Name: preparation of formalin-fixed paraffin-embedded tissue cores for both rna and dna extraction
Uploaded: 2016-08-21T14:00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Formalin-fixed Paraffin-embedded Tissue Cores for both RNA and DNA Extraction at JoVE.com

This research was supported by a team grant from Movember/Prostate Cancer Canada to JMSB, DMB, PCP, and JL, and by the Ontario Institute of Cancer Research (JMSB, DMB, and PCP) and Motorcycle Ride for Dad Kingston/University Hospitals Kingston Foundation/Kingston General Hospital (DMB, PCP).

1. Ткань Coring <ol><li> Просмотрите стекло микроскопа и очертить области (ы) интересов с помощью тонкой точки постоянный маркер. Вырежьте секцию парафиновой пленки, достаточно большой, чтобы покрыть область интереса на предметном стекле микроскопа. Поместите пленку плотно на слайде и оберточную пленку по краям, чтобы сохранить пленку от скольжения. Использование тонкой точки постоянный маркер, очертить всю ткань и область (ы) интересов в ткани, сохраняя контурной прикосновений - но за пределами - региона (ов). </li><li> Снимите пленку и перенести его к блоку соответствующей ткани. Сориентируйте фильм листать или повернув его так, чтобы контур всей ткани соответствует наблюдаемой формы ткани в блоке (рисунок 1). Нажмите участок пленки прочно к поверхности блока, чтобы предотвратить соскальзывание. </li><li> Используя кончик перманентным маркером, сделайте неглубокие, но видимые (~ 0,2 мм) углублений вдоль контура региона (ов) вterest, затем снимите пленку. Нагрузка 1 мл хлорной извести, 70% этанола и воды в отдельные 1,5 или 2,0 мл микропробирок. </li><li> Очистите рецептор (красный) удар от 0,6 мм штампа, установленного сдвинув удар вверх и вниз несколько раз, пока кончик погружен в пробирку, содержащую отбеливателя. Повторить операцию с 70% -ным этанолом, а затем водой (решающее значение для обеспечения того, чтобы отбеливатель удаляется). </li><li> Нажмите удар в ткань, внутри области, представляющей интерес на глубину 3 мм и вывести удар. Освободить ядро ​​в низкое св зывание 1,5 или 2 мл трубки, вставив его из штампа с помощью стилуса. Храните ядра при -20 ° С (на длительный период) или 4 ° С для кратковременного использования. </li><li> Очистите удар согласно пункту 1.4 и продолжить с соседними регионами или образца. </li></ol> 2. Deparaffinize ткани Сердечники FFPE <ol><li> Выходной сигнал переноса Депарафинирование в 1,5 или 2 мл пробирки путем добавления 1 мл ксилола в сердцевине ткани и встряхиванием энергично в течение 10 сек. Heaт в течение 3 мин при 50 ° С. </li><li> Центрифуга в течение 2 мин при комнатной температуре (RT) и максимальной скорости (21130 Xg) и поместите пробирку на льду в течение 5 мин (позволяет восковой остаток затвердеть на верхней части). </li><li> Осторожно удалите парафин, накопленный вокруг мениска с супернатанта с помощью пипетки и повторить лечение ксилола (шаги 2.1-2.2). </li><li> Добавить 1 мл этанола (100%) и на вортексе в течение 10 сек. Центрифуга в течение 2 мин при комнатной температуре (максимальная скорость), и осторожно выбросьте этанол. Повторите описанную выше процедуру один раз. </li></ol> 3. гомогенизация депарафинировали сердечников <ol><li> Ресуспендируют ядер в 700 мкл этанола (100%) перед гомогенизацией. С помощью гомогенизатора моторизованный ткани, измельчить ядра на частицы тонких тканей (~ 1 мин на среднем уровне). Очистите гомогенизатора зонд между каждого образца, чтобы свести к минимуму перенос средств загрязнения. <ol><li> Заполните 15 мл пробирки с ~ 10 мл отбеливающего раствора, нейтрализующего РНКазы и 70% этанола. После того, как образец гомоgenization, моют гомогенизатора зонд в каждой из моющих растворов в порядке, установленном выше. Запуск гомогенизатора на самой высокой скорости в течение стадии промывки. </li><li> Протрите зонд с тканью и позволяют зонд полностью высохнуть перед гомогенизацией следующего образца. Осмотреть ножи зонда для деталей остаточной ткани. Если будет установлено, очистите зонд снова. Изменить чистящие растворы (хлорная известь, этанол и РНКазы нейтрализующим раствором) ежедневно. </li></ol></li><li> После гомогенизации, довести объем пробы до 1 мл добавлением более 100% этанола (~ 300 мкл). Центрифуга на максимальной скорости в течение 15 мин, тщательно аспирата этанола и воздуха сухой осадок в течение приблизительно 15-20 мин, прежде чем приступить к экстракции РНК. </li></ol> 4. Пищевое расщепление с помощью протеиназы К <ol><li> Ресуспендируют осадок в 150 мкл протеиназы К переваривания буфера и выкидной трубки, чтобы ослабить осадок. Добавляют 10 мкл теплоустойчивая протеиназы К и смешивать Смахивающее (невихревой трубки). Выдержите содержание в трубке при 56 ° С в течение 15 мин при осторожном перемешивании. </li><li> Разрешить трубки для инкубирования на льду в течение 3 мин. Полное охлаждение имеет важное значение для эффективного осаждения на следующей стадии. Центрифуга в течение 15 мин при максимальной скорости. </li></ol> 5. Отдельные РНК из ДНК <ol><li> Тщательно передачи супернатант, не нарушая гранул, к новому 1,5 мл для очистки РНК. </li><li> Хранить гранулы для очистки ДНК (осадок может храниться в течение 2 ч при комнатной температуре, в течение 1 дня при температуре 2-8 ° С, или в течение более длительных периодов при температуре от -20 &amp; deg; C). </li></ol> 6. РНК Очистка <ol><li> Выдержите РНК-содержащий супернатант при 80 ° С в течение 15 мин (не превышают этот раз). Далее кратко отцентрифугировать пробирку для сбора капель с внутренней стороны крышки. </li><li> Добавьте 320 мкл буфера RLT скорректировать обязательные условия, и перемешать с помощью пипетки. Затем добавляют 720 мкл этанола (100%), и вихрь. </li><li> Передача 600 мкл образца, в том числе любого осадка, который может быть сформирован, чтобы спина РНК колонке (поставляется в комплекте), помещенного в пробирку для сбора 2 мл и отложить в сторону остального контента. Центрифуга в течение 15 сек при ≥8,000 XG, отбросить проточные и повторно использовать пробирку для сбора. </li><li> Передача оставшегося образца на колонку, в том числе капель, которые могут накапливаться в крышке трубки, центрифуги в течение 15 сек при ≥8,000 XG, и отбросить проточные. </li><li> Добавьте 350 мкл буфера FRN в колонке спина и центрифуги в течение 15 сек при ≥8,000 XG, отбросить проточные и повторно использовать пробирку для сбора. </li><li> Аккуратно смешайте 10 мкл ДНКазы I маточного раствора с 70 мкл буфера RDD, добавляют непосредственно к мембране ротационную колонку, и инкубируют при комнатной температуре в течение 15 мин. </li><li> Добавить 500 мкл буфера для FRN в ротационную колонку, центрифугу в течение 15 сек при ≥8,000 XG и сохранить проточные для использования на следующей стадии. Для повышения коэффициента извлечения малых РНК, поместите столбец спина вНовая коллекция трубки и 2 мл применяют проточные из предыдущего шага в ротационную колонку. </li><li> Центрифуга в течение 15 сек при ≥8,000 XG, отбросить проточные и повторное использование сбора трубки в следующей стадии. Добавить 500 мкл буфера RPE к колонке спина и центрифуги в течение 15 сек при ≥8,000 XG, отбросить проточные и повторное использование сбора трубки на следующем шаге. </li><li> Добавить 500 мкл буфера RPE к колонке спина и центрифуги в течение 15 сек при ≥8,000 XG и выбросить пробирку для сбора с проточные. </li><li> Поместите колонку отжиму в новой коллекторной трубки 2 мл, откройте крышку и центрифуге при максимальной скорости в течение 5 мин. Откажитесь отборная труба с проточные. </li><li> Поместите колонку спина в новой коллекции 1,5 мл, добавляют 20 мкл РНКазы воды непосредственно на мембрану спиновой колонки и инкубировать трубку в течение 1 мин при комнатной температуре. Центрифуга на максимальной скорости в течение 1 мин для элюции РНК. Хранить элюированный образец РНК при температуре -80 ° С. </li></ol><ol><li> Ресуспендируют осадок , полученный при экстракции РНК путем ступенчатого добавлением 45 мкл протеиназы К буфера (400 мМ Трис - 7,5, 400 мМ NaCl, 3 мМ MgCl 2, 4% SDS); 45 мкл H 2 O; и 400 мкг высокой потенции протеиназы К. </li><li> Выдержите вышеуказанного раствора при 56 ° С в течение 24 ч (предпочтительно) или в течение ночи. Performincubation при 90 ° С в течение 2 ч без перемешивания и кратко центрифуге микроцентрифужных трубки для сбора капель с внутренней стороны крышки. </li><li> Дайте образец остыть до комнатной температуры и затем добавляют 4 мкл РНКазы А (100 мг / мл). Инкубируйте образца в течение 2 мин при комнатной температуре. </li><li> Добавить 200 мкл буфера для искусственного интеллекта к образцу, и тщательно перемешать встряхиванием. Затем добавляют 200 мкл 100% этанола, и тщательно перемешать встряхиванием. Перенесите весь образец предоставленному ротационную колонку, место в пробирку для сбора 2 мл, и центрифугировать в течение 1 мин при ≥8,000 х г. </li><li> Откажитесь отборная труба спроточный и поместите колонку спина в новой коллекции трубки 2 мл. Добавить 700 мкл буфера AW1 в ротационную колонку, центрифуги в течение 15 сек при ≥8,000 XG, отбросить проточные и повторно использовать пробирку для сбора. </li><li> Добавить 700 мкл буфера aw2 в ротационную колонку, центрифуги в течение 15 сек при ≥8,000 XG, отбросить проточные и повторно использовать пробирку для сбора. Затем добавьте 700 мкл 100% этанола в ротационную колонку, центрифуге в течение 15 секунд при ≥8,000 XG и выбросить пробирку для сбора с проточные. </li><li> Поместите колонку спина в новой коллекции трубки 2 мл, откройте крышку спиновой колонки и центрифугу на полной скорости в течение 5 мин. Откажитесь отборная труба с проточные. </li><li> Поместите колонку отжима в новой 1,5 мл пробирку для сбора и добавить 25 мкл нагретого нуклеазы без воды (50 ° C). Инкубируйте колонку и трубку при 50 ° С в течение 10 мин. Центрифуга в течение 1 мин при максимальной скорости, добавить 25 мкл нуклеазы без воды (RT) в колонну и инкубировать1 мин при комнатной температуре. </li><li> Центрифуга в течение 1 мин при максимальной скорости (21130 XG) и сбора урожая проточных, содержащей геномную ДНК (примерно 50 мкл ДНК в общей сложности). Хранить колонку при -20 ° C (в случае, если требуется другая элюирование позже). </li></ol>

<ol>
	<li>Kern, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+your+new+cancer+biomarker+may+never+work:+recurrent+patterns+and+remarkable+diversity+in+biomarker+failures.">Why your new cancer biomarker may never work: recurrent patterns and remarkable diversity in biomarker failures.</a> Cancer Res. 72 (23), 6097-6101 (2012).</li><li>Klopfleisch, R., Weiss, A. T. A., Gruber, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excavation+of+a+buried+treasure--DNA,+mRNA,+miRNA+and+protein+analysis+in+formalin+fixed,+paraffin+embedded+tissues.">Excavation of a buried treasure--DNA, mRNA, miRNA and protein analysis in formalin fixed, paraffin embedded tissues.</a> Histol. Histopathol. 26 (6), 797-810 (2011).</li><li>Beltran, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+Next-generation+Sequencing+of+Advanced+Prostate+Cancer+Identifies+Potential+Therapeutic+Targets+and+Disease+Heterogeneity.">Targeted Next-generation Sequencing of Advanced Prostate Cancer Identifies Potential Therapeutic Targets and Disease Heterogeneity.</a> Eur. Urol. 63 (5), 920-926 (2013).</li><li>Hoppin, J. A., Tolbert, P. E., Taylor, J. A., Schroeder, J. C., Holly, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+for+selection+bias+with+tumor+tissue+retrieval+in+molecular+epidemiology+studies.">Potential for selection bias with tumor tissue retrieval in molecular epidemiology studies.</a> Ann. Epidemiol. 12 (1), 1-6 (2002).</li><li>von Ahlfen, S., Missel, A., Bendrat, K., Schlumpberger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinants+of+RNA+quality+from+FFPE+samples.">Determinants of RNA quality from FFPE samples.</a> PLOS ONE. 2 (12), e1261 (2007).</li><li>Masuda, N., Ohnishi, T., Kawamoto, S., Monden, M., Okubo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+chemical+modification+of+RNA+from+formalin-fixed+samples+and+optimization+of+molecular+biology+applications+for+such+samples.">Analysis of chemical modification of RNA from formalin-fixed samples and optimization of molecular biology applications for such samples.</a> Nucleic Acids Res. 27 (22), 4436-4443 (1999).</li><li>Pikor, L. A., Enfield, K. S. S., Cameron, H., Lam, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+extraction+from+paraffin+embedded+material+for+genetic+and+epigenetic+analyses.">DNA extraction from paraffin embedded material for genetic and epigenetic analyses.</a> J. Vis. Exp. (49), (2011).</li><li>Turashvili, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleic+acid+quantity+and+quality+from+paraffin+blocks:+defining+optimal+fixation,+processing+and+DNA/RNA+extraction+techniques.">Nucleic acid quantity and quality from paraffin blocks: defining optimal fixation, processing and DNA/RNA extraction techniques.</a> Exp. Mol. Pathol. 92 (1), 33-43 (2012).</li><li>Espina, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-capture+microdissection.">Laser-capture microdissection.</a> Nat. Protoc. 1 (2), 586-603 (2006).</li><li>Hackler, L., Masuda, T., Oliver, V. F., Merbs, S. L., Zack, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+laser+capture+microdissection+for+analysis+of+retinal+mRNA/miRNA+expression+and+DNA+methylation.">Use of laser capture microdissection for analysis of retinal mRNA/miRNA expression and DNA methylation.</a> Methods Mol. Biol. 884, 289-304 (2012).</li><li>Bonin, S., Stanta, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleic+acid+extraction+methods+from+fixed+and+paraffin-embedded+tissues+in+cancer+diagnostics.">Nucleic acid extraction methods from fixed and paraffin-embedded tissues in cancer diagnostics.</a> Expert Rev. Mol. Diagn. 13 (3), 271-282 (2013).</li><li>Bonin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicentre+validation+study+of+nucleic+acids+extraction+from+FFPE+tissues.">Multicentre validation study of nucleic acids extraction from FFPE tissues.</a> Virchows Archiv. 457 (3), 309-317 (2010).</li><li>Montaser-Kouhsari, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-guided+Coring+for+Large-scale+Studies+in+Molecular+Pathology.">Image-guided Coring for Large-scale Studies in Molecular Pathology.</a> Appl. Immunohistochem. Mol. Morphol. , (2015).</li><li>van Eijk, R., Stevens, L., Morreau, H., van Wezel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+a+fully+automated+high-throughput+DNA+extraction+method+from+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissue+for+KRAS,+and+BRAF+somatic+mutation+analysis.">Assessment of a fully automated high-throughput DNA extraction method from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue for KRAS, and BRAF somatic mutation analysis.</a> Exp. Mol. Pathol. 94 (1), 121-125 (2013).</li><li>Ghatak, S., Sanga, Z., Pautu, J. L., Kumar, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coextraction+and+PCR+Based+Analysis+of+Nucleic+Acids+From+Formalin-Fixed+Paraffin-Embedded+Specimens.">Coextraction and PCR Based Analysis of Nucleic Acids From Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Specimens.</a> J. Clin. Lab. Anal. , (2014).</li><li>Hennig, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+extraction+of+DNA+and+RNA+from+a+single+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissue+section+for+analysis+of+both+single-nucleotide+polymorphisms+and+mRNA+expression.">Automated extraction of DNA and RNA from a single formalin-fixed paraffin-embedded tissue section for analysis of both single-nucleotide polymorphisms and mRNA expression.</a> Clin. Chem. 56 (12), 1845-1853 (2010).</li><li>Snow, A. N., Stence, A. A., Pruessner, J. A., Bossler, A. D., Ma, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+cost-effective+method+of+DNA+extraction+from+small+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissue+for+molecular+oncologic+testing.">A simple and cost-effective method of DNA extraction from small formalin-fixed paraffin-embedded tissue for molecular oncologic testing.</a> BMC Clin. Pathol. 14 (1), 30 (2014).</li><li>Torrente, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+extraction+from+formalin-fixed+laryngeal+biopsies:+Comparison+of+techniques.">DNA extraction from formalin-fixed laryngeal biopsies: Comparison of techniques.</a> Acta Otolaryngol. 131 (3), 330-333 (2011).</li><li>Okello, J. B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+methods+in+the+recovery+of+nucleic+acids+from+archival+formalin-fixed+paraffin-embedded+autopsy+tissues.">Comparison of methods in the recovery of nucleic acids from archival formalin-fixed paraffin-embedded autopsy tissues.</a> Anal. Bochem. 400 (1), 110-117 (2010).</li><li>Abramovitz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+RNA+extraction+from+FFPE+tissues+for+expression+profiling+in+the+DASL+assay.">Optimization of RNA extraction from FFPE tissues for expression profiling in the DASL assay.</a> BioTechniques. 44 (3), 417-423 (2008).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> AllPrep DNA/RNA FFPE Handbook. , (2012).</li><li>Laurent, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meeting+report:+discussions+and+preliminary+findings+on+extracellular+RNA+measurement+methods+from+laboratories+in+the+NIH+Extracellular+RNA+Communication+Consortium.">Meeting report: discussions and preliminary findings on extracellular RNA measurement methods from laboratories in the NIH Extracellular RNA Communication Consortium.</a> Journal of Extracell. Vesicles. 4, (2015).</li><li>. Methods of RNA Quality Assessment Available from: <a target="_blank" href="https://www.promega.ca/resources/pubhub/methods-of-rna-quality-assessment">https://www.promega.ca/resources/pubhub/methods-of-rna-quality-assessment</a> (2012)</li><li>Herman, J. G., Graff, J. R., Myohanen, S., Nelkin, B. D., Baylin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methylation-specific+PCR:+a+novel+PCR+assay+for+methylation+status+of+CpG+islands.">Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG islands.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93 (18), 9821-9826 (1996).</li><li>Weisenberger, D. J., Campan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+repetitive+element+DNA+methylation+by+MethyLight.">Analysis of repetitive element DNA methylation by MethyLight.</a> Nucleic acids research. 33 (21), 6823-6836 (2005).</li><li>Yegnasubramanian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypermethylation+of+CpG+Islands+in+Primary+and+Metastatic+Human+Prostate+Cancer.">Hypermethylation of CpG Islands in Primary and Metastatic Human Prostate Cancer.</a> Cancer Res. 64 (6), 1975-1986 (2004).</li><li>Parsons, M., Grabsch, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+make+tissue+microarrays.">How to make tissue microarrays.</a> Diagn. Histopathol. 15 (3), 142-150 (2009).</li></ol>

The authors declare no competing financial interests.

Для успешного извлечения ДНК и РНК из тканей областей, представляющих интерес, точный отбор керна имеет решающее значение. Этот протокол описывает использование штампа ткани для изоляции стержней диаметром 0,6 мм и описывается процесс переноса нотации из стекла микроскопа в соответствующие FFPET блоки. Изменения в протоколе изготовителя были необходимы для эффективного извлечения нуклеиновых кислот из ядер, которые примерно в 50 раз толще, чем микротомных секций, для которых протокол был предназначен. Поскольку ядра могут содержать больше парафина относительно срезов тканей, эффективной депарафинизации ядер посредством повторных этапов ксилола и обработки этанола требуется. Успех шагов после депарафинизации зависит от правильной механической сердечников ткани гомогенизации и эффективность протеиназы К пищеварения. Дальнейшая оптимизация протеиназы К пищеварения может быть выполнена. Стоит отметить, что этот метод идентифицируетFies области, представляющие интерес на поверхности блока, как они определены в соответствующих гистопатологией слайдов. В качестве основных урожаями ткани, которая может быть 3 или 4 мм, пользователи этого протокола могут быть обеспокоены тем, что клетки или ткани лежат под поверхностью блока. Хотя это действительный интерес, многочисленные исследования (обзор в ссылке 27) показали , что ядра ткани точно представляют гистологические и молекулярные особенности блоков патологических тканей, особенно при двух или трех повторностях ядер отбираются из зоны интереса. По мере того как модифицированный коммерческий набор для выделения принятой в данном протоколе обеспечивает одновременное извлечение ДНК и РНК из той же ткани, протокол сохраняет драгоценное биологический материал и позволяет проводить прямое сравнение между двумя результирующими нуклеиновых кислот из того же образца. Параллельное извлечение РНК и ДНК сокращает истощение труда и ткани в два раза, и позволяет точно комплексный анализ гена выражession, а также эпигенетические и генетические особенности, найденные в ДНК. Поскольку урожайность как РНК и ДНК из этих ядер представительных тканей, как правило, превышает 600 и 300 нг, соответственно, и так как большинство современных ПЦР и секвенирования следующего поколения приложений, как правило, требуют 10-100 нг, большинство образцов очищенных этим протоколом должны обеспечивать адекватное материал для нескольких последующих анализов. Этот протокол был показано, воспроизводимые через независимые лаборатории (Selvarajah и др., В стадии подготовки.). РНК из этого протокола было достаточного качества для анализа экспрессии генов с использованием либо RT-PCR или популярную платформу multianalyte, и ДНК хорошо зарекомендовал себя в метилирования конкретных ПЦР-анализов. Будущие исследования, направленные на оценку полезности добываемых нуклеиновых кислот в следующей последовательности поколения являются оправданными. Таким образом, несколько модификаций были сделаны к коммерчески доступным протокол, предназначенный для тонких срезов FFPET, что делает его подходящим FOг совместное извлечение РНК и ДНК из ядер FFPET 0,6 мм. Протокол продемонстрировал стабильно высокие урожаи в большой группе образцов рака простаты и в ограниченном наборе образцов из рака молочной железы, головного мозга и мочевого пузыря. В целом, протокол должен позволить пользователям осуществлять целевые анализы генов на основе крупных хорошо аннотированных коллекций тканей. Важно отметить, что протокол позволяет эффективно осуществлять целенаправленную выборку областей, представляющих интерес в FFPET, относительно мало практического времени, и достаточно высокие урожаи для большинства последующих применений.

Геномные исследования биомаркеров стремится идентифицировать молекулярные коррелятов , которые точно и достоверно отражают состояние заболевания, и сделать это в клинически полезным образом. 1 Развитие биомаркеров зависит от ретроспективного анализа хорошо аннотированных образцов ткани. Пораженные и нормальные образцы ткани хранятся либо в виде свежезамороженной ткани в специализированных биобанках или в виде фиксированных формалином парафин ткани (FFPET) блоков в клинических архивах. Свежезамороженной ткани позволяет для извлечения высококачественных нуклеиновых кислот и широко используется в геномных исследованиях биомаркеров. 2,3 Однако меньшее количество образцов ткани доступны в биобанках и изучение такой ткани вводит уклон в сторону больших образцов, необычных категорий болезни, и пациенты видели в специализированных центрах с большими способностями к банковской ткани. 4 FFPET, напротив, является способ хранения по умолчанию для пораженных тканей человека и животных. В то время как FFPET блоки поддержания клеточного мorphology, процесс фиксации сшивает других клеточных составляющих нуклеиновых кислот. Сшитый РНК и ДНК могут быть возмещены, но только в деградированных, сильно фрагментированных форм. 5,6 Тем не менее, эти ДНК и РНК - фрагменты могут быть подвергнуты анализу с помощью расширяющегося множества анализов, в том числе экспрессию мРНК, гиперметилировании ДНК и целевой последовательности. 7,8 Чтобы воспользоваться этой возможностью , в большом количестве и разнообразии FFPET доступных для исследования, существует необходимость эффективного и надежного протокола экстракции. Большая часть исследований биомаркеров в тканях фокусируется на рак. Как и другие виды патологической ткани, ткани рака часто показывает значительную региональную неоднородность в сохранении клеток и типа клеток. Так как биомаркер исследования опираются на возможности коррелировать составляющие пораженной ткани с молекулярными особенностями, важным шагом этого процесса является точная заготовка ткани, которая хорошо сохраняется и обогащается за дisease в стадии изучения. В FFPET два метода обогащения часто используются: лазерный захват микродиссекции (LCM), и микротом секционирования. LCM позволяет узкоспециализированные сбор тканей и могут быть использованы для выделения конкретных, хорошо сохранившиеся типы клеток в гетерогенных тканях. 9,10 Тем не менее, LCM требует дорогостоящего оборудования и запредельно отнимает много времени у большого количества образцов. Микротомных секционирования является более широко используется процесс , в котором тонкие секции вырезают из FFPET блоков. 11,12 микротомных нарезанные участки часто включают в себя ткань, которая неоднородна по сохранению клеток (например, некротический против хорошо сохранившееся) и состав (например, рак по сравнению с доброкачественными паренхимы), и, следовательно, может привести к усреднению молекулярных особенностей наиболее изученным отдельно. Таким образом, существует потребность в высокой пропускной способности метода, обогащающий для клеток, представляющих интерес. Третий способ, выделение нуклеиновых кислот из FFPET ядер, обеспечивает это обогащение, подходит для высокой через вhput протоколы, и был использован другими для выделения РНК или ДНК из отдельных сердечников ткани. 7,13,14 Ряд опубликованных протоколов указать способы извлечения нуклеиновых кислот из FFPET (таблица 1). Тем не менее, протоколы , где РНК и ДНК , извлеченные из той же ткани были оптимизированы для секций микротомных ткани, но не для сердечников ткани. 15,16 Аналогичным образом , опубликованные протоколы , которые обеспечивают повышенную тканевую специфичность, либо через сердечники ткани или слайд microdissections, определяют процедуры для экстракции ДНК, но не РНК. 7,17 Здесь, оптимизированный протокол для двойной экстракции ДНК и РНК из того же ядра ткани демонстрируется. Тканевые сердечники собирают путем вставки ткани микрочипов (TMA) пуансоны в регионах, представляющих интерес, отображенных на FFPET блоков. Отображение выполняется аннотирования предметного стекла микроскопа с маркером и передачи аннотацию к поверхности соответствующего FFPET блок (Рисунок 1). До работы, что привело к разработке этого протокола включал сравнение нескольких коммерчески доступных систем нуклеиновых кислот экстракции. В этом сравнении, модификации коммерческих протоколов, как описано ниже , при условии , что самые высокие ДНК и РНК урожайность и качество (Selvarajah и др., В стадии подготовки). Тканевые сердечники толще секций микронных 5-10 мкм , обычно используемых при экстракции протоколов FFPET 11,12,14,18 - 20, и может содержать более переменные количества парафина. Чтобы компенсировать это, Депарафинирование был усилен повторением ксилола и этанола и лечения путем введения моторизованный стадии гомогенизации (рисунок 1). Кроме того, протеиназы K раз пищеварением были удлинены, чтобы увеличить выход ДНК. В целом, этот протокол является экономически эффективным и позволяет установить связи между молекулярными и гистологических признаков заболевания в Лос-АнджелесеRGE, хорошо охарактеризованных популяции. Протокол в целом может быть осуществлено надежно в течение 2-х дней, в том числе 3 ч от практического времени, с особой необходимости в специализированной или дорогостоящего оборудования. Протокол шаг за шагом, в дальнейшем в качестве модифицированной версии протокола производителя. 21 Пожалуйста , смотрите таблицу материалов / оборудования для конкретных реагентов, оборудования и производителей.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="786">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Plastic paraffin film, &#34;Parafilm &#39;M&#39;&#34;</td>
			<td style="width:217px;">Bemis&#160;</td>
			<td style="width:119px;">RK-06720-40</td>
			<td style="width:167px;">Any generic paraffin film will work as a substitute</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Sodium Hypochlorite, &#34;Ultra Bleach&#34;</td>
			<td style="width:217px;">Likewise</td>
			<td style="width:119px;">53-2879-2</td>
			<td>Any generic bleach will work as a substitute. Hazardous material that can cause burns on contact.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:283px;">Molecular biology grade absolute ethanol</td>
			<td style="width:217px;">Fisher BioReagents</td>
			<td style="width:119px;">BP2818-500</td>
			<td>Sigma-Aldrich E7023 suffices as a substitute</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Molecular Grade H2O</td>
			<td style="width:217px;">G-Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">786-293</td>
			<td>Sigma W4502 suffices, as well as any other brand of molecular grade H2O</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:283px;">0.6mm Punch Set for Beecher Instruments&#160;</td>
			<td style="width:217px;">Estigen</td>
			<td style="width:119px;">MPO6[Yellow]</td>
			<td>Make sure to use the red receiver punch from the set</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Fine point permanent marker</td>
			<td style="width:217px;">Sharpie</td>
			<td style="width:119px;">10365796S</td>
			<td>Using the marker on FFPE tissues causes it to dry out quickly, so several may be required</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">FFPE tissue block</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:283px;">Stained tissue slide corresponding to FFPE block</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">1.5 mL Micro-Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:217px;">Fisher BioReagents</td>
			<td style="width:119px;">05-408-137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:283px;">2.0 mL Low binding tubes (LoBind Micro-Centrifuge Tubes)</td>
			<td style="width:217px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">22431048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:283px;">1.5 mL Low binding tubes (LoBind Micro-Centrifuge Tubes)</td>
			<td style="width:217px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">22431021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Histology Xylene</td>
			<td style="width:217px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">CA 95057-822</td>
			<td>Fisher Scientific X5-500 suffices as a substitute</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Molecular Biology Grade 2-Propanol</td>
			<td style="width:217px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">I9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:283px;">AllPrep FFPE DNA/RNA Kit&#160;</td>
			<td style="width:217px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">80234</td>
			<td>Prepare buffers accodring to the AllPrep DNA/RNA FFPE Handbook21</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:283px;">Buffers: RLT, FRN, RPE, ATL, AL, AW1, AW2, DNaseI solution</td>
			<td style="width:217px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">80234</td>
			<td>Prepare buffers accodring to the AllPrep DNA/RNA FFPE Handbook21</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Temperature stable proteinase K</td>
			<td style="width:217px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">80234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">High potency proteinase K</td>
			<td style="width:217px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">25530-049</td>
			<td>Invitrogen 25530-015 suffices as a substitute</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNAse neutralizing solution (Rnase AWAY)</td>
			<td style="width:217px;">Molecular BioProducts</td>
			<td style="width:119px;">7003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">RNaseA 100mg/mL</td>
			<td style="width:217px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">19101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">BD Integra Syringe 3mL 21G x 1/2</td>
			<td style="width:217px;">BD&#160;</td>
			<td style="width:119px;">305274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:283px;">Motorized tissue homogenizer (TissueRuptor)</td>
			<td style="width:217px;">Qiagen&#160;</td>
			<td style="width:119px;">9001271</td>
			<td>Fisher Scientific 14-261-29 suffices as a substitute</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">-20&#176;C and -80&#176;C Laboratory Freezer &#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:283px;">Micro-Centrifuge with rotor for 2mL tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Digital Vortex Mixer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Pipettes and filter tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Heating blocks or water baths</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Tris Hydrochloride&#160;</td>
			<td style="width:217px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;">0234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Sodium Chloride&#160;</td>
			<td style="width:217px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;">0241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Anhydrous Magnesium Chloride</td>
			<td style="width:217px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Sodium Dodecyl Sulfate</td>
			<td style="width:217px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">L4509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:283px;">Acrodisc 25mm syring filters with 0.45 um Supor membrane</td>
			<td style="width:217px;">Pall</td>
			<td style="width:119px;">PN 4614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:283px;">Syringe with retracting BD PrecisionGlide needle 3mL</td>
			<td style="width:217px;">BD Integra</td>
			<td style="width:119px;">305274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Hydrochloric Acid</td>
			<td style="width:217px;">BDH</td>
			<td style="width:119px;">3026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:283px;">Multianalyte gene expression platfrom (nCounter &#174; CAE codeset and Nanostring nCounter platform)</td>
			<td style="width:217px;">Nanostring nCounter platform, Nanostring</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:283px;">Fluorometric nucleic acid quantification (Qubit dsDNA HS Assay Kit and Qubit&#174; RNA BR Assay Kit)</td>
			<td style="width:217px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of formalin-fixed paraffin-embedded tissue cores for both rna and dna extraction

Formalin-fixed paraffin embedded tissue (FFPET) represents a valuable, well-annotated substrate for molecular investigations. The utility of FFPET in molecular analysis is complicated both by heterogeneous tissue composition and low yields when extracting nucleic acids. A literature search revealed a paucity of protocols addressing these issues, and none that showed a validated method for simultaneous extraction of RNA and DNA from regions of interest in FFPET. This method addresses both issues. Tissue specificity was achieved by mapping cancer areas of interest on microscope slides and transferring annotations onto FFPET blocks. Tissue cores were harvested from areas of interest using 0.6 mm microarray punches. Nucleic acid extraction was performed using a commercial FFPET extraction system, with modifications to homogenization, deparaffinization, and Proteinase K digestion steps to improve tissue digestion and increase nucleic acid yields. The modified protocol yields sufficient quantity and quality of nucleic acids for use in a number of downstream analyses, including a multi-analyte gene expression platform, as well as reverse transcriptase coupled real time PCR analysis of mRNA expression, and methylation-specific PCR (MSP) analysis of DNA methylation.

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Formalin-fixed Paraffin-embedded Tissue Cores for both RNA and DNA Extraction at JoVE.com

Preparation of Formalin-fixed Paraffin-embedded Tissue Cores for both RNA and DNA Extraction

Этот модифицированный протокол экстракции улучшает РНК и ДНК урожаи от более точно целевых областей, представляющих интерес в блоках гистологических тканей.

Получение формалином фиксированных залитых парафином тканей Ядра как для РНК и ДНК экстракции

Formalin-fixed paraffin embedded tissue (FFPET) represents a valuable, well-annotated substrate for molecular investigations. The utility of FFPET in ...

Research

JoVE Journal

Biology

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Парафин и замороженные Разделы Drosophila Мышцы взрослых

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

DNA Extraction from Paraffin Embedded Material for Genetic and Epigenetic Analyses

Экстракции ДНК из парафин материала для генетических и эпигенетических Анализы

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number ...

Extraction of Tissue Antigens for Functional Assays

Добыча тканевых антигенов для функциональных анализов

Many of the antigen targets of adaptive immune response, recognized by B and T cells, have not been defined 1. This is particularly true in autoimmune ...

Proteomic Sample Preparation from Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissue

Протеомный Подготовка образцов из фиксированных формалином и залитых парафином ткани

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale ...

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

МикроРНК<em&gt; В месте</em&gt; Гибридизация на формалин ткани почки

In this article we describe a method for colorimetric detection of miRNA in the kidney through in situ hybridization with digoxigenin tagged microRNA ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

В режиме реального времени изображений Единого Engineered РНК-транскриптов в живых клетках, используя Логометрический Бимолекулярные маяки

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

qPCR Is a Sensitive and Rapid Method for Detection of Cytomegaloviral DNA in Formalin-fixed, Paraffin-embedded Biopsy Tissue

КПЦР является чувствительным и быстрый метод для обнаружения цитомегаловирусной ДНК в формалине фиксированной парафин биопсии ткани

It is crucial to identify cytomegalovirus (CMV) infection in the gastrointestinal (GI) tract of immunosuppressed patients, given their greater risk for ...

Employing Digital Droplet PCR to Detect BRAF V600E Mutations in Formalin-fixed Paraffin-embedded Reference Standard Cell Lines

Используя цифровой капли ПЦР для обнаружения гена BRAF V600E Мутации в формалине фиксированной в парафин Ссылка на стандарт клеточных линиях

ddPCR is a highly sensitive PCR method that utilizes a water-oil emulsion system. Using a droplet generator, an extracted nucleic acid sample is ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

Фильтрация Выделение нуклеиновых кислот: Простой и быстрый ДНК Метод экстракции

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

TChIP-Seq: Cell-Type-Specific Epigenome Profiling

TChIP-Seq: Профилирование конкретного типа ячейки Epigenome

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological ...