This protocol development was supported by the Bill and Melinda Gates Foundation Grand Challenges in Global Health grant 37774. Real-time PCR reagents and advice were provided by Abbott Molecular Inc. Des Plaines, IL. 8E5-LAV cells were provided by the Virology Quality Assurance Laboratory, Rush Presbyterian; St. Luke's Medical Center. HIV-1 negative blood was provided by Core Lab, NorthShore University HealthSystems, Evanston, IL. Thanks to Mark Fisher for photography help.

Etikk uttalelse: Den fullblodprøver som brukes i denne studien er ikke ansett for å være forskning som omfatter mennesker. Prøvene ble oppnådd for kliniske diagnostiske formål, som ble oppfylt, og den gjenværende del av disse prøvene ble levert for FINA forskning analysen. Prøvene ble kodet slik at undersøkerne ikke var i stand til lett å fastslå identiteten av individer. 1. Utarbeidelse av FINA Prøvepreparering Module <ol><li> Forbered blotting puten ved å kutte en 35 x 35 mm 2 av en ...

<ol>
	<li>Byrnes, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+purification+and+concentration+of+DNA+in+porous+membranes+for+point-of-care+applications.">One-step purification and concentration of DNA in porous membranes for point-of-care applications.</a> Lab Chip. 15 (12), 2647-2659 (2015).</li><li>Connelly, J. T., Rolland, J. P., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="Paper+Machine"+for+Molecular+Diagnostics.">"Paper Machine" for Molecular Diagnostics.</a> Anal Chem. 87 (15), 7595-7601 (2015).</li><li>Govindarajan, A. V., Ramachandran, S., Vigil, G. D., Yager, P., Bohringer, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+low+cost+point-of-care+viscous+sample+preparation+device+for+molecular+diagnosis+in+the+developing+world;+an+example+of+microfluidic+origami.">A low cost point-of-care viscous sample preparation device for molecular diagnosis in the developing world; an example of microfluidic origami.</a> Lab Chip. 12 (1), 174-181 (2012).</li><li>Linnes, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paper-based+molecular+diagnostic+for.">Paper-based molecular diagnostic for.</a> RSC Adv. 4 (80), 42245-42251 (2014).</li><li>Rodriguez, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paper-Based+RNA+Extraction,+in+Situ+Isothermal+Amplification,+and+Lateral+Flow+Detection+for+Low-Cost,+Rapid+Diagnosis+of+Influenza+A+(H1N1)+from+Clinical+Specimens.">Paper-Based RNA Extraction, in Situ Isothermal Amplification, and Lateral Flow Detection for Low-Cost, Rapid Diagnosis of Influenza A (H1N1) from Clinical Specimens.</a> Anal Chem. 87 (15), 7872-7879 (2015).</li><li>Peeling, R. W., Holmes, K. K., Mabey, D., Ronald, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+tests+for+sexually+transmitted+infections+(STIs):+the+way+forward.">Rapid tests for sexually transmitted infections (STIs): the way forward.</a> Sex Transm Infect. 82, 1-6 (2006).</li><li>Mabey, D., Peeling, R. W., Ustianowski, A., Perkins, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostics+for+the+developing+world.">Diagnostics for the developing world.</a> Nat Rev Microbiol. 2 (3), 231-240 (2004).</li><li>Jangam, S. R., Agarwal, A. K., Sur, K., Kelso, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+point-of-care+PCR+test+for+HIV-1+detection+in+resource-limited+settings.">A point-of-care PCR test for HIV-1 detection in resource-limited settings.</a> Biosens Bioelectron. 42, 69-75 (2013).</li><li>Jangam, S. R., Yamada, D. H., McFall, S. M., Kelso, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+point-of-care+extraction+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+proviral+DNA+from+whole+blood+for+detection+by+real-time+PCR.">Rapid point-of-care extraction of human immunodeficiency virus type 1 proviral DNA from whole blood for detection by real-time PCR.</a> J Clin Microbiol. 47 (8), 2363-2368 (2009).</li><li>Kelso, D. M., Jangam, S., Yamada, D., McFall, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Google Patents. , (2012).</li><li>McFall, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+and+Rapid+DNA+Extraction+Method+from+Whole+Blood+for+Highly+Sensitive+Detection+and+Quantitation+of+HIV-1+Proviral+DNA+by+Real-Time+PCR.">A Simple and Rapid DNA Extraction Method from Whole Blood for Highly Sensitive Detection and Quantitation of HIV-1 Proviral DNA by Real-Time PCR.</a> Journal of Virological Methods. 214, 37-42 (2015).</li><li>Boom, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+simple+method+for+purification+of+nucleic+acids.">Rapid and simple method for purification of nucleic acids.</a> J Clin Microbiol. 28 (3), 495-503 (1990).</li><li>Radstrom, P., Knutsson, R., Wolffs, P., Lovenklev, M., Lofstrom, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-PCR+processing:+strategies+to+generate+PCR-compatible+samples.">Pre-PCR processing: strategies to generate PCR-compatible samples.</a> Mol Biotechnol. 26 (2), 133-146 (2004).</li><li>Schrader, C., Schielke, A., Ellerbroek, L., Johne, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR+inhibitors+-+occurrence,+properties+and+removal.">PCR inhibitors - occurrence, properties and removal.</a> J Appl Microbiol. 113 (5), 1014-1026 (2012).</li><li>Folks, T. M., Powell, D. M., Martin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Google Patents. , (1991).</li><li>Violari, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+Antiretroviral+Therapy+and+Mortality+among+HIV-Infected+Infants.">Early Antiretroviral Therapy and Mortality among HIV-Infected Infants.</a> N Engl J Med. 359 (21), 2233-2244 (2008).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> World Health Organization. , (2010).</li><li>Gruner, N., Stambouli, O., Ross, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dried+blood+spots--preparing+and+processing+for+use+in+immunoassays+and+in+molecular+techniques.">Dried blood spots--preparing and processing for use in immunoassays and in molecular techniques.</a> J Vis Exp. (97), (2015).</li><li>Maiers, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+investigation+of+fingerstick+blood+collection+for+point-of-care+HIV-1+viral+load+monitoring+in+South+Africa.">An investigation of fingerstick blood collection for point-of-care HIV-1 viral load monitoring in South Africa.</a> S Afr Med J. 105 (3), 228-231 (2015).</li></ol>

EID knyttet til rask behandling tilgang har vist seg å redusere barnedødeligheten på grunn av HIV-infeksjon 16. På grunn av utholdenhet av mors antistoffer i et barns blod, har raske HIV-antistofftester begrenset nytte i å bestemme status for HIV-utsatte spedbarn. WHO anbefaler at alle barn født av HIV-1-positive mødre bør testes ved 4-6 ukers alder, ved hjelp av en virologiske test 17. Vi har rapportert utvikling av en analyse for påvisning og kvantifisering av HIV-1 førvirus DNA i fullb...

Flere rapporter har beskrevet utviklingen av papir- eller membran-baserte ekstraksjonsmetoder for anvendelse i point-of-care (POC) anordninger 1-5 med sikte på å gjøre den utsøkte sensitivitet og spesifisitet av molekylær diagnose tilgjengelig for alle. Verdens helseorganisasjon (WHO) Seksuelt overførbare sykdommer Diagnostikk Initiative innførte begrepet FORSIKRET (rimelig, følsom, Specific, brukervennlig, rask og robust, Utstyr fritt og levert til de som trenger det) for å beskrive den ideelle egenskapene til en POC test 6. Av disse retningslinjene, er utstyret fritt karakteristisk spesielt utfordrende å oppnå for molekylær diagnostikk. Imidlertid vil alle innovasjon innen fremme målet er å nå de som er i de fleste behov, og det er håp for nær sikt forbedringer i testytelse ved å tilpasse eksisterende teknologi 7. Her beskriver vi en enkel protokoll for å ekstrahere DNA fra fullblodsom ikke krever kompleks kjemi eller laboratorium instrumentering. FINA (filtrering isolering av nukleinsyrer) prøvepreparering fremgangsmåte ble opprinnelig utviklet for å ekstrahere leukocytt-DNA fra helblod for å påvise HIV-1 provirus som en del av en prøve-til-svar point-of-care (POC) kvantitativ PCR (qPCR) tidlig spedbarn diagnostisk (EID) plattform for bruk i begrensede ressursinnstillinger 8-11. FINA ekstraksjon skiller seg fra konvensjonelle rensemetoder som anvender silika membraner eller silika-belagte paramagnetiske partikler for å reversibelt binde DNA i nærvær av kaotropiske midler 12. I stedet bruker FINA vertikal filtrering gjennom et separasjonsmembran for å ekstrahere cellulært DNA fra helblod direkte. Membranen inneholdende innesluttet DNA kan plasseres direkte i en PCR-rør og enten umiddelbart anvendt i en PCR-reaksjon eller lufttørket for senere forsterkning 9. Det er ingen kaotropiske midler, fenol, eller alkoholer anvendes i prøven ekstraksjon, eliminating de omfattende vasketrinn for å fjerne potente qPCR hemmere avledet fra utpakkingen 13,14. FINA Membranen kan fange enten cellene 9 eller genomisk DNA som frigjøres av 11 cellelyse før prøven ble tilsatt til membranen. For cellen fangst, blir fullblod tilsettes direkte til membranen. Cellene ble deretter lysert i membranen ved tilsetning av 10 mM NaOH. Fordelen med denne metoden er at den bare omfatter tre trinn: 1) prøvetilsetning; 2) cellelyse / vask og 3) filterskive plassering i qPCR rør. Ulempen med denne metoden er at membranen kan bare inneholde et definert antall celler direkte proporsjonale med diameteren av membranplaten. For å komme til påvisningsgrensen som er nødvendig for EID, blir 100 ul helblod som kreves for prøveinngang som medfører et filter som er for stor til å bli plassert i et rør qPCR. Lysering av blodlegemene med vaskemiddel før tilsetning av prøven til samlingenMembranen tilfører et behandlingstrinn, men tillater bruk av en mindre filter for den samme prøvestørrelse. Vi var i stand til å demonstrere høy reproduserbarhet, enkelt eksemplar deteksjon og kvantifisering av så lite som 10 kopier av HIV-1 førvirus DNA fra 100 mL av blod ved hjelp av denne testkonfigurasjon 11. I denne rapporten beskriver vi FINA protokoll som opprinnelig ble utviklet for laboratoriebruk. Membran / filter-sandwich kjent som FINA prøvepreparering modulen kan fremstilles i store serier og stockpiled for senere bruk. Når prøvene er som skal ekstraheres denne prosessen tar 2 min, og kan utføres i varierende størrelse grupper. QPCR kan kjøres umiddelbart eller filtrene som inneholdt det innebygde DNA kan lagres inntil det er praktisk å utføre qPCR. Denne metoden er svært praktisk for rutinemessig analyse av prøver i både lave og høye ressursinnstillinger.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="860">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:432px;">Fusion 5</td>
			<td style="width:179px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:104px;">8151-9915</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">707 blotting pad</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>28298-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PARAFILM M</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>52858-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3M Double-Coated Polyester Diagnostic Tape&#160;</td>
			<td>3M Medical Specialties</td>
			<td>9965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">200 &#181;l qPCR strip tubes</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>401428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">optical strip caps</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>401425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mx3005p qPCR System</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>401456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221465</td>
			<td>A.C.S. Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td>BioXtra</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td>for molecular biology</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">fetal bovine serum, certified, U.S. origin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hammer driven small hole punch 3/16&#34; hole diameter (5.1 mm)</td>
			<td>McMaster Carr</td>
			<td>3424A16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hammer driven small hole punch 1/4&#34; hole diameter (7.14 mm)</td>
			<td>McMaster Carr</td>
			<td>3424A19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hammer driven small hole punch 5/16&#34; hole diameter (8.35 mm)</td>
			<td>McMaster Carr</td>
			<td>3424A23</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

filtration isolation of nucleic acids:  a simple and rapid dna extraction method

FINA, filtrering isolering av nukleinsyrer, er en ny ekstraksjon fremgangsmåte som anvender vertikale filtrering via en separasjonsmembran og absorberende pute for å ekstrahere cellulært DNA fra fullblod i løpet av mindre enn 2 min. Den blodprøven behandles med vaskemiddel, kort blandet og anvendt med pipette til separasjonsmembran. Lysatet transporterer inn mot blotting puten på grunn av kapillarvirkning, fange det genomiske DNA på overflaten av separasjonsmembranen. Den ekstraherte DNA holdes tilbake på membranen i løpet av en enkel vasketrinn hvor PCR-inhibitorer er onde inn i den absorberende puten blotting. Membranen inneholdende innesluttet DNA blir deretter tilsatt til PCR-reaksjonen uten ytterligere rensing. Denne enkle metoden krever ikke laboratorieutstyr og kan enkelt implementeres med rimelige laboratoriet leverer. Her beskriver vi en protokoll for svært følsom påvisning og kvantifisering av HIV-1 proviralt DNA i 100 ul helblod som en modell for tidligFant diagnose av HIV som kan lett kan tilpasses til andre genetiske mål.

Den arbeidsflyt for ekstrahering av proviralt DNA fra fullblod tilsatt 8E5-LAV-celler er vist i figur 1. Figur 2 viser FINA prøvemodul og fremstilt qPCR rør. Denne metoden gjør det mulig for effektiv amplifikasjon av HIV-1-provirus fra 8E5-LAV-celler ved forskjellige kopiantall, som vist i standardkurve for contrived prøver (figur 3). PCR hadde en effektivitet på 103%, beregnet fra Effektivitet = -1 + 10 (-1 / skråning)....

Watch this Scientific Journal Video about Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method at JoVE.com

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

Vi beskriver her en enkel og hurtig papirbaserte DNA-ekstraksjon fremgangsmåte for HIV proviralt DNA fra helblod detektert ved kvantitativ PCR. Denne protokollen kan utvides for bruk i å oppdage andre genetiske markører eller ved hjelp av alternative forsterkningsmetoder.

Filtrering Isolering av nukleinsyrer: En enkel og Rapid DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

Research

JoVE Journal

Biology

NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional ...

Electricity-Free, Sequential Nucleic Acid and Protein Isolation

Elektrisitet-Free, Sekvensiell nukleinsyre-og Protein Isolation

Traditional and emerging pathogens such as Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), Yersinia pestis, or prion-based diseases are of significant concern ...

qPCR Is a Sensitive and Rapid Method for Detection of Cytomegaloviral DNA in Formalin-fixed, Paraffin-embedded Biopsy Tissue

qPCR er en følsom og rask metode for påvisning av Cytomegaloviruspneumonitt DNA i formalinfiksert, parafin-embedded vevsprøver

It is crucial to identify cytomegalovirus (CMV) infection in the gastrointestinal (GI) tract of immunosuppressed patients, given their greater risk for ...

Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration

Rapid isolering og rensing av Mitokondrier for transplantasjon Av Tissue Dissosiasjon og differensial Filtration

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to ...

Sequence-specific Labeling of Nucleic Acids and Proteins with Methyltransferases and Cofactor Analogues

Sekvens-spesifikk merking av nukleinsyrer og proteiner med metyltransferaser og kofaktor analoger

S-Adenosyl-l-methionine (AdoMet or SAM)-dependent methyltransferases (MTase) catalyze the transfer of the activated methyl group from AdoMet to specific ...

A Hybrid DNA Extraction Method for the Qualitative and Quantitative Assessment of Bacterial Communities from Poultry Production Samples

En hybrid DNA Extraction Method for kvalitativ og kvantitativ vurdering av bakteriesamfunn fra fjærfe produksjon Samples

The efficacy of DNA extraction protocols can be highly dependent upon both the type of sample being investigated and the types of downstream analyses ...

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Enkel metode for fluorescens DNA<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering til knust Kromosomer

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly ...

Simple Bulk Readout of Digital Nucleic Acid Quantification Assays

Enkelt Bulk Avlesning av digitale Nukleinsyre Kvantifisering Analyser

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are ...

Efficient Nucleic Acid Extraction and 16S rRNA Gene Sequencing for Bacterial Community Characterization

Effektiv Nucleic Acid Utvinning og 16S rRNA Gene Sekvense for Bakteriell Fellesskapet Karakterisering

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing ...