This protocol development was supported by the Bill and Melinda Gates Foundation Grand Challenges in Global Health grant 37774. Real-time PCR reagents and advice were provided by Abbott Molecular Inc. Des Plaines, IL. 8E5-LAV cells were provided by the Virology Quality Assurance Laboratory, Rush Presbyterian; St. Luke's Medical Center. HIV-1 negative blood was provided by Core Lab, NorthShore University HealthSystems, Evanston, IL. Thanks to Mark Fisher for photography help.

Ethik-Erklärung: Die Vollblut-Proben in dieser Studie verwendet werden, nicht am Menschen zu sein Forschung. Die Proben wurden für klinische Diagnosezwecke erhalten, die erfüllt waren, und der restliche Teil dieser Proben wurde für die FINA Forschungs Assay bereitgestellt. Die Proben wurden so codiert, daß die Forscher die Identität von Personen nicht in der Lage, ohne weiteres festzustellen waren. 1. Herstellung von FINA Probenvorbereitungsmodul <ol><li> Bereiten Sie Pad Blotting eine 35 x 35 mm 2<...

<ol>
	<li>Byrnes, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+purification+and+concentration+of+DNA+in+porous+membranes+for+point-of-care+applications.">One-step purification and concentration of DNA in porous membranes for point-of-care applications.</a> Lab Chip. 15 (12), 2647-2659 (2015).</li><li>Connelly, J. T., Rolland, J. P., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="Paper+Machine"+for+Molecular+Diagnostics.">"Paper Machine" for Molecular Diagnostics.</a> Anal Chem. 87 (15), 7595-7601 (2015).</li><li>Govindarajan, A. V., Ramachandran, S., Vigil, G. D., Yager, P., Bohringer, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+low+cost+point-of-care+viscous+sample+preparation+device+for+molecular+diagnosis+in+the+developing+world;+an+example+of+microfluidic+origami.">A low cost point-of-care viscous sample preparation device for molecular diagnosis in the developing world; an example of microfluidic origami.</a> Lab Chip. 12 (1), 174-181 (2012).</li><li>Linnes, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paper-based+molecular+diagnostic+for.">Paper-based molecular diagnostic for.</a> RSC Adv. 4 (80), 42245-42251 (2014).</li><li>Rodriguez, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paper-Based+RNA+Extraction,+in+Situ+Isothermal+Amplification,+and+Lateral+Flow+Detection+for+Low-Cost,+Rapid+Diagnosis+of+Influenza+A+(H1N1)+from+Clinical+Specimens.">Paper-Based RNA Extraction, in Situ Isothermal Amplification, and Lateral Flow Detection for Low-Cost, Rapid Diagnosis of Influenza A (H1N1) from Clinical Specimens.</a> Anal Chem. 87 (15), 7872-7879 (2015).</li><li>Peeling, R. W., Holmes, K. K., Mabey, D., Ronald, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+tests+for+sexually+transmitted+infections+(STIs):+the+way+forward.">Rapid tests for sexually transmitted infections (STIs): the way forward.</a> Sex Transm Infect. 82, 1-6 (2006).</li><li>Mabey, D., Peeling, R. W., Ustianowski, A., Perkins, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostics+for+the+developing+world.">Diagnostics for the developing world.</a> Nat Rev Microbiol. 2 (3), 231-240 (2004).</li><li>Jangam, S. R., Agarwal, A. K., Sur, K., Kelso, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+point-of-care+PCR+test+for+HIV-1+detection+in+resource-limited+settings.">A point-of-care PCR test for HIV-1 detection in resource-limited settings.</a> Biosens Bioelectron. 42, 69-75 (2013).</li><li>Jangam, S. R., Yamada, D. H., McFall, S. M., Kelso, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+point-of-care+extraction+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+proviral+DNA+from+whole+blood+for+detection+by+real-time+PCR.">Rapid point-of-care extraction of human immunodeficiency virus type 1 proviral DNA from whole blood for detection by real-time PCR.</a> J Clin Microbiol. 47 (8), 2363-2368 (2009).</li><li>Kelso, D. M., Jangam, S., Yamada, D., McFall, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Google Patents. , (2012).</li><li>McFall, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+and+Rapid+DNA+Extraction+Method+from+Whole+Blood+for+Highly+Sensitive+Detection+and+Quantitation+of+HIV-1+Proviral+DNA+by+Real-Time+PCR.">A Simple and Rapid DNA Extraction Method from Whole Blood for Highly Sensitive Detection and Quantitation of HIV-1 Proviral DNA by Real-Time PCR.</a> Journal of Virological Methods. 214, 37-42 (2015).</li><li>Boom, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+simple+method+for+purification+of+nucleic+acids.">Rapid and simple method for purification of nucleic acids.</a> J Clin Microbiol. 28 (3), 495-503 (1990).</li><li>Radstrom, P., Knutsson, R., Wolffs, P., Lovenklev, M., Lofstrom, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-PCR+processing:+strategies+to+generate+PCR-compatible+samples.">Pre-PCR processing: strategies to generate PCR-compatible samples.</a> Mol Biotechnol. 26 (2), 133-146 (2004).</li><li>Schrader, C., Schielke, A., Ellerbroek, L., Johne, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR+inhibitors+-+occurrence,+properties+and+removal.">PCR inhibitors - occurrence, properties and removal.</a> J Appl Microbiol. 113 (5), 1014-1026 (2012).</li><li>Folks, T. M., Powell, D. M., Martin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Google Patents. , (1991).</li><li>Violari, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+Antiretroviral+Therapy+and+Mortality+among+HIV-Infected+Infants.">Early Antiretroviral Therapy and Mortality among HIV-Infected Infants.</a> N Engl J Med. 359 (21), 2233-2244 (2008).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> World Health Organization. , (2010).</li><li>Gruner, N., Stambouli, O., Ross, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dried+blood+spots--preparing+and+processing+for+use+in+immunoassays+and+in+molecular+techniques.">Dried blood spots--preparing and processing for use in immunoassays and in molecular techniques.</a> J Vis Exp. (97), (2015).</li><li>Maiers, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+investigation+of+fingerstick+blood+collection+for+point-of-care+HIV-1+viral+load+monitoring+in+South+Africa.">An investigation of fingerstick blood collection for point-of-care HIV-1 viral load monitoring in South Africa.</a> S Afr Med J. 105 (3), 228-231 (2015).</li></ol>

EID verbunden schnelle Behandlung Zugang hat sich gezeigt , die Kindersterblichkeit zu reduzieren aufgrund einer HIV - Infektion 16. Aufgrund der Persistenz der mütterlichen Antikörper bei einem Säugling Blut haben Dienstprogramm schnellen HIV-Antikörper-Tests begrenzt den Status von HIV-exponierten Neugeborenen bei der Bestimmung. Die WHO empfiehlt , dass alle Kinder von HIV-1 - positiven Müttern geboren sollte bei 4-6 Wochen alt getestet werden, eine virologische Test 17 ​​verwendet wird...

Mehrere Berichte haben die Entwicklung von papier- oder membranbasierten Extraktionsverfahren für die Verwendung in Point-of-Care (POC) -Geräte 1-5 mit dem Ziel, die exquisite Sensitivität und Spezifität der molekularen Diagnostik zur Verfügung zu allen diskutiert. Die Weltgesundheitsorganisation (WHO) Sexuell übertragbare Krankheiten Diagnostics Initiative prägte den Begriff ASSURED (Bezahlbar, empfindlich, spezifisch, benutzerfreundliche, schnelle und robuste, Ausrüstung frei und Lieferung für diejenigen, die es brauchen) die idealen Eigenschaften eines POC zu beschreiben Test 6. Von diesen Richtlinien ist die Ausrüstung freie charakteristische besondere Herausforderung für die molekulare Diagnostik zu erreichen. Jede Innovation auf dem Gebiet wird jedoch voran das Ziel , die in den meisten Bedürftigen erreicht, und es gibt Hoffnung für kurzfristige Verbesserungen der Testleistung von bestehenden Technologie zur Anpassung 7. Hier beschreiben wir ein einfaches Protokoll für die DNA aus Vollblut zu extrahierendass erfordert keine komplexe Chemie oder Laborinstrumente. Die FINA (Filtration Isolierung von Nukleinsäuren) Probenvorbereitung wurde ursprünglich um DNA aus Vollblut zu extrahieren Leukozyten entwickelt, um die HIV-1-Provirus als Teil einer Probe zu beantwortende Point-of-Care (POC) quantitative PCR zu erkennen (qPCR) frühkind Diagnose (EID) Plattform für den Einsatz in begrenzten Ressource - Einstellungen 8-11. FINA Extraktion unterscheidet sich von herkömmlichen Reinigungsverfahren Silikamembranen oder Silika-beschichteten paramagnetischen Partikeln verwenden , um reversibel DNA in Gegenwart von chaotropen Mitteln 12 binden. Stattdessen verwendet FINA vertikale Filtration über eine Trennmembran direkt zelluläre DNA aus Vollblut zu extrahieren. Die Membran , die die eingeschlossene DNA enthält , kann direkt in einem PCR - Röhrchen gegeben werden und entweder sofort in einer PCR - Reaktion oder Luft für die spätere Amplifikation 9 getrocknet eingesetzt. Keine chaotropen Mitteln, Phenol oder Alkohole werden in der Probenextraktion verwendet, eliminating die umfangreichen Waschschritte benötigt starke qPCR - Inhibitoren aus dem Extraktionsprozess 13,14 abgeleitet zu entfernen. Die FINA Membran kann entweder Zellen 9 oder genomische DNA erfassen durch Zelllyse freigesetzt 11 , bevor die Probe auf die Membran gegeben wird. Für die Zell capture wird Vollblut direkt auf die Membran gegeben. Anschließend werden die Zellen in der Membran lysiert durch Zugabe von 10 mM NaOH. Der Vorteil dieser Methode ist, dass es nur drei Schritten durchgeführt: 1) Probenzugabe; 2) Zelllyse / Wäsche und 3) Filterscheibe Platzierung in qPCR Rohr. Der Nachteil dieser Methode ist, dass die Membran nur eine definierte Anzahl von Zellen direkt proportional zum Durchmesser der Membranscheibe halten kann. Um die Nachweisgrenze zu erreichen für EID benötigt wurden 100 ul Vollblut wird für die Probeneingabe erforderlich, die einen Filter beinhaltet, der zu groß ist, in einem qPCR Rohr platziert werden. Lyse der Blutzellen mit einem Reinigungsmittel, bevor die Probe in die Auflistung hinzufügenMembran fügt einen Verarbeitungsschritt, jedoch ermöglicht die Verwendung eines kleineren Filters für die gleiche Probengröße. Wir konnten eine hohe Reproduzierbarkeit, einzelne Kopie Erkennung und Quantifizierung von weniger als 10 Kopien des HIV-1 proviralen DNA von 100 ul Blut Konfiguration 11 mit diesem Test zu demonstrieren. In diesem Bericht beschreiben wir die FINA-Protokoll, wie sie ursprünglich für den Laboreinsatz entwickelt. Die Membran / Filter-Sandwich als FINA Probenvorbereitungsmodul bekannt sind, können in großen Chargen und auf Halde für die spätere Verwendung vorbereitet werden. Wenn die Proben in diesem Prozess, 2 dauert min extrahiert werden und kann in unterschiedlicher Größe Chargen durchgeführt werden. Die qPCR können sofort ausgeführt werden oder die Filter die eingebettete DNA enthalten, können gespeichert werden, bis es bequem ist, qPCR auszuführen. Diese Methode ist sehr bequem für die Routineanalyse von Proben in niedrigen und hohen Ressourceneinstellungen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="860">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:432px;">Fusion 5</td>
			<td style="width:179px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:104px;">8151-9915</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">707 blotting pad</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>28298-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PARAFILM M</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>52858-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3M Double-Coated Polyester Diagnostic Tape&#160;</td>
			<td>3M Medical Specialties</td>
			<td>9965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">200 &#181;l qPCR strip tubes</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>401428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">optical strip caps</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>401425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mx3005p qPCR System</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>401456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221465</td>
			<td>A.C.S. Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td>BioXtra</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td>for molecular biology</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">fetal bovine serum, certified, U.S. origin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hammer driven small hole punch 3/16&#34; hole diameter (5.1 mm)</td>
			<td>McMaster Carr</td>
			<td>3424A16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hammer driven small hole punch 1/4&#34; hole diameter (7.14 mm)</td>
			<td>McMaster Carr</td>
			<td>3424A19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hammer driven small hole punch 5/16&#34; hole diameter (8.35 mm)</td>
			<td>McMaster Carr</td>
			<td>3424A23</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

filtration isolation of nucleic acids:  a simple and rapid dna extraction method

FINA, Filtration Isolierung von Nukleinsäuren, ist ein neuartiges Extraktionsverfahren, das über eine Trennmembran und absorbierendes Kissen zum Extrahieren der zellulären DNA aus Vollblut in weniger als 2 min vertikale Filtration verwendet. Die Blutprobe wird mit einem Detergens, behandelt kurz gemischt und mit einer Pipette auf die Trennmembran aufgebracht. Das Lysat Dochte in die Schreibunterlage aufgrund der Kapillarwirkung, die genomische DNA auf der Oberfläche der Trennmembran zu erfassen. Die extrahierte DNA wird auf die Membran während einer einfachen Waschschritt zurückgehalten, wobei PCR-Inhibitoren Schlechten in das absorbierende Löschblatt sind. Die Membran, die die eingeschlossene DNA enthält, wird dann ohne weitere Reinigung der PCR-Reaktion zugesetzt. Diese einfache Methode nicht Laborausrüstung erfordern und kann leicht mit preiswerten Labormaterialien realisiert werden. Hier beschreiben wir ein Protokoll zum hochempfindlichen Nachweis und die Quantifizierung von HIV-1 proviralen DNA von 100 ul Vollblut als ein Modell für frühfant Diagnose von HIV, die ohne weiteres auf andere genetische Ziele angepasst werden könnte.

Der Workflow für provirale DNA aus Vollblut extrahieren gespickt mit 8E5-LAV - Zellen ist in Abbildung 1 dargestellt. Abbildung 2 zeigt die FINA Probenmodul und vorbereitet qPCR Rohr. Dieses Verfahren ermöglicht eine effiziente Amplifikation von HIV-1 - Provirus von 8E5-LAV - Zellen bei unterschiedlicher Kopienzahl, wie in der Standardkurve von künstlich Proben (Figur 3) dargestellt. PCR hatte einen Wirkungsgrad von 103%, wie aus Effi...

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Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

Wir beschreiben hier ein einfaches und schnelles papierbasierten DNA-Extraktionsverfahren von HIV provirale DNA aus Vollblut durch quantitative PCR nachgewiesen. Dieses Protokoll kann bei der Aufdeckung von anderen genetischen Markern oder alternative Amplifikationsverfahren zur Verwendung verlängert werden.

Filtration Isolierung von Nukleinsäuren: Eine einfache und schnelle DNA-Extraktionsmethode

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

Research

JoVE Journal

Biology

NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

NanoDrop Mikrovolumen Quantifizierung von Nukleinsäuren

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional ...

Forschung

Biologie

Electricity-Free, Sequential Nucleic Acid and Protein Isolation

Strom-Free, Sequential Nukleinsäure-und Protein Isolation

Traditional and emerging pathogens such as Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), Yersinia pestis, or prion-based diseases are of significant concern ...

qPCR Is a Sensitive and Rapid Method for Detection of Cytomegaloviral DNA in Formalin-fixed, Paraffin-embedded Biopsy Tissue

qPCR ist eine empfindliche und schnelle Methode zur Detektion von DNA Zytomegalieviren in Formalin-fixierte, in Paraffin eingebettete Gewebebiopsie

It is crucial to identify cytomegalovirus (CMV) infection in the gastrointestinal (GI) tract of immunosuppressed patients, given their greater risk for ...

Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration

Schnelle Isolierung und Reinigung von Mitochondrien für die Transplantation von Gewebe-Dissoziation und Differential Filtration

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to ...

Sequence-specific Labeling of Nucleic Acids and Proteins with Methyltransferases and Cofactor Analogues

Sequenzspezifische Markierung von Nukleinsäuren und Proteinen mit Methyltransferasen und Cofaktor-Analoga

S-Adenosyl-l-methionine (AdoMet or SAM)-dependent methyltransferases (MTase) catalyze the transfer of the activated methyl group from AdoMet to specific ...

A Hybrid DNA Extraction Method for the Qualitative and Quantitative Assessment of Bacterial Communities from Poultry Production Samples

Ein Hybrid-DNA-Extraktionsmethode für die qualitative und quantitative Bewertung der bakteriellen Gemeinschaften aus Zucht Proben

The efficacy of DNA extraction protocols can be highly dependent upon both the type of sample being investigated and the types of downstream analyses ...

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Einfache Methode zur Fluoreszenz DNA<em&gt; In-situ-</em&gt; Die Hybridisierung an Squashed Chromosomen

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly ...

Simple Bulk Readout of Digital Nucleic Acid Quantification Assays

Einfache Massen Auslesen des digitalen Nukleinsäure Quantifizierung Assays

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are ...

Efficient Nucleic Acid Extraction and 16S rRNA Gene Sequencing for Bacterial Community Characterization

Effiziente Nukleinsäure-Extraktion und 16S rRNA Gen-Sequenzierung für bakterielle Gemeinschaft Charakterisierung

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing ...

A Rapid, Scalable Method for the Isolation, Functional Study, and Analysis of Cell-derived Extracellular Matrix

Eine schnelle, skalierbare Methode für die Isolierung, Funktionelle Untersuchung und Analyse von Zellen abgeleiteten Extrazellulärmatrix

The extracellular matrix (ECM) is recognized as a diverse, dynamic, and complex environment that is involved in multiple cell-physiological and ...