmembraan. Het lysaat transporteert in de blotting pad door capillaire werking, het vastleggen van het genomische DNA op het oppervlak van het scheidingsmembraan. Het geëxtraheerde DNA wordt vastgehouden op het membraan tijdens een eenvoudige wasstap waarin PCR-remmers zijn goddelozen in het absorberende blotting pad. Het membraan dat de ingevangen DNA wordt vervolgens toegevoegd aan de PCR-reactie zonder verdere zuivering. Deze eenvoudige methode vereist geen laboratorium uitrusting en kunnen eenvoudig worden geïmplementeerd met goedkope laboratorium benodigdheden. Hier beschrijven we een protocol voor zeer gevoelige detectie en kwantificering van HIV-1 provirale DNA van 100 gl volbloed als model voor beginFant diagnose van HIV die gemakkelijk kan worden aangepast aan andere genetische doelwitten.

De workflow voor het extraheren van proviraal DNA uit vol bloed waaraan 8E5-LAV-cellen wordt getoond in Figuur 1. Figuur 2 toont de FINA monster module en bereid qPCR buis. Deze werkwijze maakt efficiënte amplificatie van HIV-1 provirus van 8E5-LAV cellen bij verschillende kopie-aantallen, zoals in de standaardcurve van gezochte monsters (figuur 3). PCR had een rendement van 103%, zoals berekend uit effect = -1 + 10 (-1 / helling)....

Watch this Scientific Journal Video about Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method at JoVE.com

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

We beschrijven hier een eenvoudige en snelle papieren DNA extractiewerkwijze HIV provirale DNA uit vol bloed gedetecteerd met kwantitatieve PCR. Dit protocol kan worden verlengd voor gebruik bij het detecteren andere genetische merkers of alternatieve amplificatiewerkwijzen.

Filtratie Isolatie van nucleïnezuren: Een eenvoudige en snelle DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

Research

JoVE Journal

Biology

NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

NanoDrop microvolume Kwantificering van nucleïnezuren

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional ...

Electricity-Free, Sequential Nucleic Acid and Protein Isolation

Elektriciteit-Free, Sequential nucleïnezuur en eiwit isolatie

Traditional and emerging pathogens such as Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), Yersinia pestis, or prion-based diseases are of significant concern ...

qPCR Is a Sensitive and Rapid Method for Detection of Cytomegaloviral DNA in Formalin-fixed, Paraffin-embedded Biopsy Tissue

qPCR is een gevoelige en snelle methode voor de detectie van Cytomegaloviral DNA in formaline gefixeerde, paraffine-ingebedde biopsieweefsel

It is crucial to identify cytomegalovirus (CMV) infection in the gastrointestinal (GI) tract of immunosuppressed patients, given their greater risk for ...

Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration

Rapid isolatie en zuivering van Mitochondriën voor transplantatie Door Tissue Dissociatie en differentiële Filtratie

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to ...

Sequence-specific Labeling of Nucleic Acids and Proteins with Methyltransferases and Cofactor Analogues

Sequentie-specifieke Labeling van nucleïnezuren en eiwitten met methyltransferases en Cofactor Analogues

S-Adenosyl-l-methionine (AdoMet or SAM)-dependent methyltransferases (MTase) catalyze the transfer of the activated methyl group from AdoMet to specific ...

A Hybrid DNA Extraction Method for the Qualitative and Quantitative Assessment of Bacterial Communities from Poultry Production Samples

Een hybride DNA-extractie methode voor de kwalitatieve en kwantitatieve beoordeling van Bacteriële Gemeenschappen van pluimveeproductie Monsters

The efficacy of DNA extraction protocols can be highly dependent upon both the type of sample being investigated and the types of downstream analyses ...

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Eenvoudige methode voor fluorescentie DNA<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie aan Geplette Chromosomen

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly ...

Simple Bulk Readout of Digital Nucleic Acid Quantification Assays

Eenvoudige Bulk uitlezing van Digital nucleïnezuur kwantificering Testen

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are ...

Efficient Nucleic Acid Extraction and 16S rRNA Gene Sequencing for Bacterial Community Characterization

Efficiënte Nucleic Acid Extraction en 16S rRNA Gene Sequencing voor Bacteriële Gemeenschap karakterisering

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing ...