Name: reprogramming mouse embryonic fibroblasts with transcription factors to induce a hemogenic program
Uploaded: 2016-12-16T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with Transcription Factors to Induce a Hemogenic Program at JoVE.com

This work was supported by an NHLBI grant to K.M. and I.R.L. (1RO1HL119404). Carlos-Filipe Pereira was the recipient of a Revson Senior Biomedical Fellowship. We gratefully acknowledge the Mount Sinai hESC/iPSC Shared Resource Facility and S. D'Souza for assistance with materials and protocols. We also thank the Mount Sinai Flow Cytometry, Genomics, and Mouse facilities.

بيان الأخلاق: وتستمد خطوط الخلايا الماوس فقا للمبادئ التوجيهية رعاية الحيوان من مدرسة طب ماونت سيناي، وينبغي أن يتم وفقا لأية مؤسسة المضيف. 1. الفأر الجنينية الخلايا الليفية (MEF) عزل C57BL / 6 الفئران <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;directio...

<ol>
	<li>Zovein, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+tracing+reveals+the+endothelial+origin+of+hematopoietic+stem+cells.">Fate tracing reveals the endothelial origin of hematopoietic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 3 (6), 625-636 (2008).</li><li>Bertrand, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haematopoietic+stem+cells+derive+directly+from+aortic+endothelium+during+development.">Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development.</a> Nature. 464 (7285), 108-111 (2010).</li><li>Papapetrou, E. P., Sadelain, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstructing+blood+from+induced+pluripotent+stem+cells.">Reconstructing blood from induced pluripotent stem cells.</a> F1000 Med Rep. 2, (2010).</li><li>Szabo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+conversion+of+human+fibroblasts+to+multilineage+blood+progenitors.">Direct conversion of human fibroblasts to multilineage blood progenitors.</a> Nature. 468 (7323), 521-526 (2010).</li><li>Mitchell, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+evidence+for+OCT4-induced+plasticity+in+adult+human+fibroblasts+required+for+direct+cell+fate+conversion+to+lineage+specific+progenitors.">Molecular evidence for OCT4-induced plasticity in adult human fibroblasts required for direct cell fate conversion to lineage specific progenitors.</a> Stem Cells. 32 (8), 2178-2187 (2014).</li><li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li><li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li><li>Qiu, J., Papatsenko, D., Niu, X., Schaniel, C., Moore, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Divisional+history+and+hematopoietic+stem+cell+function+during+homeostasis.">Divisional history and hematopoietic stem cell function during homeostasis.</a> Stem Cell Reports. 2 (4), 473-490 (2014).</li><li>Riddell, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+committed+murine+blood+cells+to+induced+hematopoietic+stem+cells+with+defined+factors.">Reprogramming committed murine blood cells to induced hematopoietic stem cells with defined factors.</a> Cell. 157 (3), 549-564 (2014).</li><li>Sandler, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+human+endothelial+cells+to+haematopoietic+cells+requires+vascular+induction.">Reprogramming human endothelial cells to haematopoietic cells requires vascular induction.</a> Nature. 511 (7509), 312-318 (2014).</li><li>Daniel, M. G., Pereira, C. F., Lemischka, I. R., Moore, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+a+Hematopoietic+Stem+Cell.">Making a Hematopoietic Stem Cell.</a> Trends Cell Biol. , (2015).</li><li>Pereira, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+a+hemogenic+program+in+mouse+fibroblasts.">Induction of a hemogenic program in mouse fibroblasts.</a> Cell Stem Cell. 13 (2), 205-218 (2013).</li><li>Mader, S. L., Libal, N. L., Pritchett-Corning, K., Yang, R., Murphy, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refining+timed+pregnancies+in+two+strains+of+genetically+engineered+mice.">Refining timed pregnancies in two strains of genetically engineered mice.</a> Lab Anim (NY. 38 (9), 305-310 (2009).</li><li>Jain, K., Verma, P. J., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+handling+of+mouse+embryonic+fibroblasts).">Isolation and handling of mouse embryonic fibroblasts).</a> Methods Mol Biol. 1194, 247-252 (2014).</li><li>Bryja, V., Bonilla, S., Arenas, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+mouse+embryonic+stem+cells.">Derivation of mouse embryonic stem cells.</a> Nat Protoc. 1 (4), 2082-2087 (2006).</li><li>Carey, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+murine+and+human+somatic+cells+using+a+single+polycistronic+vector.">Reprogramming of murine and human somatic cells using a single polycistronic vector.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (1), 157-162 (2009).</li><li>Hockemeyer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+drug-inducible+system+for+direct+reprogramming+of+human+somatic+cells+to+pluripotency.">A drug-inducible system for direct reprogramming of human somatic cells to pluripotency.</a> Cell Stem Cell. 3 (3), 346-353 (2008).</li><li>Taoudi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+hematopoietic+stem+cell+generation+in+the+AGM+region+via+maturation+of+VE-cadherin+CD45++pre-definitive+HSCs.">Extensive hematopoietic stem cell generation in the AGM region via maturation of VE-cadherin+CD45+ pre-definitive HSCs.</a> Cell Stem Cell. 3 (1), 99-108 (2008).</li><li>Gekas, C., K, E. R., H, K. A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+analysis+of+hematopoietic+stem+cells+from+the+placenta.">Isolation and analysis of hematopoietic stem cells from the placenta.</a> J Vis Exp. (16), (2008).</li><li>Lewis, I. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Umbilical+cord+blood+cells+capable+of+engrafting+in+primary,+secondary,+and+tertiary+xenogeneic+hosts+are+preserved+after+ex+vivo+culture+in+a+noncontact+system.">Umbilical cord blood cells capable of engrafting in primary, secondary, and tertiary xenogeneic hosts are preserved after ex vivo culture in a noncontact system.</a> Blood. 97 (11), 3441-3449 (2001).</li><li>Sheridan, J. M., Taoudi, S., Medvinsky, A., Blackburn, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+the+generation+of+reaggregated+organotypic+cultures+that+permits+juxtaposition+of+defined+cell+populations.">A novel method for the generation of reaggregated organotypic cultures that permits juxtaposition of defined cell populations.</a> Genesis. 47 (5), 346-351 (2009).</li><li>Koh, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+cells+for+microscopy+using+cytospin.">Preparation of cells for microscopy using cytospin.</a> Methods Enzymol. 533, 235-240 (2013).</li><li>Orkin, S. H., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoiesis:+an+evolving+paradigm+for+stem+cell+biology.">Hematopoiesis: an evolving paradigm for stem cell biology.</a> Cell. 132 (4), 631-644 (2008).</li><li>Martinez-Agosto, J. A., Mikkola, H. K., Hartenstein, V., Banerjee, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hematopoietic+stem+cell+and+its+niche:+a+comparative+view.">The hematopoietic stem cell and its niche: a comparative view.</a> Genes Dev. 21 (23), 3044-3060 (2007).</li><li>Butler, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+vascular+niche+platform+for+expansion+of+repopulating+human+cord+blood+stem+and+progenitor+cells.">Development of a vascular niche platform for expansion of repopulating human cord blood stem and progenitor cells.</a> Blood. 120 (6), 1344-1347 (2012).</li><li>Gori, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+niche+promotes+hematopoietic+multipotent+progenitor+formation+from+pluripotent+stem+cells.">Vascular niche promotes hematopoietic multipotent progenitor formation from pluripotent stem cells.</a> J Clin Invest. 125 (3), 1243-1254 (2015).</li><li>Bar-Nur, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+conversion+induced+by+pluripotency+factors+involves+transient+passage+through+an+iPSC+stage.">Lineage conversion induced by pluripotency factors involves transient passage through an iPSC stage.</a> Nat Biotechnol. 33 (7), 761-768 (2015).</li><li>Maza, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+acquisition+of+pluripotency+during+somatic+cell+transdifferentiation+with+iPSC+reprogramming+factors.">Transient acquisition of pluripotency during somatic cell transdifferentiation with iPSC reprogramming factors.</a> Nat Biotechnol. 33 (7), 769-774 (2015).</li><li>Kim, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+memory+in+induced+pluripotent+stem+cells.">Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 467 (7313), 285-290 (2010).</li><li>Vaskova, E. A., Stekleneva, A. E., Medvedev, S. P., Zakian, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="Epigenetic+memory:+phenomenon+in+induced+pluripotent+stem+cells.">"Epigenetic memory: phenomenon in induced pluripotent stem cells.</a> Acta Naturae. 5 (4), 15-21 (2013).</li><li>Elcheva, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+induction+of+haematoendothelial+programs+in+human+pluripotent+stem+cells+by+transcriptional+regulators.">Direct induction of haematoendothelial programs in human pluripotent stem cells by transcriptional regulators.</a> Nat Commun. 5, 4372 (2014).</li><li>Vereide, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+expandable,+inducible+hemangioblast+state+regulated+by+fibroblast+growth+factor.">An expandable, inducible hemangioblast state regulated by fibroblast growth factor.</a> Stem Cell Reports. 3 (6), 1043-1057 (2014).</li><li>Batta, K., Florkowska, M., Kouskoff, V., Lacaud, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+reprogramming+of+murine+fibroblasts+to+hematopoietic+progenitor+cells.">Direct reprogramming of murine fibroblasts to hematopoietic progenitor cells.</a> Cell Rep. 9 (5), 1871-1884 (2014).</li></ol>

توليد HSPCs من جديد من الخلايا الجسدية التي يمكن بلوغها بسهولة يوفر طريقة فريدة من نوعها لدراسة تكون الدم في المختبر، وإتاحة الفرصة لليحتمل أن تطبيق هذه التقنية على النظام البشري. ان هذه الترجمة توليد أداة جديدة لدراسة مرض دموي البشري في طبق، وكذلك توفير منصا...

تكون الدم هو عملية التنموية المعقدة حيث برعم الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs) من البطانة مكون للدم الحالية في مجموعة متنوعة من المواقع المكونة للدم الجنينية مثل الأورطي-مناسل-Mesonephros والمشيمة 1،2. عدم القدرة على الثقافة HSCs في المختبر يمنع في تحليل معمق لهذه العملية فضلا عن التطبيق السريري لهذه الدراسات. للتحايل على هذا القيد، حاولت الدراسات السابقة لاستخلاص HSCs دي نوفو إما عن طريق تمايز الخلايا الجذعية المحفزة (الأمنية الخاصة) 3، أو ليونة يتسبب في الخلايا الجسدية والتمايز الموجهة باستخدام وسائل الإعلام برمجة 4،5. هذه الدراسات، ومع ذلك، لا تولد خلايا engraftable الآمنة سريريا أو السماح دراسة تكون الدم التنموي نهائي &quot;في طبق.&quot; عمل الرواية التي وضعتها ياماناكا وزملاؤه إلى توليد حفز الخلايا الجذعية المحفزة (iPSCs) من الخلايا الليفية الجسدية صrovides إطارا للعامل النسخ (TF) استراتيجيات overexpression مقرها في إعادة برمجة الخلايا مصير 6،7. وقد دفع هذا العمل المحققين في مجالات عدة لتوليد أنواع الخلايا الاختيار عن طريق TF إعادة برمجة الخلايا الجسدية التي يمكن الحصول عليها بسهولة. الهدف من استراتيجية إعادة برمجة وصفها هنا للحث على عملية مكون للدم من خلايا جسدية الماوس باستخدام نهج إعادة برمجة فريق العمل القائم بهدف ترجمة تلك النتائج إلى النظام البشري لإعادة برمجة الخلايا الليفية المريض محددة لدراسة تكون الدم البشري في المختبر، و توليد منتجات الدم المريض محددة لنمذجة المرض، اختبار المخدرات، وزرع الخلايا الجذعية. وكانت الخطوة الأولى لضمان إعادة برمجة المناسبة في هذا النظام الماوس لتطوير خط مراسل التي كانت بمثابة قراءة التدريجي للتعبير عن CD34، وهي علامة معروفة في الخلايا الاصلية البطانية وHSCs. للقيام بذلك، استخدمت خطوط الماوس المعدلة وراثيا huCD34-نقل واكتساب التكنولوجيا وتيتو-H2BGFP إلى زالماوس المعدلة وراثيا الخلايا الليفية الجنينية مزدوجة enerate (MEFS)، تدل الآن 34 / H2BGFP، أن يتألق الأخضر على تفعيل المروج CD34 8. يسمح هذا الفحص من مجموعة متنوعة من TFS المعروف أن المطلوب في نقاط مختلفة خلال مواصفات المكونة للدم والتنمية. بدءا من 18 TFS في PMX ناقلات retrovial (تحديدها من خلال التعدين الأدب والتنميط التسمية GFP الاحتفاظ HSCs من قبل وصفها 34 / H2BGFP الفئران)، تم transduced 34 / H2BGFP MEFS مع جميع العوامل ومثقف على AFT024 شهادة الثانوية العامة الداعمة للخلايا اللحمية. بعد الكشف عن 34 تفعيل / H2BGFP، أزيلت TFS في وقت لاحق من كوكتيل إعادة برمجة حتى تم التعرف على مجموعة الأمثل للTFS لتفعيل المراسل. بعد هذه الشاشة الأولية، تم نقل العوامل إلى محرض نظام ناقل pFUW DOX للسماح التعبير السيطرة عليها من TFS. وبما أن هذه نظامين للتحكم DOX تتنافى (34 خلية / H2BGFP وناقلات محرض pFUW)، MEFS منكان مطلوبا من النوع البري C57BL / 6 الفئران. ومن الضروري أيضا أن يقدم المكروية المناسبة لتمكين تكون الدم والمضي قدما وخلق الأسلاف مولد الرمع multilineage. وقد اجتمع الدراسات الحالية محاولة لإعادة برمجة الخلايا الجسدية إلى خلايا جذعية والسلف المكونة للدم (HSPCs) مستويات مختلفة من النجاح 9-11. حتى الآن، لم يتحقق توليد كل من الفأر وHSPCs استنساخها الإنسان مع المدى الطويل والقدرة إعادة إسكانها تجديد الذات باستخدام نفس مجموعة من TFS. في هذا البروتوكول، ونحن نقدم وصفا مفصلا للاستراتيجية المحددة سابقا للحث على بتكاثر تكون الدم في MEFS. علينا أن نبرهن على إدخال مجموعة صغيرة من TFS (Gata2، Gfi1b، الرؤساء الماليين، وEtv6) غير قادر على التحريض على البرنامج التنموي معقدة في المختبر الذي يوفر منصة التي تكون الدم التنموي والتطبيق السريري لإعادة برمجة المكونة للدم يمكن مواصلة درس 12.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45uM filters</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra centrifugal filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC900324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gemini&#39;s Benchmark</td>
			<td>100-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18G needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>305195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20G needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>305175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25G needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>305125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0130-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12605-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myelocult media</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>M5300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCF</td>
			<td>R &#38; D Systems</td>
			<td>455-MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flt3L</td>
			<td>R &#38; D Systems</td>
			<td>427-FL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-3</td>
			<td>R &#38; D Systems</td>
			<td>403-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-6</td>
			<td>R &#38; D Systems</td>
			<td>406-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPO</td>
			<td>R &#38; D Systems</td>
			<td>488-TO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9891-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene (hexadimethrine bromide)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>AL-118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durapore 0.65uM membrane filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>DVPP14250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylcellulose media</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>Methocult M3434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>07904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G-1890 100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFUW-tetO</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid #20321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gata2</td>
			<td>Origene</td>
			<td>MR226728</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gfi1b</td>
			<td>Origene</td>
			<td>MR204861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cFos&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid #19259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Etv6</td>
			<td>Origene</td>
			<td>MR207053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>psPAX2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid #12260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid #12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5670-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FUW-M2rtTA</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid #20342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 x 10 mm culture dishes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>171099</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reprogramming mouse embryonic fibroblasts with transcription factors to induce a hemogenic program

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We first designed a reporter screen using MEFs from human CD34-tTA/TetO-H2BGFP (34/H2BGFP) double transgenic mice. CD34+ cells from these mice label H2B histones with GFP, and cease labeling upon addition of doxycycline (DOX). MEFS were transduced with candidate TFs and then observed for the emergence of GFP+ cells that would indicate the acquisition of a hematopoietic or endothelial cell fate. Starting with 18 candidate TFs, and through a process of combinatorial elimination, we obtained a minimal set of factors that would induce the highest percentage of GFP+ cells. We found that Gata2, Gfi1b, and cFos were necessary and the addition of Etv6 provided the optimal induction. A series of gene expression analyses done at different time points during the reprogramming process revealed that these cells appeared to go through a precursor cell that underwent an endothelial to hematopoietic transition (EHT). As such, this reprogramming process mimics developmental hematopoiesis "in a dish," allowing study of hematopoiesis in vitro and a platform to identify the mechanisms that underlie this specification. This methodology also provides a framework for translation of this work to the human system in the hopes of generating an alternative source of patient-specific hematopoietic stem cells (HSCs) for a number of applications in the treatment and study of hematologic diseases.

تكون الدم هو عملية التنموية المعقدة التي تبدأ في مختلف المواقع الجنينية. الخلايا البطانية مكون للدم الموجودة في هذه المواقع وتثير HSCs عبر خلية في مهدها 23. هذه العملية في الوقت الحاضر لا يمكن استنساخها عن طريق وضع HSCs أو السلائف المكونة للدم في ا?...

Watch this Scientific Journal Video about Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with Transcription Factors to Induce a Hemogenic Program at JoVE.com

Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with Transcription Factors to Induce a Hemogenic Program

The protocol described here details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts via overexpression of a minimal set of transcription factors. This technology may be translated to the human system to provide platforms for future study of hematopoiesis, hematologic disease, and hematopoietic stem cell transplant.

إعادة برمجة الخلايا الليفية الفأر الجنينية مع عوامل النسخ للحث على برنامج مكون للدم

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Direct Induction of Hemogenic Endothelium and Blood by Overexpression of Transcription Factors in Human Pluripotent Stem Cells

الحث المباشر للمكون للدم البطانة Endothelium والدم عن طريق overexpression من العوامل المحفزة النسخ في الإنسان الخلايا الجذعية

During development, hematopoietic cells arise from a specialized subset of endothelial cells, hemogenic endothelium (HE). Modeling HE development in vitro ...

Generating CRISPR/Cas9 Mediated Monoallelic Deletions to Study Enhancer Function in Mouse Embryonic Stem Cells

توليد كريسبر / Cas9 ساطة Monoallelic الحذف لدراسة وظيفة محسن في الخلايا الجذعية الجنينية الماوس

Enhancers control cell identity by regulating tissue-specific gene expression in a position and orientation independent manner. These enhancers are often ...

A Novel Ex Ovo Banding Technique to Alter Intracardiac Hemodynamics in an Embryonic Chicken System

A Novel Ex Ovo Banding Technique to Alter Intracardiac Hemodynamics in an Embryonic Chicken System

رواية<em&gt; البيضة السابقين</em&gt; التطويق وتقنيات لتغيير داخل القلب ديناميكا الدم في نظام الجنينية الدجاج

The new model presented here can be used to understand the influence of hemodynamics on specific cardiac developmental processes, at the cellular and ...

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

عزل خلايا الفئران الجنينية مكون للدم غشائي

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

Protocol for the Direct Conversion of Murine Embryonic Fibroblasts into Trophoblast Stem Cells

بروتوكول التحويل المباشر من الفئران الجنينية الخلايا الليفية إلى الخلايا الجذعية الأرومة الغاذية

Trophoblast stem cells (TSCs) arise as a consequence of the first cell fate decision in mammalian development. They can be cultured in vitro, retaining ...

Collection of Serum- and Feeder-free Mouse Embryonic Stem Cell-conditioned Medium for a Cell-free Approach

جمع Serum- وخالية من تغذية الفأر الجنينية الجذعية المتوسطة مكيفة الخليوي لنهج خالية من خلية

The capacity of embryonic stem cells (ESCs) and induced pluripotent stem cells (iPSCs) to generate various cell types has opened new avenues in the field ...

Assessing Cardiomyocyte Subtypes Following Transcription Factor-mediated Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts

تقييم Cardiomyocyte الأنواع الفرعية بعد إعادة برمجة بوساطة عامل النسخ من الفأر الجنينية الخلايا الليفية

Direct reprogramming of one cell type into another has recently emerged as a powerful paradigm for regenerative medicine, disease modeling, and lineage ...

Suppression of Pro-fibrotic Signaling Potentiates Factor-mediated Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts into Induced Cardiomyocytes

قمع الإشارات برو تليفية يقوي التي تعالج بوساطة معامل إعادة برمجة الخلايا الليفية الجنينية الماوس في Cardiomyocytes المستحث

Trans-differentiation of one somatic cell type into another has enormous potential to model and treat human diseases. Previous studies have shown that ...

Direct Lineage Reprogramming of Adult Mouse Fibroblast to Erythroid Progenitors

توجيه نسب إعادة برمجة الماوس الكبار تنتجها الخلايا الليفية لموروث محمر

Erythroid cell commitment and differentiation proceed through activation of a lineage-restricted transcriptional network orchestrated by a group of cell ...

RNA-based Reprogramming of Human Primary Fibroblasts into Induced Pluripotent Stem Cells

الجيش الملكي النيبالي على إعادة برمجة الليفية الأولية البشرية داخل الخلايا الجذعية المستحثة Pluripotent

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) have proven to be a valuable tool to study human development and disease. Further advancing iPSCs as a regenerative ...