This protocol development was supported by the Bill and Melinda Gates Foundation Grand Challenges in Global Health grant 37774. Real-time PCR reagents and advice were provided by Abbott Molecular Inc. Des Plaines, IL. 8E5-LAV cells were provided by the Virology Quality Assurance Laboratory, Rush Presbyterian; St. Luke's Medical Center. HIV-1 negative blood was provided by Core Lab, NorthShore University HealthSystems, Evanston, IL. Thanks to Mark Fisher for photography help.

הצהרה אתיקה: דגימות דם כולו נעשה שימוש במחקר זה אינם נחשבים מחקר מעורבים בבני אדם. הדגימות התקבלו למטרות אבחון קליניות, אשר היו מרוצות, ואת החלק הנותר של דגימות אלה סופק עבור assay מחקר FINA. הדגימות קודדו כך שהחוקרים לא הצליחו לברר את זהות אנשים בקלות. <p class="jove_title" style=";text-align:right;directi...

<ol>
	<li>Byrnes, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+purification+and+concentration+of+DNA+in+porous+membranes+for+point-of-care+applications.">One-step purification and concentration of DNA in porous membranes for point-of-care applications.</a> Lab Chip. 15 (12), 2647-2659 (2015).</li><li>Connelly, J. T., Rolland, J. P., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="Paper+Machine"+for+Molecular+Diagnostics.">"Paper Machine" for Molecular Diagnostics.</a> Anal Chem. 87 (15), 7595-7601 (2015).</li><li>Govindarajan, A. V., Ramachandran, S., Vigil, G. D., Yager, P., Bohringer, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+low+cost+point-of-care+viscous+sample+preparation+device+for+molecular+diagnosis+in+the+developing+world;+an+example+of+microfluidic+origami.">A low cost point-of-care viscous sample preparation device for molecular diagnosis in the developing world; an example of microfluidic origami.</a> Lab Chip. 12 (1), 174-181 (2012).</li><li>Linnes, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paper-based+molecular+diagnostic+for.">Paper-based molecular diagnostic for.</a> RSC Adv. 4 (80), 42245-42251 (2014).</li><li>Rodriguez, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paper-Based+RNA+Extraction,+in+Situ+Isothermal+Amplification,+and+Lateral+Flow+Detection+for+Low-Cost,+Rapid+Diagnosis+of+Influenza+A+(H1N1)+from+Clinical+Specimens.">Paper-Based RNA Extraction, in Situ Isothermal Amplification, and Lateral Flow Detection for Low-Cost, Rapid Diagnosis of Influenza A (H1N1) from Clinical Specimens.</a> Anal Chem. 87 (15), 7872-7879 (2015).</li><li>Peeling, R. W., Holmes, K. K., Mabey, D., Ronald, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+tests+for+sexually+transmitted+infections+(STIs):+the+way+forward.">Rapid tests for sexually transmitted infections (STIs): the way forward.</a> Sex Transm Infect. 82, 1-6 (2006).</li><li>Mabey, D., Peeling, R. W., Ustianowski, A., Perkins, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostics+for+the+developing+world.">Diagnostics for the developing world.</a> Nat Rev Microbiol. 2 (3), 231-240 (2004).</li><li>Jangam, S. R., Agarwal, A. K., Sur, K., Kelso, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+point-of-care+PCR+test+for+HIV-1+detection+in+resource-limited+settings.">A point-of-care PCR test for HIV-1 detection in resource-limited settings.</a> Biosens Bioelectron. 42, 69-75 (2013).</li><li>Jangam, S. R., Yamada, D. H., McFall, S. M., Kelso, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+point-of-care+extraction+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+proviral+DNA+from+whole+blood+for+detection+by+real-time+PCR.">Rapid point-of-care extraction of human immunodeficiency virus type 1 proviral DNA from whole blood for detection by real-time PCR.</a> J Clin Microbiol. 47 (8), 2363-2368 (2009).</li><li>Kelso, D. M., Jangam, S., Yamada, D., McFall, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Google Patents. , (2012).</li><li>McFall, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+and+Rapid+DNA+Extraction+Method+from+Whole+Blood+for+Highly+Sensitive+Detection+and+Quantitation+of+HIV-1+Proviral+DNA+by+Real-Time+PCR.">A Simple and Rapid DNA Extraction Method from Whole Blood for Highly Sensitive Detection and Quantitation of HIV-1 Proviral DNA by Real-Time PCR.</a> Journal of Virological Methods. 214, 37-42 (2015).</li><li>Boom, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+simple+method+for+purification+of+nucleic+acids.">Rapid and simple method for purification of nucleic acids.</a> J Clin Microbiol. 28 (3), 495-503 (1990).</li><li>Radstrom, P., Knutsson, R., Wolffs, P., Lovenklev, M., Lofstrom, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-PCR+processing:+strategies+to+generate+PCR-compatible+samples.">Pre-PCR processing: strategies to generate PCR-compatible samples.</a> Mol Biotechnol. 26 (2), 133-146 (2004).</li><li>Schrader, C., Schielke, A., Ellerbroek, L., Johne, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR+inhibitors+-+occurrence,+properties+and+removal.">PCR inhibitors - occurrence, properties and removal.</a> J Appl Microbiol. 113 (5), 1014-1026 (2012).</li><li>Folks, T. M., Powell, D. M., Martin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Google Patents. , (1991).</li><li>Violari, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+Antiretroviral+Therapy+and+Mortality+among+HIV-Infected+Infants.">Early Antiretroviral Therapy and Mortality among HIV-Infected Infants.</a> N Engl J Med. 359 (21), 2233-2244 (2008).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> World Health Organization. , (2010).</li><li>Gruner, N., Stambouli, O., Ross, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dried+blood+spots--preparing+and+processing+for+use+in+immunoassays+and+in+molecular+techniques.">Dried blood spots--preparing and processing for use in immunoassays and in molecular techniques.</a> J Vis Exp. (97), (2015).</li><li>Maiers, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+investigation+of+fingerstick+blood+collection+for+point-of-care+HIV-1+viral+load+monitoring+in+South+Africa.">An investigation of fingerstick blood collection for point-of-care HIV-1 viral load monitoring in South Africa.</a> S Afr Med J. 105 (3), 228-231 (2015).</li></ol>

עיד צמוד גישת טיפול מהירה הודגם להפחית תמותת תינוקות עקב זיהום HIV 16. בגלל ההתמדה של נוגדנים אימהיים בתוך הדם של תינוק, בדיקות נוגדנים מהירות HIV יש שימושיות מוגבלת בקביעת מעמדם של תינוקות שנחשפו HIV. ארגון הבריאות העולמי ממליצה כי כל התינוקות שנולדו ל- HIV-1 אמהות חיו...

מספר דיווחים דנו בפיתוח שיטות חילוץ נייר או מבוסס קרום לשימוש Point-of-care (POC) התקנים 1-5 במטרה עושה את הרגישות וסגולית המעודנות של אבחון מולקולרי זמינה לכל. ארגון הבריאות העולמי (WHO) מחלות המועברות במגע מיני יוזמת אבחון טבע את מונח בטיח (משתלמים, רגישים, ספציפית, ידידותי למשתמש, ראפיד וחזק, ציוד ללא ונמסר מי צריכים את זה) כדי לתאר את המאפיינים האידיאליים של POC מבחן 6. הנחיות אלה, המאפיין ללא ציוד מאתגר במיוחד להשגה לאבחון מולקולרי. עם זאת, כל חידוש בתחום יקדם את המטרה להגיע אלה ברוב הצורך, ויש תקווה לשיפורים לטווח קרוב בביצועי בדיקה על ידי התאמת טכנולוגית 7 קיימים. כאן אנו מתארים פרוטוקול פשוט לחילוץ דנ&quot;א מהדם כולושאינו דורש מכשור כימיה או מעבדה מורכבת. FINA (בידוד סינון של חומצות גרעין) שיטת הכנת המדגם פותחה במקור כדי לחלץ DNA לויקוציטים מהדם כולו כדי לזהות את provirus HIV-1 כחלק מדגם עד למענה Point-of-care (POC) PCR כמותי (qPCR) מוקדם התינוק אבחון (עיד) פלטפורמה לשימוש הגדרות משאב מוגבל 8-11. מיצוי FINA נבדל שיטות טיהור קונבנציונליות המשתמשות ממברנות סיליקה או חלקיקים פאראמגנטיים מצופית סיליקה לאגד DNA הפיך בנוכחות סוכני chaotropic 12. במקום זאת, FINA משתמש סינון אנכי דרך קרום הפרדה לחלץ DNA התאי מהדם כולו ישירות. קרום המכיל את DNA בפח יכול להיות ממוקם ישירות בתוך שפופרת PCR ואו מיד בשימוש תגובת PCR או מיובש באוויר הגברה מאוחר יותר 9. אין סביבות chaotropic, פנול, או כהלים משמשים החילוץ המדגם, eliminaטינג שלבי הכביסה הנרחבים צורך להסיר מעכבי qPCR חזקים נגזרו תהליך החילוץ 13,14. קרום FINA יכול ללכוד או תאים 9 או הדנ&quot;א הגנומי ששוחררו על ידי תמוגה תא 11 לפני הדגימה מתווספת הממברנה. עבור ללכוד תאים, דם מלא מתווסף ישירות הממברנה. התאים לאחר מכן הם lysed בקרום ידי הוספת 10 מ&quot;מ NaOH. היתרון בשיטה זו הוא שהיא כוללת רק 3 שלבים: 1) בנוסף מדגם; 2) תמוגה תא / לשטוף 3) מיקום הדיסק מסנן בצינור qPCR. החיסרון בשיטה זו הוא כי קרום יכול להכיל רק מספר מוגדר של תאים ביחס ישר לקוטר של הדיסק הממברנה. כדי להגיע לגבול של זיהוי הנדרש עיד, 100 μl של דם מלא נדרש קלט מדגם הכרוך מסנן כי הוא גדול מדי כדי להיות ממוקם בתוך צינור qPCR. Lysing בתאי הדם עם חומר ניקוי לפני הוספת מדגם לאיסוףקרום מוסיף צעד עיבוד, אך מאפשר שימוש במסנן קטן מאותן גודל המדגם. הצלחנו להוכיח שחזור גבוה, זיהוי עותק יחיד, וכימות קטנה כמו 10 עותקים של דנ&quot;א proviral HIV-1 מ 100 μl של דם באמצעות בדיקה זו תצורה 11. בדו&quot;ח זה, אנו מתארים את פרוטוקול FINA כפי שפותח במקור לשימוש במעבדה. הקרום / מסנן הכריך המכונה מודול הכנת מדגם FINA אפשר להכין סדרות המוניות שנאגר לשימוש מאוחר יותר. כאשר דגימות הן להיעקר תהליך זה לוקח 2 דקות והוא יכול להתבצע משתנה קבוצות גודל. QPCR ניתן להפעיל באופן מיידי או מסננים המכילים את ה- DNA מוטבע ניתן לאחסן עד שהוא נוח לבצע qPCR. שיטה זו נוחה מאוד עבור ניתוח שיגרתי של דגימות בשתי הגדרות משאב נמוכות וגבוהות.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="860">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:432px;">Fusion 5</td>
			<td style="width:179px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:104px;">8151-9915</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">707 blotting pad</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>28298-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PARAFILM M</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>52858-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3M Double-Coated Polyester Diagnostic Tape&#160;</td>
			<td>3M Medical Specialties</td>
			<td>9965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">200 &#181;l qPCR strip tubes</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>401428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">optical strip caps</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>401425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mx3005p qPCR System</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>401456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221465</td>
			<td>A.C.S. Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td>BioXtra</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td>for molecular biology</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">fetal bovine serum, certified, U.S. origin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hammer driven small hole punch 3/16&#34; hole diameter (5.1 mm)</td>
			<td>McMaster Carr</td>
			<td>3424A16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hammer driven small hole punch 1/4&#34; hole diameter (7.14 mm)</td>
			<td>McMaster Carr</td>
			<td>3424A19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hammer driven small hole punch 5/16&#34; hole diameter (8.35 mm)</td>
			<td>McMaster Carr</td>
			<td>3424A23</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

filtration isolation of nucleic acids:  a simple and rapid dna extraction method

FINA, סינון בידוד של חומצות גרעין, היא שיטת חילוץ רומן אשר מנצלת סינון אנכי דרך קרום פרדת כרית ספיגה לחלץ DNA תאי מדם כולו בתוך פחות מ -2 דקות. דגימת דם מטופל עם חומר ניקוי, בקצרה מעורבים ויישומים ידי pipet קרום ההפרדה. את lysate פתילות לתוך הנייר הסופג בשל פעולה נימי, ללכוד את הדנ&quot;א הגנומי על פני השטח של קרום ההפרדה. ה- DNA החילוץ נשמר על הממברנה במהלך שלב לשטוף פשוט שבו מעכבי PCR הם רשעים לתוך הנייר הסופג הסופג. הקרום המכיל את DNA בפח הוא הוסיף אז אל תגובת PCR ללא טיהור נוספת. שיטה פשוטה זו אינה דורשת ציוד מעבדה והוא יכול להיות מיושם בקלות עם ציוד מעבדה יקר. כאן אנו מתארים פרוטוקול עבור זיהוי רגיש מאוד לכמת DNA proviral HIV-1 מ 100 μl כולו דם כמודל מוקדםאבחון פאנט של HIV שיכול להתאים בקלות ליעדים גנטיים אחרים.

זרימת העבודה לחילוץ דנ&quot;א proviral מהדם כולו ומשובץ תאים 8e5-LAV מוצג באיור 1. איור 2 מציג את מודול מדגם FINA והכינו צינור qPCR. שיטה זו מאפשרת הגברה יעילה של provirus HIV-1 מתאי 8e5-LAV במספרי עותק שונים, כפי שמוצגת עקומת התקן של דגימות מאולצות (איו...

Watch this Scientific Journal Video about Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method at JoVE.com

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

אנו מתארים כאן שיטה להפקת DNA פשוטה ומהירה מבוססי נייר של HIV proviral דנ&quot;א שלם דם זוהה על ידי PCR כמותי. פרוטוקול זה יכול להתארך לשימוש באיתור סמנים גנטיים אחרים או בשיטות הגברה חלופיות.

בידוד סינון של חומצות גרעין: שיטת הפקת DNA פשוטה ומהירה

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

Research

JoVE Journal

Biology

NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

NanoDrop Microvolume quantitation של חומצות גרעין

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional ...

Electricity-Free, Sequential Nucleic Acid and Protein Isolation

חשמל חינם, חומצות גרעין רצופות ובידוד חלבון

Traditional and emerging pathogens such as Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), Yersinia pestis, or prion-based diseases are of significant concern ...

qPCR Is a Sensitive and Rapid Method for Detection of Cytomegaloviral DNA in Formalin-fixed, Paraffin-embedded Biopsy Tissue

qPCR הוא שיטה רגישה ומהירה לאיתור של Cytomegaloviral DNA בקבועה פורמלין, רקמות ביופסיה מוטבעות פרפין

It is crucial to identify cytomegalovirus (CMV) infection in the gastrointestinal (GI) tract of immunosuppressed patients, given their greater risk for ...

Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration

בידוד מהיר וטיהור של מיטוכונדריה להשתלה על ידי דיסוציאציה רקמות ודיפרנציאל סינון

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to ...

Sequence-specific Labeling of Nucleic Acids and Proteins with Methyltransferases and Cofactor Analogues

תיוג רצף ספציפי של חומצות גרעין וחלבונים עם Methyltransferases ואנלוגים כקו-פקטורים

S-Adenosyl-l-methionine (AdoMet or SAM)-dependent methyltransferases (MTase) catalyze the transfer of the activated methyl group from AdoMet to specific ...

A Hybrid DNA Extraction Method for the Qualitative and Quantitative Assessment of Bacterial Communities from Poultry Production Samples

הפקת DNA שיטה היברידית להערכה איכותית וכמותית של הקהילות בקטריאלי מדוגמאות ייצור עופות

The efficacy of DNA extraction protocols can be highly dependent upon both the type of sample being investigated and the types of downstream analyses ...

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

שיטה פשוטה DNA הקרינה<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה לכרומוזומים &quot;סתמת

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly ...

Simple Bulk Readout of Digital Nucleic Acid Quantification Assays

Readout גורף פשוט של דיגיטלי מבחני כימות חומצות גרעין

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are ...

Efficient Nucleic Acid Extraction and 16S rRNA Gene Sequencing for Bacterial Community Characterization

הפקת חומצות גרעין יעיל 16S rRNA ג&#39;ין רצף עבור בקטריאלי קהילת אפיון

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing ...