Name: preparation of formalin-fixed paraffin-embedded tissue cores for both rna and dna extraction
Uploaded: 2016-08-21T14:00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Formalin-fixed Paraffin-embedded Tissue Cores for both RNA and DNA Extraction at JoVE.com

This research was supported by a team grant from Movember/Prostate Cancer Canada to JMSB, DMB, PCP, and JL, and by the Ontario Institute of Cancer Research (JMSB, DMB, and PCP) and Motorcycle Ride for Dad Kingston/University Hospitals Kingston Foundation/Kingston General Hospital (DMB, PCP).

<ol>
	<li>Kern, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+your+new+cancer+biomarker+may+never+work:+recurrent+patterns+and+remarkable+diversity+in+biomarker+failures.">Why your new cancer biomarker may never work: recurrent patterns and remarkable diversity in biomarker failures.</a> Cancer Res. 72 (23), 6097-6101 (2012).</li><li>Klopfleisch, R., Weiss, A. T. A., Gruber, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excavation+of+a+buried+treasure--DNA,+mRNA,+miRNA+and+protein+analysis+in+formalin+fixed,+paraffin+embedded+tissues.">Excavation of a buried treasure--DNA, mRNA, miRNA and protein analysis in formalin fixed, paraffin embedded tissues.</a> Histol. Histopathol. 26 (6), 797-810 (2011).</li><li>Beltran, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+Next-generation+Sequencing+of+Advanced+Prostate+Cancer+Identifies+Potential+Therapeutic+Targets+and+Disease+Heterogeneity.">Targeted Next-generation Sequencing of Advanced Prostate Cancer Identifies Potential Therapeutic Targets and Disease Heterogeneity.</a> Eur. Urol. 63 (5), 920-926 (2013).</li><li>Hoppin, J. A., Tolbert, P. E., Taylor, J. A., Schroeder, J. C., Holly, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+for+selection+bias+with+tumor+tissue+retrieval+in+molecular+epidemiology+studies.">Potential for selection bias with tumor tissue retrieval in molecular epidemiology studies.</a> Ann. Epidemiol. 12 (1), 1-6 (2002).</li><li>von Ahlfen, S., Missel, A., Bendrat, K., Schlumpberger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinants+of+RNA+quality+from+FFPE+samples.">Determinants of RNA quality from FFPE samples.</a> PLOS ONE. 2 (12), e1261 (2007).</li><li>Masuda, N., Ohnishi, T., Kawamoto, S., Monden, M., Okubo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+chemical+modification+of+RNA+from+formalin-fixed+samples+and+optimization+of+molecular+biology+applications+for+such+samples.">Analysis of chemical modification of RNA from formalin-fixed samples and optimization of molecular biology applications for such samples.</a> Nucleic Acids Res. 27 (22), 4436-4443 (1999).</li><li>Pikor, L. A., Enfield, K. S. S., Cameron, H., Lam, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+extraction+from+paraffin+embedded+material+for+genetic+and+epigenetic+analyses.">DNA extraction from paraffin embedded material for genetic and epigenetic analyses.</a> J. Vis. Exp. (49), (2011).</li><li>Turashvili, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleic+acid+quantity+and+quality+from+paraffin+blocks:+defining+optimal+fixation,+processing+and+DNA/RNA+extraction+techniques.">Nucleic acid quantity and quality from paraffin blocks: defining optimal fixation, processing and DNA/RNA extraction techniques.</a> Exp. Mol. Pathol. 92 (1), 33-43 (2012).</li><li>Espina, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-capture+microdissection.">Laser-capture microdissection.</a> Nat. Protoc. 1 (2), 586-603 (2006).</li><li>Hackler, L., Masuda, T., Oliver, V. F., Merbs, S. L., Zack, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+laser+capture+microdissection+for+analysis+of+retinal+mRNA/miRNA+expression+and+DNA+methylation.">Use of laser capture microdissection for analysis of retinal mRNA/miRNA expression and DNA methylation.</a> Methods Mol. Biol. 884, 289-304 (2012).</li><li>Bonin, S., Stanta, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleic+acid+extraction+methods+from+fixed+and+paraffin-embedded+tissues+in+cancer+diagnostics.">Nucleic acid extraction methods from fixed and paraffin-embedded tissues in cancer diagnostics.</a> Expert Rev. Mol. Diagn. 13 (3), 271-282 (2013).</li><li>Bonin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicentre+validation+study+of+nucleic+acids+extraction+from+FFPE+tissues.">Multicentre validation study of nucleic acids extraction from FFPE tissues.</a> Virchows Archiv. 457 (3), 309-317 (2010).</li><li>Montaser-Kouhsari, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-guided+Coring+for+Large-scale+Studies+in+Molecular+Pathology.">Image-guided Coring for Large-scale Studies in Molecular Pathology.</a> Appl. Immunohistochem. Mol. Morphol. , (2015).</li><li>van Eijk, R., Stevens, L., Morreau, H., van Wezel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+a+fully+automated+high-throughput+DNA+extraction+method+from+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissue+for+KRAS,+and+BRAF+somatic+mutation+analysis.">Assessment of a fully automated high-throughput DNA extraction method from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue for KRAS, and BRAF somatic mutation analysis.</a> Exp. Mol. Pathol. 94 (1), 121-125 (2013).</li><li>Ghatak, S., Sanga, Z., Pautu, J. L., Kumar, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coextraction+and+PCR+Based+Analysis+of+Nucleic+Acids+From+Formalin-Fixed+Paraffin-Embedded+Specimens.">Coextraction and PCR Based Analysis of Nucleic Acids From Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Specimens.</a> J. Clin. Lab. Anal. , (2014).</li><li>Hennig, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+extraction+of+DNA+and+RNA+from+a+single+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissue+section+for+analysis+of+both+single-nucleotide+polymorphisms+and+mRNA+expression.">Automated extraction of DNA and RNA from a single formalin-fixed paraffin-embedded tissue section for analysis of both single-nucleotide polymorphisms and mRNA expression.</a> Clin. Chem. 56 (12), 1845-1853 (2010).</li><li>Snow, A. N., Stence, A. A., Pruessner, J. A., Bossler, A. D., Ma, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+cost-effective+method+of+DNA+extraction+from+small+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissue+for+molecular+oncologic+testing.">A simple and cost-effective method of DNA extraction from small formalin-fixed paraffin-embedded tissue for molecular oncologic testing.</a> BMC Clin. Pathol. 14 (1), 30 (2014).</li><li>Torrente, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+extraction+from+formalin-fixed+laryngeal+biopsies:+Comparison+of+techniques.">DNA extraction from formalin-fixed laryngeal biopsies: Comparison of techniques.</a> Acta Otolaryngol. 131 (3), 330-333 (2011).</li><li>Okello, J. B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+methods+in+the+recovery+of+nucleic+acids+from+archival+formalin-fixed+paraffin-embedded+autopsy+tissues.">Comparison of methods in the recovery of nucleic acids from archival formalin-fixed paraffin-embedded autopsy tissues.</a> Anal. Bochem. 400 (1), 110-117 (2010).</li><li>Abramovitz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+RNA+extraction+from+FFPE+tissues+for+expression+profiling+in+the+DASL+assay.">Optimization of RNA extraction from FFPE tissues for expression profiling in the DASL assay.</a> BioTechniques. 44 (3), 417-423 (2008).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> AllPrep DNA/RNA FFPE Handbook. , (2012).</li><li>Laurent, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meeting+report:+discussions+and+preliminary+findings+on+extracellular+RNA+measurement+methods+from+laboratories+in+the+NIH+Extracellular+RNA+Communication+Consortium.">Meeting report: discussions and preliminary findings on extracellular RNA measurement methods from laboratories in the NIH Extracellular RNA Communication Consortium.</a> Journal of Extracell. Vesicles. 4, (2015).</li><li>. Methods of RNA Quality Assessment Available from: <a target="_blank" href="https://www.promega.ca/resources/pubhub/methods-of-rna-quality-assessment">https://www.promega.ca/resources/pubhub/methods-of-rna-quality-assessment</a> (2012)</li><li>Herman, J. G., Graff, J. R., Myohanen, S., Nelkin, B. D., Baylin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methylation-specific+PCR:+a+novel+PCR+assay+for+methylation+status+of+CpG+islands.">Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG islands.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93 (18), 9821-9826 (1996).</li><li>Weisenberger, D. J., Campan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+repetitive+element+DNA+methylation+by+MethyLight.">Analysis of repetitive element DNA methylation by MethyLight.</a> Nucleic acids research. 33 (21), 6823-6836 (2005).</li><li>Yegnasubramanian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypermethylation+of+CpG+Islands+in+Primary+and+Metastatic+Human+Prostate+Cancer.">Hypermethylation of CpG Islands in Primary and Metastatic Human Prostate Cancer.</a> Cancer Res. 64 (6), 1975-1986 (2004).</li><li>Parsons, M., Grabsch, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+make+tissue+microarrays.">How to make tissue microarrays.</a> Diagn. Histopathol. 15 (3), 142-150 (2009).</li></ol>

The authors declare no competing financial interests.

ब्याज के ऊतकों क्षेत्रों से डीएनए और आरएनए के सफल निकासी के लिए, सटीक coring महत्वपूर्ण है। इस प्रोटोकॉल एक ऊतक पंच का उपयोग 0.6 मिमी व्यास कोर अलग-थलग करने का वर्णन करता है और इसी FFPET ब्लॉक करने के लिए स्लाइड माइक्रोस्कोप से अंकन स्थानांतरित करने के लिए प्रक्रिया की रूपरेखा। निर्माता प्रोटोकॉल के लिए संशोधन कुशलता कोर से न्यूक्लिक एसिड होता है, जो लगभग 50 गुना microtome वर्गों के लिए जो प्रोटोकॉल का इरादा था की तुलना में गहरा हो रहे हैं निकालने के लिए आवश्यक थे। चूंकि कोर ऊतक वर्गों के लिए और अधिक पैराफिन मोम रिश्तेदार, दोहराया xylene और इथेनॉल उपचार कदम के माध्यम से कोर के प्रभावी deparaffinization हो सकती है आवश्यक थे। पोस्ट-deparaffinization कदम की सफलता के लिए उचित यांत्रिक ऊतक कोर homogenization और कुशल proteinase कश्मीर पाचन पर निर्भर करता था। proteinase कश्मीर पाचन के आगे अनुकूलन किया जा सकता है। यह उल्लेखनीय है कि इस विधि की पहचानब्लॉक की सतह पर ब्याज की Fies क्षेत्रों, इसी ऊतकविकृतिविज्ञानी स्लाइड्स में पहचान के रूप में। कोर फसल ऊतक है कि 3 या 4 मिमी गहरी हो सकता है, इस प्रोटोकॉल के उपयोगकर्ताओं क्या कोशिकाओं या ऊतकों ब्लॉक सतह के नीचे रखना बारे में चिंतित हो सकता है। हालांकि यह एक वैध चिंता का विषय है, कई अध्ययनों (संदर्भ 27 में समीक्षा) दिखा दिया है कि ऊतक कोर ईमानदारी histologic और वैकृत ऊतक ब्लॉक की आणविक सुविधाओं का प्रतिनिधित्व करते हैं, खासकर जब डुप्लिकेट या तीन प्रतियों कोर हित के क्षेत्र से जांचा जाता है। संशोधित वाणिज्यिक निकासी किट इस प्रोटोकॉल में अपनाया दोनों डीएनए और एक ही ऊतक से शाही सेना की समवर्ती निकासी के लिए सक्षम बनाता है के रूप में, प्रोटोकॉल कीमती जैविक सामग्री की बचत होती है और एक ही नमूना से दो परिणामस्वरूप न्यूक्लिक एसिड के बीच एक प्रत्यक्ष तुलना की अनुमति देता है। आरएनए और डीएनए की समवर्ती निकासी के आधे से श्रम और ऊतक कमी नीचे कटौती, और जीन expr की सटीक एकीकृत विश्लेषण में सक्षम बनाता हैession, साथ ही epigenetic और आनुवंशिक सुविधाओं डीएनए में पाया। दोनों शाही सेना और ये प्रतिनिधि ऊतक कोर से डीएनए की पैदावार के बाद आम तौर पर 600 और 300 एनजी, क्रमशः से अधिक है, और के बाद से सबसे वर्तमान पीसीआर और अगली पीढ़ी के अनुक्रमण अनुप्रयोगों आम तौर पर 10-100 एनजी की आवश्यकता होती है, इस प्रोटोकॉल के द्वारा शुद्ध नमूनों की सबसे पर्याप्त प्रदान करना चाहिए कई नीचे की ओर assays के लिए सामग्री। इस प्रोटोकॉल स्वतंत्र प्रयोगशालाओं भर प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य होना दिखाया गया है (Selvarajah एट अल।, प्रस्तुत करने में।)। इस प्रोटोकॉल से शाही सेना या तो आरटी पीसीआर या एक लोकप्रिय multianalyte मंच का उपयोग जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए पर्याप्त गुणवत्ता की थी, और डीएनए मेथिलिकरण विशिष्ट पीसीआर assays में अच्छा प्रदर्शन किया। अगली पीढ़ी के अनुक्रमण में बरामद न्यूक्लिक एसिड की उपयोगिता का आकलन करने के उद्देश्य से भविष्य के अध्ययन warranted रहे हैं। इस प्रकार, कई संशोधनों के एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्रोटोकॉल, पतली FFPET वर्गों के लिए तैयार करने के लिए किए गए थे, इसके लिए उपयुक्त प्रतिपादनआर 0.6 मिमी FFPET कोर से आरएनए और डीएनए के सह-निष्कर्षण। प्रोटोकॉल प्रोस्टेट कैंसर के नमूनों की एक बड़ी पलटन में और स्तन, मस्तिष्क और मूत्राशय के कैंसर से नमूने की एक सीमित सेट में लगातार उच्च पैदावार का प्रदर्शन किया। कुल मिलाकर, प्रोटोकॉल बड़ी अच्छी तरह से एनोटेट ऊतक संग्रह के लक्षित जीन के आधार पर विश्लेषण के लिए बाहर ले जाने के लिए उपयोगकर्ताओं को सक्षम होना चाहिए। महत्वपूर्ण बात है, प्रोटोकॉल कुशल ध्यान केंद्रित सबसे बहाव के अनुप्रयोगों के लिए FFPET में हित के क्षेत्रों के नमूने, अपेक्षाकृत छोटे हाथों पर समय है, और उच्च पर्याप्त पैदावार सक्षम बनाता है।

जीनोमिक बायोमार्कर अनुसंधान आणविक संबद्ध है कि सही और मज़बूती से रोग की स्थिति को दर्शाते हैं, और एक चिकित्सकीय उपयोगी तरीके से ऐसा करते हैं। 1 Biomarker विकास अच्छी तरह से एनोटेट ऊतकों के नमूनों की पूर्वव्यापी विश्लेषण पर निर्भर है की पहचान करने का प्रयास है। रोगग्रस्त और सामान्य ऊतकों के नमूनों या तो विशेष biobanks में के रूप में ताजा जमी ऊतक या नैदानिक ​​अभिलेखागार में formalin तय आयल एम्बेडेड ऊतक (FFPET) ब्लॉक के रूप में जमा हो जाती है। ताजा जमी ऊतक उच्च गुणवत्ता वाले न्यूक्लिक एसिड की निकासी के लिए अनुमति देता है और व्यापक रूप से जीनोमिक बायोमार्कर की खोज के अध्ययन में इस्तेमाल किया गया है। 2,3 हालांकि, कम ऊतकों के नमूनों biobanks में उपलब्ध हैं और इस तरह के ऊतकों का अध्ययन बड़े नमूनों, असामान्य श्रेणियों की दिशा में एक पूर्वाग्रह का परिचय रोग, और रोगियों बैंक के ऊतकों को अधिक से अधिक क्षमता के साथ विशेष केन्द्रों पर देखा की। 4 FFPET, इसके विपरीत, रोगग्रस्त मानव और जानवरों के ऊतकों के लिए डिफ़ॉल्ट भंडारण विधि है। FFPET ब्लॉकों सेलुलर मीटर बनाए रखने के समयorphology, निर्धारण प्रक्रिया पार लिंक न्यूक्लिक एसिड करने के लिए अन्य सेलुलर घटक। क्रॉस से जुड़े आरएनए और डीएनए वसूली कर रहे हैं, लेकिन केवल अपमानित, उच्च खंडित रूपों में। 5,6 हालांकि, इन डीएनए और आरएनए टुकड़े assays की एक विस्तृत सरणी, mRNA अभिव्यक्ति, डीएनए hypermethylation, और लक्षित अनुक्रमण सहित द्वारा विश्लेषण के लिए उत्तरदायी हैं। 7.8 बड़ी मात्रा में और अनुसंधान के लिए उपलब्ध FFPET की विविधता में इस अवसर का फायदा उठाने के लिए, एक कुशल और विश्वसनीय निकासी प्रोटोकॉल के लिए एक की जरूरत है। ऊतक में बायोमार्कर अनुसंधान का एक बड़ा हिस्सा कैंसर पर केंद्रित है। रोगग्रस्त ऊतक के अन्य प्रकार की तरह, कैंसर के ऊतकों अक्सर सेल संरक्षण और सेल प्रकार में महत्वपूर्ण क्षेत्रीय विविधता से पता चलता है। चूंकि बायोमार्कर अनुसंधान आणविक सुविधाओं के साथ रोगग्रस्त ऊतक के घटक सहसंबंधी करने की क्षमता पर निर्भर करता है, इस प्रक्रिया का एक महत्वपूर्ण कदम है कि अच्छी तरह से संरक्षित और डी के लिए समृद्ध है ऊतक की सटीक कटाई हैअध्ययन के तहत isease। FFPET में, दो संवर्धन तकनीक अक्सर उपयोग किया जाता है: लेजर कब्जा microdissection (एलसीएम), और microtome सेक्शनिंग। एलसीएम अत्यधिक ऊतक कटाई ध्यान केंद्रित सक्षम बनाता है और विशिष्ट, अच्छी तरह से संरक्षित प्रकार की कोशिकाओं को अलग-थलग करने के लिए विषम ऊतकों में इस्तेमाल किया जा सकता है। 9,10 हालांकि, एलसीएम नमूनों की बड़ी संख्या के लिए काफ़ी महंगे उपकरण की आवश्यकता है और बेहद समय है। Microtome सेक्शनिंग एक अधिक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया प्रक्रिया है जहाँ पतली वर्गों FFPET ब्लॉक से काट रहे है। 11,12 microtome-वर्गों में कटौती अक्सर ऊतक है कि सेल संरक्षण में विषम है शामिल हैं (जैसे, परिगलित बनाम अच्छी तरह से संरक्षित) और रचना (जैसे, कैंसर बनाम सौम्य पैरेन्काइमा), और इसलिए आणविक सुविधाओं सबसे अच्छा अलग से जांच के homogenization को जन्म दे सकती। इस प्रकार, वहाँ एक उच्च throughput विधि है कि ब्याज की कोशिकाओं के लिए समृद्ध करती लिए एक की जरूरत है। एक तीसरा तरीका, FFPET कोर से न्यूक्लिक एसिड के अलगाव, इस संवर्धन प्रदान करता है उच्च throug के लिए उपयुक्त हैप्रोटोकॉल hput, और अलग ऊतक कोर से शाही सेना या डीएनए को अलग-थलग करने के लिए दूसरों के द्वारा इस्तेमाल किया गया है। 7,13,14 प्रकाशित प्रोटोकॉल के एक नंबर FFPET (तालिका 1) से न्यूक्लिक एसिड निकालने के तरीकों निर्दिष्ट करें। , या तो ऊतक कोर या स्लाइड के माध्यम से microdissections हालांकि, प्रोटोकॉल जहां आरएनए और डीएनए एक ही ऊतक से निकाले जाते हैं microtome ऊतक वर्गों के लिए अनुकूलित किया गया है, लेकिन ऊतक कोर के लिए नहीं। 15,16 इसी तरह, प्रकाशित प्रोटोकॉल जो ऊतक विशिष्टता वृद्धि की पेशकश करते हैं, प्रक्रियाओं निर्दिष्ट डीएनए की निकासी, लेकिन आरएनए नहीं। 7,17 इधर, दोनों डीएनए और एक ही ऊतक कोर से शाही सेना की दोहरी निकासी के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल के लिए प्रदर्शन किया है। ऊतक कोर हित के क्षेत्रों FFPET ब्लॉकों पर मैप में ऊतक माइक्रोएरे (टीएमए) घूंसे डालने से काटा जाता है। मानचित्रण एक मार्कर पेन के साथ एक खुर्दबीन स्लाइड व्याख्या और इसी FFPE की सतह के लिए एनोटेशन स्थानांतरित द्वारा किया जाता हैटी ब्लॉक (चित्रा 1)। पहले काम है कि इस प्रोटोकॉल के विकास के लिए नेतृत्व कई व्यावसायिक रूप से उपलब्ध न्यूक्लिक एसिड निकासी प्रणाली की तुलना शामिल थे। इस तुलना में, वाणिज्यिक प्रोटोकॉल के लिए संशोधन, के रूप में नीचे वर्णित उच्चतम डीएनए और आरएनए की पैदावार और गुणवत्ता (Selvarajah एट अल।, तैयारी में) प्रदान की है। ऊतक कोर 5-10 माइक्रोन माइक्रोन वर्गों आमतौर पर FFPET निकासी प्रोटोकॉल 11,12,14,18 में इस्तेमाल की तुलना में गहरा हो रहे हैं - 20, और आयल के अधिक चर मात्रा में हो सकती है। इस के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए, deparaffinization xylene और इथेनॉल उपचार दोहरा द्वारा और एक मोटर चालित homogenization कदम (चित्रा 1) को शुरू करने से बढ़ाया गया था। इसके अलावा, proteinase कश्मीर पाचन बार डीएनए उपज बढ़ाने के लिए लम्बे थे। कुल मिलाकर, इस प्रोटोकॉल लागत प्रभावी है और ला में रोग के आणविक और histopathologic सुविधाओं के बीच संबंधों की स्थापना के लिए सक्षम बनाता हैrge, अच्छी तरह से विशेषता आबादी। अपनी संपूर्णता में प्रोटोकॉल 2 दिनों के भीतर मज़बूती से बाहर किया जा सकता, हाथों पर समय की 3 घंटा, विशेष या महंगे उपकरण के लिए बहुत कम जरूरत के साथ शामिल है। कदम-दर-कदम प्रोटोकॉल निर्माता प्रोटोकॉल का एक संशोधित संस्करण के रूप में इसके बाद है। 21 कृपया विशिष्ट अभिकर्मकों, उपकरण, और निर्माताओं के लिए सामग्री / उपकरण की तालिका देखें।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="786">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Plastic paraffin film, &#34;Parafilm &#39;M&#39;&#34;</td>
			<td style="width:217px;">Bemis&#160;</td>
			<td style="width:119px;">RK-06720-40</td>
			<td style="width:167px;">Any generic paraffin film will work as a substitute</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Sodium Hypochlorite, &#34;Ultra Bleach&#34;</td>
			<td style="width:217px;">Likewise</td>
			<td style="width:119px;">53-2879-2</td>
			<td>Any generic bleach will work as a substitute. Hazardous material that can cause burns on contact.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:283px;">Molecular biology grade absolute ethanol</td>
			<td style="width:217px;">Fisher BioReagents</td>
			<td style="width:119px;">BP2818-500</td>
			<td>Sigma-Aldrich E7023 suffices as a substitute</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Molecular Grade H2O</td>
			<td style="width:217px;">G-Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">786-293</td>
			<td>Sigma W4502 suffices, as well as any other brand of molecular grade H2O</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:283px;">0.6mm Punch Set for Beecher Instruments&#160;</td>
			<td style="width:217px;">Estigen</td>
			<td style="width:119px;">MPO6[Yellow]</td>
			<td>Make sure to use the red receiver punch from the set</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Fine point permanent marker</td>
			<td style="width:217px;">Sharpie</td>
			<td style="width:119px;">10365796S</td>
			<td>Using the marker on FFPE tissues causes it to dry out quickly, so several may be required</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">FFPE tissue block</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:283px;">Stained tissue slide corresponding to FFPE block</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">1.5 mL Micro-Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:217px;">Fisher BioReagents</td>
			<td style="width:119px;">05-408-137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:283px;">2.0 mL Low binding tubes (LoBind Micro-Centrifuge Tubes)</td>
			<td style="width:217px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">22431048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:283px;">1.5 mL Low binding tubes (LoBind Micro-Centrifuge Tubes)</td>
			<td style="width:217px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">22431021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Histology Xylene</td>
			<td style="width:217px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">CA 95057-822</td>
			<td>Fisher Scientific X5-500 suffices as a substitute</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Molecular Biology Grade 2-Propanol</td>
			<td style="width:217px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">I9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:283px;">AllPrep FFPE DNA/RNA Kit&#160;</td>
			<td style="width:217px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">80234</td>
			<td>Prepare buffers accodring to the AllPrep DNA/RNA FFPE Handbook21</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:283px;">Buffers: RLT, FRN, RPE, ATL, AL, AW1, AW2, DNaseI solution</td>
			<td style="width:217px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">80234</td>
			<td>Prepare buffers accodring to the AllPrep DNA/RNA FFPE Handbook21</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Temperature stable proteinase K</td>
			<td style="width:217px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">80234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">High potency proteinase K</td>
			<td style="width:217px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">25530-049</td>
			<td>Invitrogen 25530-015 suffices as a substitute</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNAse neutralizing solution (Rnase AWAY)</td>
			<td style="width:217px;">Molecular BioProducts</td>
			<td style="width:119px;">7003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">RNaseA 100mg/mL</td>
			<td style="width:217px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">19101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">BD Integra Syringe 3mL 21G x 1/2</td>
			<td style="width:217px;">BD&#160;</td>
			<td style="width:119px;">305274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:283px;">Motorized tissue homogenizer (TissueRuptor)</td>
			<td style="width:217px;">Qiagen&#160;</td>
			<td style="width:119px;">9001271</td>
			<td>Fisher Scientific 14-261-29 suffices as a substitute</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">-20&#176;C and -80&#176;C Laboratory Freezer &#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:283px;">Micro-Centrifuge with rotor for 2mL tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Digital Vortex Mixer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Pipettes and filter tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Heating blocks or water baths</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Tris Hydrochloride&#160;</td>
			<td style="width:217px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;">0234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Sodium Chloride&#160;</td>
			<td style="width:217px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;">0241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Anhydrous Magnesium Chloride</td>
			<td style="width:217px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Sodium Dodecyl Sulfate</td>
			<td style="width:217px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">L4509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:283px;">Acrodisc 25mm syring filters with 0.45 um Supor membrane</td>
			<td style="width:217px;">Pall</td>
			<td style="width:119px;">PN 4614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:283px;">Syringe with retracting BD PrecisionGlide needle 3mL</td>
			<td style="width:217px;">BD Integra</td>
			<td style="width:119px;">305274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Hydrochloric Acid</td>
			<td style="width:217px;">BDH</td>
			<td style="width:119px;">3026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:283px;">Multianalyte gene expression platfrom (nCounter &#174; CAE codeset and Nanostring nCounter platform)</td>
			<td style="width:217px;">Nanostring nCounter platform, Nanostring</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:283px;">Fluorometric nucleic acid quantification (Qubit dsDNA HS Assay Kit and Qubit&#174; RNA BR Assay Kit)</td>
			<td style="width:217px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of formalin-fixed paraffin-embedded tissue cores for both rna and dna extraction

Formalin-fixed paraffin embedded tissue (FFPET) represents a valuable, well-annotated substrate for molecular investigations. The utility of FFPET in molecular analysis is complicated both by heterogeneous tissue composition and low yields when extracting nucleic acids. A literature search revealed a paucity of protocols addressing these issues, and none that showed a validated method for simultaneous extraction of RNA and DNA from regions of interest in FFPET. This method addresses both issues. Tissue specificity was achieved by mapping cancer areas of interest on microscope slides and transferring annotations onto FFPET blocks. Tissue cores were harvested from areas of interest using 0.6 mm microarray punches. Nucleic acid extraction was performed using a commercial FFPET extraction system, with modifications to homogenization, deparaffinization, and Proteinase K digestion steps to improve tissue digestion and increase nucleic acid yields. The modified protocol yields sufficient quantity and quality of nucleic acids for use in a number of downstream analyses, including a multi-analyte gene expression platform, as well as reverse transcriptase coupled real time PCR analysis of mRNA expression, and methylation-specific PCR (MSP) analysis of DNA methylation.

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Preparation of Formalin-fixed Paraffin-embedded Tissue Cores for both RNA and DNA Extraction

इस संशोधित निकासी प्रोटोकॉल histopathologic ऊतक ब्लॉक में ब्याज की अधिक ठीक लक्षित क्षेत्रों से आरएनए और डीएनए की पैदावार में सुधार।

दोनों आरएनए और डीएनए निष्कर्षण के लिए formalin तय आयल एम्बेडेड ऊतक कोर की तैयारी

Formalin-fixed paraffin embedded tissue (FFPET) represents a valuable, well-annotated substrate for molecular investigations. The utility of FFPET in ...

Research

JoVE Journal

Biology

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

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Extraction of Tissue Antigens for Functional Assays

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Formalin से प्रोटिओमिक नमूना तैयार आयल एम्बेडेड ऊतक फिक्स्ड और

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