This protocol development was supported by the Bill and Melinda Gates Foundation Grand Challenges in Global Health grant 37774. Real-time PCR reagents and advice were provided by Abbott Molecular Inc. Des Plaines, IL. 8E5-LAV cells were provided by the Virology Quality Assurance Laboratory, Rush Presbyterian; St. Luke's Medical Center. HIV-1 negative blood was provided by Core Lab, NorthShore University HealthSystems, Evanston, IL. Thanks to Mark Fisher for photography help.

윤리 문 : 본 연구에 사용 된 전체 혈액 표본은 인체를 이용한 연구로 간주되지 않습니다. 시편은 만족 임상 진단 목적을 위해 수득하고,이 시험편의 나머지 부분은 FINA 연구 시험에 제공 하였다. 시편은 연구자 용이 개인의 신원을 확인할 수 없었다되도록 부호화 하였다. FINA 샘플 준비 모듈 1. 준비 <ol><li> A A 2.6 mm의 35 X 35 mm 2 두께의 100 % 코튼 패드를 절단하여 패드를 모래 바닥 준?...

<ol>
	<li>Byrnes, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+purification+and+concentration+of+DNA+in+porous+membranes+for+point-of-care+applications.">One-step purification and concentration of DNA in porous membranes for point-of-care applications.</a> Lab Chip. 15 (12), 2647-2659 (2015).</li><li>Connelly, J. T., Rolland, J. P., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="Paper+Machine"+for+Molecular+Diagnostics.">"Paper Machine" for Molecular Diagnostics.</a> Anal Chem. 87 (15), 7595-7601 (2015).</li><li>Govindarajan, A. V., Ramachandran, S., Vigil, G. D., Yager, P., Bohringer, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+low+cost+point-of-care+viscous+sample+preparation+device+for+molecular+diagnosis+in+the+developing+world;+an+example+of+microfluidic+origami.">A low cost point-of-care viscous sample preparation device for molecular diagnosis in the developing world; an example of microfluidic origami.</a> Lab Chip. 12 (1), 174-181 (2012).</li><li>Linnes, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paper-based+molecular+diagnostic+for.">Paper-based molecular diagnostic for.</a> RSC Adv. 4 (80), 42245-42251 (2014).</li><li>Rodriguez, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paper-Based+RNA+Extraction,+in+Situ+Isothermal+Amplification,+and+Lateral+Flow+Detection+for+Low-Cost,+Rapid+Diagnosis+of+Influenza+A+(H1N1)+from+Clinical+Specimens.">Paper-Based RNA Extraction, in Situ Isothermal Amplification, and Lateral Flow Detection for Low-Cost, Rapid Diagnosis of Influenza A (H1N1) from Clinical Specimens.</a> Anal Chem. 87 (15), 7872-7879 (2015).</li><li>Peeling, R. W., Holmes, K. K., Mabey, D., Ronald, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+tests+for+sexually+transmitted+infections+(STIs):+the+way+forward.">Rapid tests for sexually transmitted infections (STIs): the way forward.</a> Sex Transm Infect. 82, 1-6 (2006).</li><li>Mabey, D., Peeling, R. W., Ustianowski, A., Perkins, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostics+for+the+developing+world.">Diagnostics for the developing world.</a> Nat Rev Microbiol. 2 (3), 231-240 (2004).</li><li>Jangam, S. R., Agarwal, A. K., Sur, K., Kelso, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+point-of-care+PCR+test+for+HIV-1+detection+in+resource-limited+settings.">A point-of-care PCR test for HIV-1 detection in resource-limited settings.</a> Biosens Bioelectron. 42, 69-75 (2013).</li><li>Jangam, S. R., Yamada, D. H., McFall, S. M., Kelso, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+point-of-care+extraction+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+proviral+DNA+from+whole+blood+for+detection+by+real-time+PCR.">Rapid point-of-care extraction of human immunodeficiency virus type 1 proviral DNA from whole blood for detection by real-time PCR.</a> J Clin Microbiol. 47 (8), 2363-2368 (2009).</li><li>Kelso, D. M., Jangam, S., Yamada, D., McFall, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Google Patents. , (2012).</li><li>McFall, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+and+Rapid+DNA+Extraction+Method+from+Whole+Blood+for+Highly+Sensitive+Detection+and+Quantitation+of+HIV-1+Proviral+DNA+by+Real-Time+PCR.">A Simple and Rapid DNA Extraction Method from Whole Blood for Highly Sensitive Detection and Quantitation of HIV-1 Proviral DNA by Real-Time PCR.</a> Journal of Virological Methods. 214, 37-42 (2015).</li><li>Boom, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+simple+method+for+purification+of+nucleic+acids.">Rapid and simple method for purification of nucleic acids.</a> J Clin Microbiol. 28 (3), 495-503 (1990).</li><li>Radstrom, P., Knutsson, R., Wolffs, P., Lovenklev, M., Lofstrom, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-PCR+processing:+strategies+to+generate+PCR-compatible+samples.">Pre-PCR processing: strategies to generate PCR-compatible samples.</a> Mol Biotechnol. 26 (2), 133-146 (2004).</li><li>Schrader, C., Schielke, A., Ellerbroek, L., Johne, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR+inhibitors+-+occurrence,+properties+and+removal.">PCR inhibitors - occurrence, properties and removal.</a> J Appl Microbiol. 113 (5), 1014-1026 (2012).</li><li>Folks, T. M., Powell, D. M., Martin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Google Patents. , (1991).</li><li>Violari, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+Antiretroviral+Therapy+and+Mortality+among+HIV-Infected+Infants.">Early Antiretroviral Therapy and Mortality among HIV-Infected Infants.</a> N Engl J Med. 359 (21), 2233-2244 (2008).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> World Health Organization. , (2010).</li><li>Gruner, N., Stambouli, O., Ross, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dried+blood+spots--preparing+and+processing+for+use+in+immunoassays+and+in+molecular+techniques.">Dried blood spots--preparing and processing for use in immunoassays and in molecular techniques.</a> J Vis Exp. (97), (2015).</li><li>Maiers, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+investigation+of+fingerstick+blood+collection+for+point-of-care+HIV-1+viral+load+monitoring+in+South+Africa.">An investigation of fingerstick blood collection for point-of-care HIV-1 viral load monitoring in South Africa.</a> S Afr Med J. 105 (3), 228-231 (2015).</li></ol>

빠른 치료 액세스 링크 EID 의한 HIV 감염 16 유아 사망률 감소하는 것으로 입증되었다. 때문에 유아의 혈액 모체 항체의 지속성 신속 HIV 항체 테스트는 HIV에 노출 된 유아의 상태를 결정하는 유틸리티를 제한하고있다. 보건기구 (WHO)는 HIV-1 양성 산모에게서 태어난 모든 유아는 바이러스 학적 검사 (17)를 사용하여, 연령 4 ~ 6 주에 테스트해야하는 것이 좋습니다. 우리는 (61) 남아프리?...

여러 보고서를 모두 사용할 수있는 절묘한 감성과 분자 진단의 특이성을 목적으로 현장 진료 (POC) 장치 1-5 사용하기 위해 종이 - 또는 멤브레인 기반 추출 방법의 개발을 논의했다. 세계 보건기구 (WHO) 성병 진단 이니셔티브는 POC의 (경제적, 민감한, 특정, 사용자 친화적 인, 신속하고 강력한 장비가없는 그것을 필요로하는 사람들 배달)을 설명하는 이상적인 특성 안심 용어를 만들어 낸 시험 6. 이 가이드 라인 중 장비가없는 특징은 분자 진단 달성하기 위해 특히 도전이다. 그러나, 필드에있는 모든 혁신은 가장 필요로하는 사람들을 도달 목표를 진행하며, 희망은 기존의 기술 (7)을 적용하여 테스트 성능을 단기적 개선이 있습니다. 여기에서 우리는 전체 혈액에서 DNA를 추출하는 간단한 프로토콜을 설명그 복잡한 화학 또는 실험실 장비를 필요로하지 않습니다. FINA (핵산 여과 분리) 시료의 제조 방법은 원래 샘플에 응답 케어 포인트 (POC)의 일부 정량적 PCR 같이 HIV-1 프로 바이러스를 검출하기 위해 전혈로부터 백혈구 DNA를 추출하기 위해 개발 된 제한된 리소스 설정 8-11에 사용 (qPCR에) 초기 유아 진단 (EID) 플랫폼입니다. FINA 추출 가역적 카오 트로픽 제 (12)의 존재 하에서 DNA 결합 실리카 막, 실리카 코팅 된 상자성 입자를 사용하는 종래의 정제 방법과 다르다. 대신, FINA 직접 전체 혈액에서 세포의 DNA를 추출하기 위해 분리막을 통해 수직 여과를 사용합니다. 혼입 된 DNA를 함유하는 멤브레인은 PCR 튜브에 직접 배치 및 하나 이후 즉시 증폭 9 건조 PCR 반응 또는 공기를 사용할 수있다. 어떤 카오 트로픽 제, 페놀 또는 알코올이 샘플의 추출에 이용되지 않으며, elimina팅 추출 처리 (13, 14)로부터 유도 qPCR의 강력한 억제제를 제거하기 위해 필요한 광범위한 세척 단계. FINA 막을 시험편 멤브레인에 추가되기 전에 세포 용해 (11)에 의해 해방 된 세포 중 9 또는 게놈 DNA를 포착 할 수있다. 셀 캡처, 전체 피가 막에 직접 추가됩니다. 세포를이어서 10 mM의 수산화 나트륨을 첨가함으로써 막에 용해된다. 이 방법의 장점은 단지 3 단계를 포함하는 것이있다 : 1) 샘플을 첨가하는 단계; qPCR에 관 2) 세포 용해 / 세척 및 3) 필터 디스크 위치. 이 방법의 단점은 막 만의 막 디스크의 직경에 비례 셀들의 정의 된 번호를 저장할 수 있다는 것이다. EID 필요한 검출 한계에 도달하기 전혈 100 μL은 qPCR에 튜브를 배치하기에 너무 큰 필터를 수반 샘플 입력을 요구한다. 컬렉션에 추가하기 전에 샘플을 세제로 혈액 세포를 용균막을 처리하는 단계를 추가하지만 동일한 샘플 크기보다 작은 필터를 사용할 수있다. 우리는 높은 재현성, 단일 복사본 검출하고,이 테스트 구성 (11)를 사용하여 혈액 100 ㎕에서 HIV-1 프로 바이러스의 DNA의 한 작은 10 복사본의 정량을 입증 할 수 있었다. 이 보고서에서 우리는 원래 실험실 사용하기 위해 개발로 FINA 프로토콜을 설명합니다. FINA 시료 전처리 모듈로 알려진 막 / 필터 샌드위치 큰 일괄 적으로 준비하고 나중에 사용하기 위해 비축 할 수있다. 표본 경우이 과정이 2 분 소요 크기의 배치를 변화에서 수행 할 수 있습니다 추​​출 할 수 있습니다. qPCR에 바로 실행될 수 있거나 qPCR을 수행하는 것이 편리 할 때까지 삽입 된 DNA를 함유하는 필터를 저장할 수있다. 이 방법은 낮은과 높은 리소스 설정 모두에서 시료의 일상적인 분석을위한 매우 편리합니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="860">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:432px;">Fusion 5</td>
			<td style="width:179px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:104px;">8151-9915</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">707 blotting pad</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>28298-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PARAFILM M</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>52858-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3M Double-Coated Polyester Diagnostic Tape&#160;</td>
			<td>3M Medical Specialties</td>
			<td>9965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">200 &#181;l qPCR strip tubes</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>401428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">optical strip caps</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>401425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mx3005p qPCR System</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>401456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221465</td>
			<td>A.C.S. Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td>BioXtra</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td>for molecular biology</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">fetal bovine serum, certified, U.S. origin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hammer driven small hole punch 3/16&#34; hole diameter (5.1 mm)</td>
			<td>McMaster Carr</td>
			<td>3424A16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hammer driven small hole punch 1/4&#34; hole diameter (7.14 mm)</td>
			<td>McMaster Carr</td>
			<td>3424A19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hammer driven small hole punch 5/16&#34; hole diameter (8.35 mm)</td>
			<td>McMaster Carr</td>
			<td>3424A23</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

filtration isolation of nucleic acids:  a simple and rapid dna extraction method

FINA 핵산 여과 분리 미만에서 2 분에 전혈 세포에서 DNA를 추출 분리막 및 흡수 패드를 통해 여과에 수직을 이용하는 신규 추출법이다. 혈액 시료는 세제 혼합 간단히 처리 및 분리막을 피펫에 의해 적용된다. 해물이 분리막의 표면에, 게놈 DNA를 캡처, 모세관 현상에 의한 블롯 패드에 심지. 추출 된 DNA는 PCR 억제제 흡수 블롯 패드에 악 상기 간단한 세척 단계 동안 막에 유지된다. 혼입 된 DNA를 함유하는 멤브레인은 추가의 정제없이 PCR 반응에 첨가된다. 이러한 간단한 방법은 실험 장비를 필요로하지 않고 쉽게 저렴 실험실 용품으로 구현 될 수있다. 여기에서 우리는 초기의 모델로 100 μL 전체 혈액에서 HIV-1 프로 바이러스의 DNA의 고감도 검출 및 정량을위한 프로토콜을 설명쉽게 다른 유전 적 목표에 적용 할 수있는 HIV의 영아 진단.

8e5 - LAV 세포 아군 전체 혈액에서 프로 바이러스 DNA를 추출하기위한 워크 플로는 그림 1과 같다. 2는 FINA 샘플 모듈을 보여주고 qPCR에 튜브를 준비 그림. 인위적인 시험편 (도 3)의 표준 곡선에 도시 된 바와 같이,이 방법은 다른 사본 번호에 8e5-LAV 세포에서 HIV-1 프로 바이러스의 효율적인 증폭을 허용한다. PCR 효율 = -1 + 10 <s...

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Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

우리는 여기에서 정량적 PCR에 의해 검출 된 전혈로부터 HIV 프로 바이러스 DNA의 단순하고 신속한 종이 기반의 DNA 추출 방법을 설명한다. 이 프로토콜의 다른 유전자 마커의 검출 또는 다른 증폭 방법을 이용하여 사용하기 위해 확장 될 수있다.

핵산의 여과 분리 : 간단하고 신속한 DNA 추출 방법

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

Research

JoVE Journal

Biology

NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

핵산의 NanoDrop Microvolume의 Quantitation

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional ...

연구

생물학

Electricity-Free, Sequential Nucleic Acid and Protein Isolation

전기 - 무료, 선형 핵산 및 단백질 분리

Traditional and emerging pathogens such as Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), Yersinia pestis, or prion-based diseases are of significant concern ...

qPCR Is a Sensitive and Rapid Method for Detection of Cytomegaloviral DNA in Formalin-fixed, Paraffin-embedded Biopsy Tissue

qPCR에 포르말린 고정, 파라핀 - 임베디드 생검 조직에서 Cytomegaloviral DNA의 검출에 대한 민감하고 빠른 방법입니다

It is crucial to identify cytomegalovirus (CMV) infection in the gastrointestinal (GI) tract of immunosuppressed patients, given their greater risk for ...

Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration

조직 해리 차동 여과 이식 미토콘드리아의 신속한 분리 및 정제

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to ...

Sequence-specific Labeling of Nucleic Acids and Proteins with Methyltransferases and Cofactor Analogues

Methyltransferases과 공동 인자 유사체와 핵산과 단백질의 순서 특정 레이블

S-Adenosyl-l-methionine (AdoMet or SAM)-dependent methyltransferases (MTase) catalyze the transfer of the activated methyl group from AdoMet to specific ...

A Hybrid DNA Extraction Method for the Qualitative and Quantitative Assessment of Bacterial Communities from Poultry Production Samples

가금류 생산 샘플에서 세균 공동체의 정성 및 정량 평가를위한 하이브리드 DNA 추출 방법

The efficacy of DNA extraction protocols can be highly dependent upon both the type of sample being investigated and the types of downstream analyses ...

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

형광 DNA를위한 간단한 방법<em&gt; 현장에서</em&gt; 숙청 염색체에 하이브리드

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly ...

Simple Bulk Readout of Digital Nucleic Acid Quantification Assays

디지털 핵산 정량 분석​​ 실험의 단순 대량 판독

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are ...

Efficient Nucleic Acid Extraction and 16S rRNA Gene Sequencing for Bacterial Community Characterization

세균 커뮤니티 특성화에 대한 효율적인 핵산 추출 및 16S rRNA의 유전자 시퀀싱

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing ...

A Rapid, Scalable Method for the Isolation, Functional Study, and Analysis of Cell-derived Extracellular Matrix

세포 유래 세포 외 매트릭스의 빠른, 분리, 기능 연구에 대한 확장 방법, 및 분석

The extracellular matrix (ECM) is recognized as a diverse, dynamic, and complex environment that is involved in multiple cell-physiological and ...