Name: preparation of formalin-fixed paraffin-embedded tissue cores for both rna and dna extraction
Uploaded: 2016-08-21T14:00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Formalin-fixed Paraffin-embedded Tissue Cores for both RNA and DNA Extraction at JoVE.com

This research was supported by a team grant from Movember/Prostate Cancer Canada to JMSB, DMB, PCP, and JL, and by the Ontario Institute of Cancer Research (JMSB, DMB, and PCP) and Motorcycle Ride for Dad Kingston/University Hospitals Kingston Foundation/Kingston General Hospital (DMB, PCP).

1. نسيج تقوير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مراجعة شريحة المجهر وتحديد المنطقة (ق) من الاهتمام باستخدام علامة دائمة غرامة نقطة. قطع جزء من البارافين فيلم كبيرة بما يكفي لتغطية المنطقة من الفائدة على شريحة المجهر. وضع الفيلم بقوة على شريحة والتفاف الفيلم على حواف للحفاظ على الفيلم من الانزلاق. باستخدام علامة دائمة غرامة نقطة، الخطوط العريضة للنسيج كامل والمنطقة (ق) من الفائدة داخل الأنسجة، والحفاظ على لمس الخطوط العريضة - ولكن خارج - المنطقة (ق). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الفيلم وتحويلها إلى كتلة الأنسجة المقابلة. توجيه الفيلم عن طريق التقليب أو بالتناوب بحيث الخطوط العريضة للنسيج كامل يطابق الشكل الملحوظ من الأنسجة في كتلة (الشكل 1). اضغط على الجزء من الفيلم بقوة إلى السطح من كتلة لمنع انزلاق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام غيض من علامة دائمة، وجعل المسافات البادئة الضحلة ولكن مرئية (~ 0.2 ملم) على طول الخطوط العريضة في المنطقة (ق) من فيterest، ثم إزالة الفيلم. تحميل 1 مل من المبيض، و 70٪ من الإيثانول، والمياه إلى 1.5 أو 2.0 مل أنابيب microcentrifuge منفصلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنظيف لكمة مستقبلات (الحمراء) من لكمة 0.6 ملم التي وضعتها انزلاق لكمة صعودا وهبوطا عدة مرات بينما هي غارقة طرف في أنبوب يحتوي على مواد التبييض. كرر الخطوة السابقة مع 70٪ من الإيثانول ثم الماء (حاسمة لضمان أن التبييض وإزالة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اضغط على لكمة في الأنسجة، داخل المنطقة من الفائدة على عمق 3 مم وسحب لكمة. حرر الأساسية إلى أدنى مستوى ملزمة أنبوب 1.5 أو 2 مل من خلال دفعه للخروج من لكمة مع القلم. تخزين النوى في -20 درجة مئوية (طويلة الأجل) أو 4 درجات مئوية لاستخدامها على المدى القصير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنظيف لكمة وفقا لخطوة 1.4 وتواصل مع المناطق أو عينة المقبلة. </li></ol> 2. Deparaffinize في الصميم الأنسجة FFPE <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> deparaffinization همتها في 1.5 أو 2 مل أنابيب بإضافة 1 مل زيلين حتى النخاع الأنسجة وvortexing لبقوة لمدة 10 ثانية. هيئة التعليم العالير لمدة 3 دقائق عند 50 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT) والحد الأقصى للسرعة (21130 x ج) ومكان أنبوب على الجليد لمدة 5 دقائق (يسمح بقايا شمعية ليصلب على أعلى). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة بعناية البارافين المتراكمة حول الغضروف المفصلي مع طاف باستخدام طرف ماصة وتكرار العلاج زيلين (الخطوات 2،1-2،2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 مل من الإيثانول (100٪) ودوامة بقوة لمدة 10 ثانية. أجهزة الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في RT (السرعة القصوى)، وتجاهل بعناية الايثانول. كرر الخطوة السابقة مرة واحدة. </li></ol> 3. التجانس في الصميم Deparaffinized <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend والنوى في 700 ميكرولتر من الإيثانول (100٪) قبل التجانس. باستخدام الخالط الأنسجة الآلية، طحن النوى الى جزيئات الأنسجة الدقيقة (~ 1 دقيقة على الإعداد المتوسط). تنظيف التحقيق الخالط بين كل عينة للحد من المرحل التلوث. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء 15 مل أنابيب مع ~ 10 مل من التبييض، ريبونوكلياز الحل تحييد و 70٪ من الإيثانول. بعد عينة وطيgenization، وغسل التحقيق الخالط في كل من حلول التنظيف في النظام المذكور أعلاه. تشغيل الخالط على أعلى سرعة خلال مرحلة الغسل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مسح التحقيق مع الأنسجة والسماح التحقيق حتى يجف تماما قبل المجانسة العينة القادمة. تفقد البصر شفرات التحقيق لقطع الأنسجة المتبقية. إذا وجدت، وتنظيف التحقيق مرة أخرى. تغيير حلول التنظيف (التبييض، والإيثانول، وحل ريبونوكلياز تحييد) يوميا. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد التجانس، ليصبح حجم العينة إلى 1 مل عن طريق إضافة المزيد من الإيثانول بنسبة 100٪ (~ 300 ميكرولتر). أجهزة الطرد المركزي في أقصى سرعة لمدة 15 دقيقة، ونضح بعناية الايثانول والهواء الجاف بيليه لحوالي 15-20 دقيقة قبل الشروع في استخراج الحمض النووي الريبي. </li></ol> 4. الهضم مع بروتين كاف <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend وبيليه في 150 ميكرولتر بروتين K الهضم العازلة وأنابيب نفض الغبار لتخفيف بيليه. إضافة 10 ميكرولتر من درجات الحرارة مستقرة بروتين كاف ومزيج من قبل عبها (لادوامة الأنبوب). احتضان المحتوى في أنبوب عند 56 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة مع الإثارة معتدل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح أنبوب لاحتضان على الجليد لمدة 3 دقائق. التبريد الكامل مهم لهطول الأمطار كفاءة في الخطوة التالية. أجهزة الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في أقصى سرعة. </li></ol> 5. الحمض النووي الريبي منفصلة من الحمض النووي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل بعناية طاف، دون الإخلال بيليه، إلى الجديدة 1.5 مل لتنقية الحمض النووي الريبي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على بيليه لتنقية الحمض النووي (يمكن تخزين بيليه لمدة 2 ساعة على RT، لمدة تصل إلى 1 اليوم في 2-8 درجة مئوية، أو لفترات أطول في -20 درجة مئوية). </li></ol> 6. RNA تنقية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان طاف التي تحتوي على الحمض النووي الريبي في 80 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة (لا يتجاوز هذا الوقت). بعد ذلك، أجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة في أنبوب لجمع قطرات من داخل الغطاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 320 ميكرولتر العازلة RLT لضبط الأوضاع ملزمة، ومزيج من قبل pipetting. المقبل، إضافة 720 ميكرولتر الإيثانول (100٪)، ودوامة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل 600 ميكرولتر من العينة، بما في ذلك أي راسب قد شكلت، إلى العمود RNA تدور (مرفق في المجموعة) وضعت في أنبوب جمع 2 مل وتوضع جانبا محتوى المتبقية. أجهزة الطرد المركزي لمدة 15 ثانية في ≥8،000 x ج، تجاهل التدفق من خلال إعادة استخدام أنبوب جمع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل ما تبقى العينة على عمود، بما في ذلك الرذاذ الذي قد تراكمت في غطاء الأنبوب، الطرد المركزي لمدة 15 ثانية في ≥8،000 x ج، وتجاهل التدفق من خلال. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 350 ميكرولتر العازلة سندات شركة لعمود الدوران وأجهزة الطرد المركزي لمدة 15 ثانية في ≥8،000 x ج، تجاهل التدفق من خلال إعادة استخدام أنبوب جمع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المزيج بلطف 10 ميكرولتر الدناز أنا حل الأسهم مع 70 ميكرولتر العازلة نشر الإشعاعات، إضافة مباشرة لغشاء عمود الدوران، واحتضانها في RT لمدة 15 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 500 ميكرولتر العازلة سندات شركة لعمود الدوران، الطرد المركزي لمدة 15 ثانية في ≥8،000 x ج وحفظ التدفق من خلال لاستخدامها في الخطوة التالية. لتعزيز الانتعاش من الرنا صغيرة، ضع عمود الدوران في<html> جديد أنبوب جمع 2 مل وتطبيق التدفق من خلال الخطوة السابقة لعمود الدوران. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي لمدة 15 ثانية في ≥8،000 x ج، تجاهل التدفق من خلال إعادة استخدام أنبوب جمع في الخطوة التالية. إضافة 500 ميكرولتر العازلة RPE إلى عمود الدوران وأجهزة الطرد المركزي لمدة 15 ثانية في ≥8،000 x ج، تجاهل التدفق من خلال إعادة استخدام أنبوب جمع في الخطوة التالية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 500 ميكرولتر العازلة RPE إلى عمود الدوران وأجهزة الطرد المركزي لمدة 15 ثانية في ≥8،000 x ج وتجاهل أنبوب جمع مع التدفق من خلال. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع عمود الدوران في أنبوب جديد لجمع 2 مل، وفتح غطاء وأجهزة الطرد المركزي في أقصى سرعة لمدة 5 دقائق. تجاهل أنبوب جمع مع التدفق من خلال. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع عمود الدوران في الجديد مجموعة 1.5 مل، إضافة 20 ميكرولتر من ريبونوكلياز خالية من المياه مباشرة على الغشاء عمود الدوران، واحتضان الأنبوب لمدة 1 دقيقة في RT. أجهزة الطرد المركزي في أقصى سرعة لمدة 1 دقيقة إلى أزل الحمض النووي الريبي. تخزين عينة الحمض النووي الريبي مزال في -80 درجة مئوية. </li></ol>معشوقة = &quot;jove_title&quot;&gt; 7. الحمض النووي تنقية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend وبيليه تم الحصول عليها خلال استخراج الحمض النووي الريبي بإضافة متدرجة من 45 ميكرولتر من العازلة بروتين كاف (400 ملي تريس 7.5، 400 مم كلوريد الصوديوم، 3 ملي MgCl 2، 4٪ SDS)؛ 45 ميكرولتر H 2 O؛ و 400 ميكروغرام من رجولية عالية بروتين K. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الحل أعلاه عند 56 درجة مئوية لمدة 24 ساعة (مستحسن) أو بين عشية وضحاها. Performincubation في 90 درجة مئوية لمدة 2 ساعة دون الإثارة لفترة وجيزة أجهزة الطرد المركزي في أنبوب microcentrifuge لجمع قطرات من داخل الغطاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح للعينة لتبريد لRT ثم قم بإضافة 4 ميكرولتر ريبونوكلياز ألف (100 ملغ / مل). احتضان العينة لمدة 2 دقيقة في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 200 ميكرولتر العازلة AL إلى عينة، ومزيج دقيق من قبل vortexing. المقبل، إضافة 200 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 100٪، وتخلط جيدا من قبل vortexing. نقل العينة بأكملها إلى العمود المقدمة تدور، ومكان في أنبوب جمع 2 مل، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في ≥8،000 ز س. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل أنبوب جمع معتتدفق من خلال ووضع عمود الدوران في أنبوب جديد لجمع 2 مل. إضافة 700 ميكرولتر العازلة AW1 إلى عمود الدوران، الطرد المركزي لمدة 15 ثانية في ≥8،000 x ج، تجاهل التدفق من خلال إعادة استخدام أنبوب جمع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 700 ميكرولتر العازلة AW2 إلى عمود الدوران، الطرد المركزي لمدة 15 ثانية في ≥8،000 x ج، تجاهل التدفق من خلال إعادة استخدام أنبوب جمع. المقبل، إضافة 700 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 100٪ لعمود الدوران، الطرد المركزي لمدة 15 ثانية في ≥8،000 x ج وتجاهل أنبوب جمع مع التدفق من خلال. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع عمود الدوران في أنبوب جديد لجمع 2 مل، فتح غطاء عمود الدوران، وأجهزة الطرد المركزي بأقصى سرعة لمدة 5 دقائق. تجاهل أنبوب جمع مع التدفق من خلال. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع عمود الدوران في أنبوب جديد 1.5 مل جمع وإضافة 25 ميكرولتر من nuclease خالية من المياه ساخنة (50 درجة مئوية). احتضان عمود وأنبوب عند 50 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. أجهزة الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في أقصى سرعة، إضافة 25 ميكرولتر من nuclease خالية من المياه (RT) إلى العمود واحتضان ل1 دقيقة في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في سرعة قصوى (21130 x ج)، والحصاد من خلال تدفق تحتوي على الحمض النووي الجيني (حوالي 50 ميكرولتر من الحمض النووي في المجموع). تخزين العمود في -20 درجة مئوية (في حال طلب شطف أخرى في وقت لاحق). </li></ol>

<ol>
	<li>Kern, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+your+new+cancer+biomarker+may+never+work:+recurrent+patterns+and+remarkable+diversity+in+biomarker+failures.">Why your new cancer biomarker may never work: recurrent patterns and remarkable diversity in biomarker failures.</a> Cancer Res. 72 (23), 6097-6101 (2012).</li><li>Klopfleisch, R., Weiss, A. T. A., Gruber, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excavation+of+a+buried+treasure--DNA,+mRNA,+miRNA+and+protein+analysis+in+formalin+fixed,+paraffin+embedded+tissues.">Excavation of a buried treasure--DNA, mRNA, miRNA and protein analysis in formalin fixed, paraffin embedded tissues.</a> Histol. Histopathol. 26 (6), 797-810 (2011).</li><li>Beltran, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+Next-generation+Sequencing+of+Advanced+Prostate+Cancer+Identifies+Potential+Therapeutic+Targets+and+Disease+Heterogeneity.">Targeted Next-generation Sequencing of Advanced Prostate Cancer Identifies Potential Therapeutic Targets and Disease Heterogeneity.</a> Eur. Urol. 63 (5), 920-926 (2013).</li><li>Hoppin, J. A., Tolbert, P. E., Taylor, J. A., Schroeder, J. C., Holly, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+for+selection+bias+with+tumor+tissue+retrieval+in+molecular+epidemiology+studies.">Potential for selection bias with tumor tissue retrieval in molecular epidemiology studies.</a> Ann. Epidemiol. 12 (1), 1-6 (2002).</li><li>von Ahlfen, S., Missel, A., Bendrat, K., Schlumpberger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinants+of+RNA+quality+from+FFPE+samples.">Determinants of RNA quality from FFPE samples.</a> PLOS ONE. 2 (12), e1261 (2007).</li><li>Masuda, N., Ohnishi, T., Kawamoto, S., Monden, M., Okubo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+chemical+modification+of+RNA+from+formalin-fixed+samples+and+optimization+of+molecular+biology+applications+for+such+samples.">Analysis of chemical modification of RNA from formalin-fixed samples and optimization of molecular biology applications for such samples.</a> Nucleic Acids Res. 27 (22), 4436-4443 (1999).</li><li>Pikor, L. A., Enfield, K. S. S., Cameron, H., Lam, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+extraction+from+paraffin+embedded+material+for+genetic+and+epigenetic+analyses.">DNA extraction from paraffin embedded material for genetic and epigenetic analyses.</a> J. Vis. Exp. (49), (2011).</li><li>Turashvili, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleic+acid+quantity+and+quality+from+paraffin+blocks:+defining+optimal+fixation,+processing+and+DNA/RNA+extraction+techniques.">Nucleic acid quantity and quality from paraffin blocks: defining optimal fixation, processing and DNA/RNA extraction techniques.</a> Exp. Mol. Pathol. 92 (1), 33-43 (2012).</li><li>Espina, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-capture+microdissection.">Laser-capture microdissection.</a> Nat. Protoc. 1 (2), 586-603 (2006).</li><li>Hackler, L., Masuda, T., Oliver, V. F., Merbs, S. L., Zack, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+laser+capture+microdissection+for+analysis+of+retinal+mRNA/miRNA+expression+and+DNA+methylation.">Use of laser capture microdissection for analysis of retinal mRNA/miRNA expression and DNA methylation.</a> Methods Mol. Biol. 884, 289-304 (2012).</li><li>Bonin, S., Stanta, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleic+acid+extraction+methods+from+fixed+and+paraffin-embedded+tissues+in+cancer+diagnostics.">Nucleic acid extraction methods from fixed and paraffin-embedded tissues in cancer diagnostics.</a> Expert Rev. Mol. Diagn. 13 (3), 271-282 (2013).</li><li>Bonin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicentre+validation+study+of+nucleic+acids+extraction+from+FFPE+tissues.">Multicentre validation study of nucleic acids extraction from FFPE tissues.</a> Virchows Archiv. 457 (3), 309-317 (2010).</li><li>Montaser-Kouhsari, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-guided+Coring+for+Large-scale+Studies+in+Molecular+Pathology.">Image-guided Coring for Large-scale Studies in Molecular Pathology.</a> Appl. Immunohistochem. Mol. Morphol. , (2015).</li><li>van Eijk, R., Stevens, L., Morreau, H., van Wezel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+a+fully+automated+high-throughput+DNA+extraction+method+from+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissue+for+KRAS,+and+BRAF+somatic+mutation+analysis.">Assessment of a fully automated high-throughput DNA extraction method from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue for KRAS, and BRAF somatic mutation analysis.</a> Exp. Mol. Pathol. 94 (1), 121-125 (2013).</li><li>Ghatak, S., Sanga, Z., Pautu, J. L., Kumar, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coextraction+and+PCR+Based+Analysis+of+Nucleic+Acids+From+Formalin-Fixed+Paraffin-Embedded+Specimens.">Coextraction and PCR Based Analysis of Nucleic Acids From Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Specimens.</a> J. Clin. Lab. Anal. , (2014).</li><li>Hennig, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+extraction+of+DNA+and+RNA+from+a+single+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissue+section+for+analysis+of+both+single-nucleotide+polymorphisms+and+mRNA+expression.">Automated extraction of DNA and RNA from a single formalin-fixed paraffin-embedded tissue section for analysis of both single-nucleotide polymorphisms and mRNA expression.</a> Clin. Chem. 56 (12), 1845-1853 (2010).</li><li>Snow, A. N., Stence, A. A., Pruessner, J. A., Bossler, A. D., Ma, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+cost-effective+method+of+DNA+extraction+from+small+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissue+for+molecular+oncologic+testing.">A simple and cost-effective method of DNA extraction from small formalin-fixed paraffin-embedded tissue for molecular oncologic testing.</a> BMC Clin. Pathol. 14 (1), 30 (2014).</li><li>Torrente, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+extraction+from+formalin-fixed+laryngeal+biopsies:+Comparison+of+techniques.">DNA extraction from formalin-fixed laryngeal biopsies: Comparison of techniques.</a> Acta Otolaryngol. 131 (3), 330-333 (2011).</li><li>Okello, J. B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+methods+in+the+recovery+of+nucleic+acids+from+archival+formalin-fixed+paraffin-embedded+autopsy+tissues.">Comparison of methods in the recovery of nucleic acids from archival formalin-fixed paraffin-embedded autopsy tissues.</a> Anal. Bochem. 400 (1), 110-117 (2010).</li><li>Abramovitz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+RNA+extraction+from+FFPE+tissues+for+expression+profiling+in+the+DASL+assay.">Optimization of RNA extraction from FFPE tissues for expression profiling in the DASL assay.</a> BioTechniques. 44 (3), 417-423 (2008).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> AllPrep DNA/RNA FFPE Handbook. , (2012).</li><li>Laurent, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meeting+report:+discussions+and+preliminary+findings+on+extracellular+RNA+measurement+methods+from+laboratories+in+the+NIH+Extracellular+RNA+Communication+Consortium.">Meeting report: discussions and preliminary findings on extracellular RNA measurement methods from laboratories in the NIH Extracellular RNA Communication Consortium.</a> Journal of Extracell. Vesicles. 4, (2015).</li><li>. Methods of RNA Quality Assessment Available from: <a target="_blank" href="https://www.promega.ca/resources/pubhub/methods-of-rna-quality-assessment">https://www.promega.ca/resources/pubhub/methods-of-rna-quality-assessment</a> (2012)</li><li>Herman, J. G., Graff, J. R., Myohanen, S., Nelkin, B. D., Baylin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methylation-specific+PCR:+a+novel+PCR+assay+for+methylation+status+of+CpG+islands.">Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG islands.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93 (18), 9821-9826 (1996).</li><li>Weisenberger, D. J., Campan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+repetitive+element+DNA+methylation+by+MethyLight.">Analysis of repetitive element DNA methylation by MethyLight.</a> Nucleic acids research. 33 (21), 6823-6836 (2005).</li><li>Yegnasubramanian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypermethylation+of+CpG+Islands+in+Primary+and+Metastatic+Human+Prostate+Cancer.">Hypermethylation of CpG Islands in Primary and Metastatic Human Prostate Cancer.</a> Cancer Res. 64 (6), 1975-1986 (2004).</li><li>Parsons, M., Grabsch, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+make+tissue+microarrays.">How to make tissue microarrays.</a> Diagn. Histopathol. 15 (3), 142-150 (2009).</li></ol>

The authors declare no competing financial interests.

لاستخراج ناجحة من الحمض النووي والحمض النووي الريبي من مناطق الأنسجة من الاهتمام والحفارات دقيق أمر بالغ الأهمية. يصف هذا البروتوكول استخدام لكمة الأنسجة لعزل 0.6 ملم النوى قطر والخطوط العريضة لعملية نقل الرموز من الشرائح المجهر لكتل ​​FFPET المقابلة. هناك حاجة إلى إدخال تعديلات على بروتوكول الشركة المصنعة لاستخراج بكفاءة الأحماض النووية من النوى، والتي هي تقريبا سمكا 50 مرة من أقسام مشراح التي كان القصد هو أن البروتوكول. منذ النوى قد تحتوي على المزيد من شمع البارافين نسبة إلى أقسام الأنسجة، deparaffinization فعالة من النوى من خلال تكرار زيلين والعلاج الايثانول الخطوات التي المطلوبة. نجاح الخطوات بعد deparaffinization يعتمد على الصحيح الميكانيكية التجانس النوى الأنسجة وبروتين فعال K الهضم. مزيد من التحسين من بروتين K الهضم لا يمكن أن يؤديها. ومن الجدير بالذكر أن هذا الأسلوب هوية منذالمناطق ذات الاستثمار الاجنبى من الفائدة على سطح الكتلة، على النحو المحدد في الشرائح التشريح المرضي المقابلة. كما الأنسجة المحاصيل الأساسية التي قد تكون 3 أو 4 ملم عميق، مستخدمي هذا البروتوكول قد تكون قلقة بشأن ما الخلايا أو الأنسجة تكمن تحت سطح كتلة. في حين أن هذا هو مصدر قلق صحيح، وقد أثبتت دراسات متعددة (إعادة النظر في المرجع 27) أن النوى الأنسجة تمثل بصدق نسيجية والخصائص الجزيئية للكتل الأنسجة المرضية، وخاصة عندما يتم أخذ عينات مكررة أو ثلاث نسخ النوى من منطقة الفائدة. كما عدة استخراج التجارية المعدلة المعتمدة في هذا البروتوكول يتيح استخراج المتزامنة من كل من الحمض النووي والحمض النووي الريبي من الأنسجة نفسها، وبروتوكول يوفر المواد البيولوجية الثمينة ويسمح للمقارنة مباشرة بين البلدين مما أدى الأحماض النووية من نفس العينة. استخراج المتزامنة من الحمض النووي الريبي والحمض النووي خفضت نضوب العمل والأنسجة بمقدار النصف، ويمكن تحليل متكامل الدقيق للEXPR الجينession، فضلا عن ميزات جينية وراثية وجدت في الحمض النووي. منذ غلة كل من الحمض النووي الريبي والحمض النووي من هذه النوى الأنسجة تمثيلية يتجاوز عادة 600 و 300 نانوغرام، على التوالي، ولأن معظم تطبيقات PCR والقادم تسلسل الجيل الحالي يتطلب عادة 10-100 نانوغرام، معظم العينات تنقيته من هذا البروتوكول يجب تقديم ما يكفي من المواد لعدة فحوصات المصب. وقد تبين أن هذا البروتوكول أن استنساخه في المختبرات المستقلة (Selvarajah وآخرون، وفي الإعدادية). والحمض النووي الريبي من هذا البروتوكول من نوعية كافية لتحليل التعبير الجيني باستخدام RT-PCR أو منصة multianalyte الشعبية، ويقوم الحمض النووي بشكل جيد في مثيلة المقايسات PCR محددة. هناك ما يبرر الدراسات المستقبلية التي تهدف إلى تقييم مدى فائدة الأحماض النووية تعافى في تسلسل الجيل القادم. وهكذا، قدمت عدة تعديلات على بروتوكول متوفرة تجاريا، مصممة للأقسام FFPET رقيقة، مما يجعلها مناسبة FOص شارك في استخراج الحمض النووي الريبي والحمض النووي من عينات FFPET 0.6 مم. أظهر بروتوكول عوائد عالية على الدوام في لفيف كبير من عينات سرطان البروستاتا وفي مجموعة محدودة من عينات من سرطانات الثدي والمخ والمثانة. عموما، يجب أن البروتوكول تمكين المستخدمين من تنفيذ المستهدفة التحليلات القائمة على الجينات في مجموعات الأنسجة كبيرة مشروحة بشكل جيد. وجدير بالذكر أن بروتوكول يتيح أخذ العينات فعالة مركزة من المناطق ذات الاهتمام في FFPET، صغيرة نسبيا اليدين في الوقت المحدد، وعوائد عالية بما فيه الكفاية بالنسبة لمعظم التطبيقات المصب.

يسعى البحث العلامات البيولوجية الجيني لتحديد يرتبط الجزيئية التي تعكس بدقة وبشكل موثوق الحالة المرضية، والقيام بذلك بطريقة مفيدة سريريا. 1 تطوير العلامات البيولوجية هي التي تعتمد على تحليل بأثر رجعي من عينات الأنسجة مشروحة بشكل جيد. يتم تخزين عينات الأنسجة المريضة وطبيعية إما الأنسجة كما الطازجة المجمدة في المصارف البيولوجية المتخصصة أو الأنسجة جزءا لا يتجزأ من البارافين (FFPET) كتل الفورمالين ثابت في المحفوظات السريرية. تسمح الأنسجة الطازجة المجمدة لاستخراج الأحماض النووية ذات جودة عالية، واستخدمت على نطاق واسع في الدراسات اكتشاف العلامات البيولوجية الجينوم. 2،3 ومع ذلك، هي عينات الأنسجة أقل المتاحة في المصارف البيولوجية ودراسة هذه الأنسجة يدخل بالانحياز للعينات أكبر، والفئات غير عادية من المرض، والمرضى الذين تم فحصهم في مراكز متخصصة مع قدرات أكبر لحفظ الأنسجة. 4 FFPET، في المقابل، هو طريقة التخزين الافتراضي للأنسجة البشرية والحيوانية المريضة. في حين كتل FFPET الحفاظ م الخلويorphology، عملية التثبيت عبر الروابط المكونات الخلوية الأخرى للأحماض النووية. RNA عبر ربط والحمض النووي والقابلة للاسترداد، ولكن فقط في المتدهورة، أشكال مجزأة للغاية. 5،6 ومع ذلك، هذه DNA و RNA شظايا قابلة للتحليل من قبل مجموعة من توسيع فحوصات، بما في ذلك التعبير مرنا، hypermethylation الحمض النووي، والتسلسل المستهدف. 7،8 لاستغلال هذه الفرصة في كمية كبيرة ومتنوعة من FFPET متاحة للبحث، هناك حاجة لوضع بروتوكول استخراج فعالة وموثوق بها. وتركز نسبة كبيرة من الأبحاث العلامات البيولوجية في أنسجة السرطان. مثل أنواع أخرى من الأنسجة المريضة والأنسجة السرطان غالبا ما يظهر عدم التجانس إقليميا هاما في الحفاظ على الخلية ونوع من الخلايا. منذ يعتمد البحث العلامات البيولوجية على القدرة على ربط مكونات الأنسجة المريضة مع ميزات الجزيئية، خطوة حاسمة في هذه العملية هي حصاد الدقيق من الأنسجة التي تم الحفاظ عليها بشكل جيد وإثراء للدisease قيد الدراسة. في FFPET، وغالبا ما تستخدم اثنين من التقنيات التخصيب: القبض على الليزر تسليخ مجهري (LCM)، وباجتزاء مشراح. [لكم تمكن شديدة التركيز حصاد الأنسجة، ويمكن استخدامها لعزل، أنواع معينة من الخلايا المحفوظة جيدا في الأنسجة غير المتجانسة. 9،10 ومع ذلك، LCM تتطلب معدات مكلفة وتستغرق وقتا طويلا باهظه لأعداد كبيرة من العينات. باجتزاء مشراح هو عملية أكثر تستخدم على نطاق واسع، حيث يتم قطع المقاطع رقيقة من كتل FFPET. 11،12 مشراح قطع المقاطع غالبا ما تشمل الأنسجة التي هي غير متجانسة في الحفاظ الخلية (على سبيل المثال، مقابل نخرية الحفاظ عليها جيدا) وتكوين (على سبيل المثال، والسرطان مقابل حمة حميدة)، وبالتالي قد يؤدي إلى تجانس الخصائص الجزيئية أفضل التحقيق بشكل منفصل. وبالتالي، هناك حاجة إلى طريقة إنتاجية عالية تثري للخلايا الفائدة. وهناك طريقة ثالثة، عزل الأحماض النووية من النوى FFPET، يوفر هذا التخصيب هو مناسبة لمارا عاليةhput البروتوكولات، واستخدمت من قبل الآخرين لعزل الحمض النووي الريبي أو الحمض النووي من عينات الأنسجة منفصلة. 7،13،14 وهناك عدد من البروتوكولات نشرت يحدد طرق استخراج الأحماض النووية من FFPET (الجدول 1). ومع ذلك، فقد تم تحسين بروتوكولات حيث يتم استخراج الحمض النووي الريبي والحمض النووي من الأنسجة نفسها لأقسام الأنسجة مشراح، ولكن ليس لالنوى الأنسجة. 15،16 البروتوكولات وبالمثل، نشرت الذي نقدم زيادة خصوصية النسيج، إما عن طريق النوى الأنسجة أو microdissections الشرائح، تحديد الإجراءات لاستخراج الحمض النووي، ولكن ليس الحمض النووي الريبي. 7،17 هنا، بروتوكول الأمثل لاستخراج المزدوج من كل من الحمض النووي والحمض النووي الريبي من صميم النسيج نفسه ويتجلى. ويتم حصاد النوى الأنسجة عن طريق إدراج ميكروأري الأنسجة (TMA) اللكمات إلى المناطق ذات الاهتمام تعيينها إلى كتل FFPET. يتم تنفيذ التعيين من قبل التأشير شريحة المجهر مع القلم علامة ونقل هذا الشرح لسطح FFPE المقابلةكتلة T (الشكل 1). تضمن عمل مسبق التي أدت إلى تطوير هذا البروتوكول المقارنة بين عدة أنظمة استخراج الحمض النووي المتاحة تجاريا. في هذه المقارنة، تعديلات على البروتوكولات التجارية، كما هو موضح أدناه توفير أعلى DNA و RNA الغلة والجودة (Selvarajah آخرون، في الإعدادية). النوى الأنسجة أكثر سمكا من أقسام ميكرون 5-10 ميكرون التي تستخدم عادة في FFPET بروتوكولات استخراج 11،12،14،18 - 20، ويمكن أن تحتوي على كميات أكثر تنوعا من البارافين. للتعويض عن ذلك، تم تعزيز deparaffinization بتكرار العلاج زيلين والإيثانول وعن طريق إدخال خطوة التجانس بمحركات (الشكل 1). وعلاوة على ذلك، تم تطول مرات الهضم بروتين كاف لزيادة العائد الحمض النووي. وعموما، هذا البروتوكول هو فعالة من حيث التكلفة ويمكن إقامة روابط بين السمات الجزيئية والنسيجية من المرض في لوس أنجليسRGE والسكان تتميز أيضا. ويمكن إجراء البروتوكول في مجملها من موثوق داخل 2 أيام، بما في ذلك 3 ساعة من التدريب العملي في الوقت المحدد، مع حاجة كبيرة لمعدات متخصصة أو باهظة الثمن. بروتوكول خطوة بخطوة هو الآخرة كما نسخة معدلة من بروتوكول الشركة المصنعة. 21 يرجى الاطلاع على جدول المواد / المعدات للمواد محددة والمعدات والمصنعين.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="786">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Plastic paraffin film, &#34;Parafilm &#39;M&#39;&#34;</td>
			<td style="width:217px;">Bemis&#160;</td>
			<td style="width:119px;">RK-06720-40</td>
			<td style="width:167px;">Any generic paraffin film will work as a substitute</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Sodium Hypochlorite, &#34;Ultra Bleach&#34;</td>
			<td style="width:217px;">Likewise</td>
			<td style="width:119px;">53-2879-2</td>
			<td>Any generic bleach will work as a substitute. Hazardous material that can cause burns on contact.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:283px;">Molecular biology grade absolute ethanol</td>
			<td style="width:217px;">Fisher BioReagents</td>
			<td style="width:119px;">BP2818-500</td>
			<td>Sigma-Aldrich E7023 suffices as a substitute</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Molecular Grade H2O</td>
			<td style="width:217px;">G-Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">786-293</td>
			<td>Sigma W4502 suffices, as well as any other brand of molecular grade H2O</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:283px;">0.6mm Punch Set for Beecher Instruments&#160;</td>
			<td style="width:217px;">Estigen</td>
			<td style="width:119px;">MPO6[Yellow]</td>
			<td>Make sure to use the red receiver punch from the set</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Fine point permanent marker</td>
			<td style="width:217px;">Sharpie</td>
			<td style="width:119px;">10365796S</td>
			<td>Using the marker on FFPE tissues causes it to dry out quickly, so several may be required</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">FFPE tissue block</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:283px;">Stained tissue slide corresponding to FFPE block</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">1.5 mL Micro-Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:217px;">Fisher BioReagents</td>
			<td style="width:119px;">05-408-137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:283px;">2.0 mL Low binding tubes (LoBind Micro-Centrifuge Tubes)</td>
			<td style="width:217px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">22431048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:283px;">1.5 mL Low binding tubes (LoBind Micro-Centrifuge Tubes)</td>
			<td style="width:217px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">22431021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Histology Xylene</td>
			<td style="width:217px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">CA 95057-822</td>
			<td>Fisher Scientific X5-500 suffices as a substitute</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Molecular Biology Grade 2-Propanol</td>
			<td style="width:217px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">I9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:283px;">AllPrep FFPE DNA/RNA Kit&#160;</td>
			<td style="width:217px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">80234</td>
			<td>Prepare buffers accodring to the AllPrep DNA/RNA FFPE Handbook21</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:283px;">Buffers: RLT, FRN, RPE, ATL, AL, AW1, AW2, DNaseI solution</td>
			<td style="width:217px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">80234</td>
			<td>Prepare buffers accodring to the AllPrep DNA/RNA FFPE Handbook21</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Temperature stable proteinase K</td>
			<td style="width:217px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">80234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">High potency proteinase K</td>
			<td style="width:217px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">25530-049</td>
			<td>Invitrogen 25530-015 suffices as a substitute</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNAse neutralizing solution (Rnase AWAY)</td>
			<td style="width:217px;">Molecular BioProducts</td>
			<td style="width:119px;">7003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">RNaseA 100mg/mL</td>
			<td style="width:217px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">19101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">BD Integra Syringe 3mL 21G x 1/2</td>
			<td style="width:217px;">BD&#160;</td>
			<td style="width:119px;">305274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:283px;">Motorized tissue homogenizer (TissueRuptor)</td>
			<td style="width:217px;">Qiagen&#160;</td>
			<td style="width:119px;">9001271</td>
			<td>Fisher Scientific 14-261-29 suffices as a substitute</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">-20&#176;C and -80&#176;C Laboratory Freezer &#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:283px;">Micro-Centrifuge with rotor for 2mL tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Digital Vortex Mixer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Pipettes and filter tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Heating blocks or water baths</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Tris Hydrochloride&#160;</td>
			<td style="width:217px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;">0234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Sodium Chloride&#160;</td>
			<td style="width:217px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;">0241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Anhydrous Magnesium Chloride</td>
			<td style="width:217px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Sodium Dodecyl Sulfate</td>
			<td style="width:217px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">L4509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:283px;">Acrodisc 25mm syring filters with 0.45 um Supor membrane</td>
			<td style="width:217px;">Pall</td>
			<td style="width:119px;">PN 4614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:283px;">Syringe with retracting BD PrecisionGlide needle 3mL</td>
			<td style="width:217px;">BD Integra</td>
			<td style="width:119px;">305274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Hydrochloric Acid</td>
			<td style="width:217px;">BDH</td>
			<td style="width:119px;">3026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:283px;">Multianalyte gene expression platfrom (nCounter &#174; CAE codeset and Nanostring nCounter platform)</td>
			<td style="width:217px;">Nanostring nCounter platform, Nanostring</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:283px;">Fluorometric nucleic acid quantification (Qubit dsDNA HS Assay Kit and Qubit&#174; RNA BR Assay Kit)</td>
			<td style="width:217px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of formalin-fixed paraffin-embedded tissue cores for both rna and dna extraction

Formalin-fixed paraffin embedded tissue (FFPET) represents a valuable, well-annotated substrate for molecular investigations. The utility of FFPET in molecular analysis is complicated both by heterogeneous tissue composition and low yields when extracting nucleic acids. A literature search revealed a paucity of protocols addressing these issues, and none that showed a validated method for simultaneous extraction of RNA and DNA from regions of interest in FFPET. This method addresses both issues. Tissue specificity was achieved by mapping cancer areas of interest on microscope slides and transferring annotations onto FFPET blocks. Tissue cores were harvested from areas of interest using 0.6 mm microarray punches. Nucleic acid extraction was performed using a commercial FFPET extraction system, with modifications to homogenization, deparaffinization, and Proteinase K digestion steps to improve tissue digestion and increase nucleic acid yields. The modified protocol yields sufficient quantity and quality of nucleic acids for use in a number of downstream analyses, including a multi-analyte gene expression platform, as well as reverse transcriptase coupled real time PCR analysis of mRNA expression, and methylation-specific PCR (MSP) analysis of DNA methylation.

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Formalin-fixed Paraffin-embedded Tissue Cores for both RNA and DNA Extraction at JoVE.com

Preparation of Formalin-fixed Paraffin-embedded Tissue Cores for both RNA and DNA Extraction

هذا البروتوكول استخراج تعديل يحسن RNA والحمض النووي العوائد من المناطق المستهدفة على نحو أدق من الفائدة في كتل الأنسجة النسيجية.

إعداد النوى الأنسجة الثابتة الفورمالين جزءا لا يتجزأ من البارافين لكلا RNA واستخراج الحمض النووي

Formalin-fixed paraffin embedded tissue (FFPET) represents a valuable, well-annotated substrate for molecular investigations. The utility of FFPET in ...

Research

JoVE Journal

Biology

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

البارافين ، جزءا لا يتجزأ من والمجمدة أقسام ذبابة الفاكهة</emالعضلات الكبار>

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

DNA Extraction from Paraffin Embedded Material for Genetic and Epigenetic Analyses

استخراج الحمض النووي من مادة البارافين جزءا لا يتجزأ من التحليلات الجينية واللا جيني

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number ...

Extraction of Tissue Antigens for Functional Assays

استخراج المستضدات لفحوصات الأنسجة وظيفية

Many of the antigen targets of adaptive immune response, recognized by B and T cells, have not been defined 1. This is particularly true in autoimmune ...

Proteomic Sample Preparation from Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissue

إعداد نموذج البروتين من الفورمالين الثابتة والبارافين جزءا لا يتجزأ من نسيج

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale ...

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

الرنا الميكروي<em&gt; في الوضع الطبيعي</em&gt; التهجين للأنسجة الكلى الفورمالين الثابتة

In this article we describe a method for colorimetric detection of miRNA in the kidney through in situ hybridization with digoxigenin tagged microRNA ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

التصوير في الوقت الحقيقي من واحدة المهندسة رنا النصوص في الخلايا الحية عن طريق Ratiometric ثنائي الجزيء منارات

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

qPCR Is a Sensitive and Rapid Method for Detection of Cytomegaloviral DNA in Formalin-fixed, Paraffin-embedded Biopsy Tissue

QPCR هو أسلوب حساس وسريع للكشف عن الحمض النووي من Cytomegaloviral في الفورمالين الثابتة، جزءا لا يتجزأ من البارافين-الأنسجة خزعة

It is crucial to identify cytomegalovirus (CMV) infection in the gastrointestinal (GI) tract of immunosuppressed patients, given their greater risk for ...

Employing Digital Droplet PCR to Detect BRAF V600E Mutations in Formalin-fixed Paraffin-embedded Reference Standard Cell Lines

توظيف الرقمية القطرة PCR لكشف الطفرات BRAF V600E في البارافين جزءا لا يتجزأ من خطوط الخلايا المعيار المرجعي الفورمالين الثابتة

ddPCR is a highly sensitive PCR method that utilizes a water-oil emulsion system. Using a droplet generator, an extracted nucleic acid sample is ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

عزل الترشيح من الأحماض النووية: وبسيطة وسريعة استخراج الحمض النووي الطريقة

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

TChIP-Seq: Cell-Type-Specific Epigenome Profiling

تشيب-Seq: التنميط Epigenome الخلية-نوع معين

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological ...