This protocol development was supported by the Bill and Melinda Gates Foundation Grand Challenges in Global Health grant 37774. Real-time PCR reagents and advice were provided by Abbott Molecular Inc. Des Plaines, IL. 8E5-LAV cells were provided by the Virology Quality Assurance Laboratory, Rush Presbyterian; St. Luke's Medical Center. HIV-1 negative blood was provided by Core Lab, NorthShore University HealthSystems, Evanston, IL. Thanks to Mark Fisher for photography help.

Ética declaración: Las muestras de sangre utilizadas en este estudio no se consideran como la investigación en seres humanos. Se obtuvieron los especímenes con fines de diagnóstico clínico, que estaban satisfechos, y se proporcionó la porción restante de estas muestras para el ensayo de la investigación de la FINA. Las muestras se codificaron de manera que los investigadores no fueron capaces de determinar fácilmente la identidad de los individuos. 1. Preparación de la FINA Preparación de muestras Mód...

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	<li>Byrnes, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+purification+and+concentration+of+DNA+in+porous+membranes+for+point-of-care+applications.">One-step purification and concentration of DNA in porous membranes for point-of-care applications.</a> Lab Chip. 15 (12), 2647-2659 (2015).</li><li>Connelly, J. T., Rolland, J. P., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="Paper+Machine"+for+Molecular+Diagnostics.">"Paper Machine" for Molecular Diagnostics.</a> Anal Chem. 87 (15), 7595-7601 (2015).</li><li>Govindarajan, A. V., Ramachandran, S., Vigil, G. D., Yager, P., Bohringer, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+low+cost+point-of-care+viscous+sample+preparation+device+for+molecular+diagnosis+in+the+developing+world;+an+example+of+microfluidic+origami.">A low cost point-of-care viscous sample preparation device for molecular diagnosis in the developing world; an example of microfluidic origami.</a> Lab Chip. 12 (1), 174-181 (2012).</li><li>Linnes, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paper-based+molecular+diagnostic+for.">Paper-based molecular diagnostic for.</a> RSC Adv. 4 (80), 42245-42251 (2014).</li><li>Rodriguez, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paper-Based+RNA+Extraction,+in+Situ+Isothermal+Amplification,+and+Lateral+Flow+Detection+for+Low-Cost,+Rapid+Diagnosis+of+Influenza+A+(H1N1)+from+Clinical+Specimens.">Paper-Based RNA Extraction, in Situ Isothermal Amplification, and Lateral Flow Detection for Low-Cost, Rapid Diagnosis of Influenza A (H1N1) from Clinical Specimens.</a> Anal Chem. 87 (15), 7872-7879 (2015).</li><li>Peeling, R. W., Holmes, K. K., Mabey, D., Ronald, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+tests+for+sexually+transmitted+infections+(STIs):+the+way+forward.">Rapid tests for sexually transmitted infections (STIs): the way forward.</a> Sex Transm Infect. 82, 1-6 (2006).</li><li>Mabey, D., Peeling, R. W., Ustianowski, A., Perkins, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostics+for+the+developing+world.">Diagnostics for the developing world.</a> Nat Rev Microbiol. 2 (3), 231-240 (2004).</li><li>Jangam, S. R., Agarwal, A. K., Sur, K., Kelso, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+point-of-care+PCR+test+for+HIV-1+detection+in+resource-limited+settings.">A point-of-care PCR test for HIV-1 detection in resource-limited settings.</a> Biosens Bioelectron. 42, 69-75 (2013).</li><li>Jangam, S. R., Yamada, D. H., McFall, S. M., Kelso, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+point-of-care+extraction+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+proviral+DNA+from+whole+blood+for+detection+by+real-time+PCR.">Rapid point-of-care extraction of human immunodeficiency virus type 1 proviral DNA from whole blood for detection by real-time PCR.</a> J Clin Microbiol. 47 (8), 2363-2368 (2009).</li><li>Kelso, D. M., Jangam, S., Yamada, D., McFall, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Google Patents. , (2012).</li><li>McFall, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+and+Rapid+DNA+Extraction+Method+from+Whole+Blood+for+Highly+Sensitive+Detection+and+Quantitation+of+HIV-1+Proviral+DNA+by+Real-Time+PCR.">A Simple and Rapid DNA Extraction Method from Whole Blood for Highly Sensitive Detection and Quantitation of HIV-1 Proviral DNA by Real-Time PCR.</a> Journal of Virological Methods. 214, 37-42 (2015).</li><li>Boom, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+simple+method+for+purification+of+nucleic+acids.">Rapid and simple method for purification of nucleic acids.</a> J Clin Microbiol. 28 (3), 495-503 (1990).</li><li>Radstrom, P., Knutsson, R., Wolffs, P., Lovenklev, M., Lofstrom, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-PCR+processing:+strategies+to+generate+PCR-compatible+samples.">Pre-PCR processing: strategies to generate PCR-compatible samples.</a> Mol Biotechnol. 26 (2), 133-146 (2004).</li><li>Schrader, C., Schielke, A., Ellerbroek, L., Johne, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR+inhibitors+-+occurrence,+properties+and+removal.">PCR inhibitors - occurrence, properties and removal.</a> J Appl Microbiol. 113 (5), 1014-1026 (2012).</li><li>Folks, T. M., Powell, D. M., Martin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Google Patents. , (1991).</li><li>Violari, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+Antiretroviral+Therapy+and+Mortality+among+HIV-Infected+Infants.">Early Antiretroviral Therapy and Mortality among HIV-Infected Infants.</a> N Engl J Med. 359 (21), 2233-2244 (2008).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> World Health Organization. , (2010).</li><li>Gruner, N., Stambouli, O., Ross, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dried+blood+spots--preparing+and+processing+for+use+in+immunoassays+and+in+molecular+techniques.">Dried blood spots--preparing and processing for use in immunoassays and in molecular techniques.</a> J Vis Exp. (97), (2015).</li><li>Maiers, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+investigation+of+fingerstick+blood+collection+for+point-of-care+HIV-1+viral+load+monitoring+in+South+Africa.">An investigation of fingerstick blood collection for point-of-care HIV-1 viral load monitoring in South Africa.</a> S Afr Med J. 105 (3), 228-231 (2015).</li></ol>

EID relacionado con el acceso rápido tratamiento se ha demostrado para reducir la mortalidad infantil debida a la infección por el VIH 16. Debido a la persistencia de anticuerpos maternos en sangre de un bebé, pruebas rápidas de anticuerpos del VIH tienen una utilidad limitada en la determinación de la condición de los niños expuestos al VIH. La OMS recomienda que todos los niños nacidos de madres VIH-1 positivas se deben probar a las 4-6 semanas de edad, usando una prueba virológica 17. H...

Varios informes han analizado el desarrollo de métodos de extracción de papel o basados ​​en membranas para uso en el punto de atención (PDA) dispositivos de 1-5 con el objetivo de hacer la exquisita sensibilidad y especificidad del diagnóstico molecular disponible para todos. La Organización Mundial de la Salud (OMS) Enfermedades de Transmisión Sexual Diagnóstico Iniciativa acuñó el término ASSURED (asequibles sensible, específico, fácil de usar, rápido y robusto, libre de Equipo y se entrega a aquellos que lo necesitan,) para describir las características ideales de un POC prueba 6. De estas directrices, la característica libre de equipo es particularmente difícil de alcanzar para el diagnóstico molecular. Sin embargo, todas las innovaciones en el campo avanzará el objetivo de llegar a los más necesitados, y no hay esperanza para mejoras a corto plazo en el rendimiento de la prueba mediante la adaptación de la tecnología existente 7. Aquí se describe un protocolo sencillo para la extracción de ADN a partir de sangre enteraque no requiere la química compleja o instrumentación de laboratorio. La FINA (aislamiento de filtración de los ácidos nucleicos) Método de preparación de la muestra fue desarrollado originalmente para extraer el ADN de leucocitos de la sangre entera con el fin de detectar el provirus VIH-1 como parte de un punto de atención (POC) de muestra a respuesta PCR cuantitativa (qPCR) plataforma de diagnóstico infantil precoz (EID) para su uso en entornos de recursos limitados 8-11. Extracción FINA difiere de los métodos de purificación convencionales que utilizan membranas de sílice o partículas paramagnéticas recubiertas de sílice para unirse de forma reversible de ADN en presencia de agentes caotrópicos 12. En su lugar, utiliza FINA filtración vertical, a través de una membrana de separación para extraer el ADN celular de la sangre completa directamente. La membrana que contiene el ADN atrapado se puede colocar directamente en un tubo de PCR y, o bien inmediatamente utilizado en una reacción de PCR o se seca al aire para la amplificación posterior 9. No hay agentes caotrópicos, fenol, o alcoholes se utilizan en la extracción de la muestra, Eliminating las extensas etapas de lavado necesarias para eliminar los inhibidores de la qPCR potentes derivados del proceso de extracción de 13,14. La membrana FINA puede capturar cualquiera de las células 9 o el ADN genómico liberado por lisis celular 11 antes de añadir la muestra a la membrana. Para la captura de células, se añade la sangre total directamente a la membrana. Las células se lisan posteriormente en la membrana mediante la adición de NaOH 10 mM. La ventaja de este método es que implica sólo 3 pasos: 1) adición de la muestra; 2) la lisis celular / lavado y 3) la colocación disco de filtro en el tubo de qPCR. El inconveniente de este método es que la membrana sólo puede contener un número definido de células directamente proporcional al diámetro del disco de membrana. Para llegar al límite de detección requerido para la EID, se requiere 100 l de sangre entera para la entrada de muestra, que implica un filtro que es demasiado grande para ser colocado en un tubo de qPCR. Lisis de las células de la sangre con detergente antes de añadir la muestra a la colecciónmembrana añade una etapa de procesamiento, pero permite el uso de un filtro más pequeño para el mismo tamaño de la muestra. Hemos sido capaces de demostrar una alta reproducibilidad, la detección de copia única, y la cuantificación de tan poco como 10 copias de VIH-1 El material de ADN de 100 l de sangre utilizando esta configuración de prueba 11. En este informe se describe el protocolo de la FINA como originalmente desarrollado para uso en laboratorio. El sándwich de membrana / filtro conocido como el módulo de preparación de la muestra FINA se puede preparar en grandes lotes y almacenadas para su uso posterior. Cuando las muestras se van a extraer este proceso tarda 2 min y se puede realizar en diferentes lotes de tamaño. El qPCR se puede ejecutar inmediatamente o los filtros que contienen el ADN integrado puede ser almacenado hasta que es conveniente para llevar a cabo qPCR. Este método es muy conveniente para el análisis de rutina de muestras en ambos ajustes de alta y baja de los recursos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="860">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:432px;">Fusion 5</td>
			<td style="width:179px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:104px;">8151-9915</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">707 blotting pad</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>28298-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PARAFILM M</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>52858-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3M Double-Coated Polyester Diagnostic Tape&#160;</td>
			<td>3M Medical Specialties</td>
			<td>9965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">200 &#181;l qPCR strip tubes</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>401428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">optical strip caps</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>401425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mx3005p qPCR System</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>401456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221465</td>
			<td>A.C.S. Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td>BioXtra</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td>for molecular biology</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">fetal bovine serum, certified, U.S. origin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hammer driven small hole punch 3/16&#34; hole diameter (5.1 mm)</td>
			<td>McMaster Carr</td>
			<td>3424A16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hammer driven small hole punch 1/4&#34; hole diameter (7.14 mm)</td>
			<td>McMaster Carr</td>
			<td>3424A19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hammer driven small hole punch 5/16&#34; hole diameter (8.35 mm)</td>
			<td>McMaster Carr</td>
			<td>3424A23</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

filtration isolation of nucleic acids:  a simple and rapid dna extraction method

FINA, el aislamiento de los ácidos nucleicos de filtración, es un nuevo método de extracción que utiliza filtración vertical, a través de una membrana de separación y la almohadilla absorbente para extraer el ADN celular de la sangre total en menos de 2 min. La muestra de sangre se trata con detergente, se mezclaron brevemente y se aplicó mediante una pipeta a la membrana de separación. El lisado absorbe en la almohadilla de transferencia debido a la acción capilar, la captura del ADN genómico en la superficie de la membrana de separación. El ADN extraído se retiene en la membrana durante un simple paso de lavado en el que los inhibidores de la PCR son malvados en el papel secante absorbente. Se añade entonces la membrana que contiene el ADN atrapado a la reacción de PCR sin purificación adicional. Este sencillo método no requiere equipos de laboratorio y se puede implementar fácilmente con suministros de laboratorio de bajo costo. Aquí se describe un protocolo para la detección altamente sensible y cuantificación de VIH-1 DNA proviral de todo 100 l de sangre como un modelo para principios deFANT diagnóstico del VIH que podrían ser fácilmente adaptado a otras dianas genéticas.

El flujo de trabajo para la extracción de ADN proviral de sangre total enriquecida con células 8E5-LAV se muestra en la Figura 1. La figura 2 muestra el módulo de muestra de FINA y prepararon tubo qPCR. Este método permite la amplificación eficiente de VIH-1 provirus a partir de células 8E5-LAV en diferentes números de copias, como se muestra en la curva estándar de muestras artificiales (Figura 3). PCR tenía una eficiencia del ...

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Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

Se describe aquí un método de extracción de ADN basado en papel simple y rápida del ADN proviral del VIH de la sangre total detectado por PCR cuantitativa. Este protocolo se puede extender para su uso en la detección de otros marcadores genéticos o el uso de métodos de amplificación alternativos.

El aislamiento de filtración de ácidos nucleicos: A Extracción de ADN método sencillo y rápido

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

Research

JoVE Journal

Biology

NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

NanoDrop microvolumen cuantificación de ácidos nucleicos

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional ...

Investigación

Biología

Electricity-Free, Sequential Nucleic Acid and Protein Isolation

Electricidad-libre, el ácido nucleico secuencial y aislamiento de las proteínas

Traditional and emerging pathogens such as Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), Yersinia pestis, or prion-based diseases are of significant concern ...

qPCR Is a Sensitive and Rapid Method for Detection of Cytomegaloviral DNA in Formalin-fixed, Paraffin-embedded Biopsy Tissue

qPCR es un método sensible y rápido para la detección de ADN de citomegalovirus en fija en formol, biopsia de tejido embebido en parafina

It is crucial to identify cytomegalovirus (CMV) infection in the gastrointestinal (GI) tract of immunosuppressed patients, given their greater risk for ...

Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration

Aislamiento rápido y purificación de mitocondrias para el trasplante por disociación de tejidos y filtración diferencial

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to ...

Sequence-specific Labeling of Nucleic Acids and Proteins with Methyltransferases and Cofactor Analogues

Etiquetado específico de secuencia de ácidos nucleicos y proteínas con metiltransferasas y el cofactor Análogos

S-Adenosyl-l-methionine (AdoMet or SAM)-dependent methyltransferases (MTase) catalyze the transfer of the activated methyl group from AdoMet to specific ...

A Hybrid DNA Extraction Method for the Qualitative and Quantitative Assessment of Bacterial Communities from Poultry Production Samples

Un híbrido método de extracción de ADN para la Evaluación de las comunidades bacterianas cualitativa y cuantitativa de Aves de Corral en muestras de producción

The efficacy of DNA extraction protocols can be highly dependent upon both the type of sample being investigated and the types of downstream analyses ...

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Método simple de ADN de fluorescencia<em&gt; In Situ</em&gt; Hibridación a los cromosomas aplastado

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly ...

Simple Bulk Readout of Digital Nucleic Acid Quantification Assays

Lectura granel simple de Digital ácidos nucleicos Cuantificación ensayos

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are ...

Efficient Nucleic Acid Extraction and 16S rRNA Gene Sequencing for Bacterial Community Characterization

Efficient Nucleic Acid Extracción y 16S rRNA genes de secuenciación para bacteriana Comunidad Caracterización

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing ...

A Rapid, Scalable Method for the Isolation, Functional Study, and Analysis of Cell-derived Extracellular Matrix

Un rápido, método escalable para el aislamiento, estudio funcional, y análisis de la matriz extracelular derivado de células

The extracellular matrix (ECM) is recognized as a diverse, dynamic, and complex environment that is involved in multiple cell-physiological and ...