Name: cubic protocol visualizes protein expression at single cell resolution in whole mount skin preparations
Uploaded: 2016-08-04T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about CUBIC Protocol Visualizes Protein Expression at Single Cell Resolution in Whole Mount Skin Preparations at JoVE.com

Agradecemos Australian Bio-Resources (Instituto Garvan, Austrália), o Centro de Recursos Biológicos (UNSW Austrália) e Animal Care &amp; Comissão de Ética para o apoio à experimentação animal. Este trabalho foi financiado pelo Health and Medical Research Council Nacional da Austrália (Project Grant APP1062720). Dr. Cesar P. Canales é beneficiários de uma bolsa de estudos CONICYT-Becas Chile (# 72.101.076). Mr. Bassem Akladios é um receptor da Universidade Prêmio Internacional de Pós-Graduação por UNSW Austrália.

Declaração de Ética: Todos os procedimentos envolvendo indivíduos animais siga as orientações do Comitê de Cuidados com Animais e Ética (ACEC) em UNSW Austrália sob protocolo aprovado ACEC 13 / 64B. 1. Preparação da Transparente tecido da pele do rato Nota: Todos os ratos utilizados neste estudo eram de um C57BL / 6 fundo genético <ol><li> Coleção de tecido da pele do rato. <ol><li> Humanamente eutanásia os ratos por deslocamento cervical. </li><...

<ol>
	<li>Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scratching+the+surface+of+skin+development.">Scratching the surface of skin development.</a> Nature. 445 (7130), 834-842 (2007).</li><li>Watt, F. M., Lo Celso, C., Silva-Vargas, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+stem+cells:+an+update.">Epidermal stem cells: an update.</a> Curr Opin Genet Dev. 16 (5), 518-524 (2006).</li><li>Hardy, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+secret+life+of+the+hair+follicle.">The secret life of the hair follicle.</a> Trends Genet. 8 (2), 55-61 (1992).</li><li>Lim, X., Nusse, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signaling+in+skin+development,+homeostasis,+and+disease.">Wnt signaling in skin development, homeostasis, and disease.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (2), (2013).</li><li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis.">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157 (3), 726-739 (2014).</li><li>Susaki, E. A., Tainaka, K., Perrin, D., Yukinaga, H., Kuno, A., Ueda, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+CUBIC+protocols+for+whole-brain+and+whole-body+clearing+and+imaging.">Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging.</a> Nat Protoc. 10 (11), 1709-1727 (2015).</li><li>Tainaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+imaging+with+single-cell+resolution+by+tissue+decolorization.">Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization.</a> Cell. 159 (4), 911-924 (2014).</li><li>Beverdam, A., Claxton, C., Zhang, X., James, G., Harvey, K. F., Key, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yap+controls+stem/progenitor+cell+proliferation+in+the+mouse+postnatal+epidermis.">Yap controls stem/progenitor cell proliferation in the mouse postnatal epidermis.</a> J Invest Dermatol. 133 (6), 1497-1505 (2013).</li><li>Fuchs, E., Green, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+keratin+gene+expression+during+terminal+differentiation+of+the+keratinocyte.">Changes in keratin gene expression during terminal differentiation of the keratinocyte.</a> Cell. 19 (4), 1033-1042 (1980).</li><li>Braun, K. M., Niemann, C., Jensen, U. B., Sundberg, J. P., Silva-Vargas, V., Watt, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+stem+cell+proliferation+and+lineage+commitment:+visualisation+of+label-retaining+cells+in+wholemounts+of+mouse+epidermis.">Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualisation of label-retaining cells in wholemounts of mouse epidermis.</a> Development. 130 (21), 5241-5255 (2003).</li><li>Hamilton, E., Potten, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+hair+plucking+on+the+turnover+time+of+the+epidermal+basal+layer.">Influence of hair plucking on the turnover time of the epidermal basal layer.</a> Cell Tissue Kinet. 5 (6), 505-517 (1972).</li><li>Morris, R. J., Fischer, S. M., Slaga, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+that+a+slowly+cycling+subpopulation+of+adult+murine+epidermal+cells+retains+carcinogen.">Evidence that a slowly cycling subpopulation of adult murine epidermal cells retains carcinogen.</a> Cancer Res. 46 (6), 3061-3066 (1986).</li><li>Schweizer, J., Marks, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+developmental+study+of+the+distribution+and+frequency+of+Langerhans+cells+in+relation+to+formation+of+patterning+in+mouse+tail+epidermis.">A developmental study of the distribution and frequency of Langerhans cells in relation to formation of patterning in mouse tail epidermis.</a> J Invest Dermatol. 69 (2), 198-204 (1977).</li><li>Chang, H., Wang, Y., Wu, H., Nathans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flat+mount+imaging+of+mouse+skin+and+its+application+to+the+analysis+of+hair+follicle+patterning+and+sensory+axon+morphology.">Flat mount imaging of mouse skin and its application to the analysis of hair follicle patterning and sensory axon morphology.</a> J Vis Exp. (88), e51749 (2014).</li></ol>

Os mecanismos reguladores que controlam o desenvolvimento de pele e homeostase são mais comumente estudada em 2D usando o seccionamento de tecidos e coloração histológica ou rotulagem com anticorpos, que permite apenas uma apreciação restrito da morfologia da pele, populações de células ou a expressão da proteína. Um número de métodos foram desenvolvidos para melhorar a visualização da organização espacial das células e proteínas com uma resolução de uma única célula em 3 dimensões em peças inte...

A pele é essencial para a nossa sobrevivência. É composto por três camadas principais, a epiderme exterior, a derme e hipoderme. A epiderme é um tecido altamente regenerativa. É um epitélio escamoso estratificado, que consiste principalmente de queratinócitos. Queratinócitos nascem na camada basal, e mover-se para cima através das camadas suprabasais diferenciando, e, eventualmente, eles são eliminados na camada córnea exterior cerca de um mês após o seu nascimento. A epiderme se desenvolve uma série de apêndices, incluindo os folículos pilosos e glândulas sebáceas. Os folículos pilosos também regenerar de forma cíclica ao longo da vida 1. A capacidade de regeneração da epiderme é activado pela presença de células estaminais e progenitoras que estão localizados na camada basal da epiderme e folículo capilar interfoliculares 2. Muitas das vias de sinalização têm sido implicados no desenvolvimento e regeneração epidérmica. Alguns destes ocorrem dentroapenas a epiderme, tais como a via hedgehog. Outros eventos de sinalização ocorrem entre derme e epiderme 3. Por exemplo, os sinais de Wnt da derme são considerados como sendo importantes para o desenvolvimento do folículo de cabelo, e que são segregadas por a papila dérmica no início da fase anágena para activar a proliferação de células estaminais / progenitoras do folículo de cabelo e crescimento protuberância folículo piloso 4. É importante compreender os mecanismos celulares e moleculares que controlam o desenvolvimento epidérmica e regeneração para entender melhor como eles podem ser perturbado na doença de pele regenerativa, como câncer de pele. Este artigo descreve um lear C, U nobstructed B chuva Eu cocktails maging e C análise omputational protocolo de 5-7 (cúbico) para esclarecer preparações para a pele de montagem integrais, e visualizar os padrões de expressão de proteína em 3 dimensões com resolução de uma única célula por microscopia confocal. O método envolve a imersão de CUBIC peletecido em dois cocktails químicos à base de aminoálcool. Estas soluções ajustar os índices de refracção da amostra da pele, deixando o tecido transparente e as proteínas intactas, permitindo a imunodetecção de resolução de célula única. Usando este protocolo cúbicos, a proliferação basal e populações de queratinócitos na epiderme interfoliculares e no folículo de cabelo foram fotografadas em biópsias de pele de espessura total de ratinhos de tipo selvagem utilizando anticorpos anti-Keratin14 (K14) e anticorpos anti-Ki67. As glândulas sebáceas em biópsias de pele de tipo selvagem também foram visualizados usando Nile Red coloração. Por último, as populações de queratinócitos basais em tipo selvagem e biópsias de pele YAP2-5SA-Sc hiperplásicos foram comparados 8. Este protocolo permite CUBIC avaliação visual da expressão da proteína em biópsias de pele de espessura total com resolução de uma única célula, e é uma ferramenta importante para apreciar a anatomia da epiderme e defeitos morfológicos na pele de organismos geneticamente modificadosratos, e investigar os mecanismos celulares e moleculares subjacentes ao desenvolvimento da epiderme e regeneração.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1082">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:229px;">P6418</td>
			<td style="width:236px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Ethanol 96% (undenaturated)</td>
			<td style="width:195px;">Chem-supply</td>
			<td style="width:229px;">UN1170</td>
			<td style="width:236px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Nile Red</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>72485-100MG</td>
			<td style="width:236px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4&#8217;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10236276001</td>
			<td style="width:236px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N,N,N&#8217;,N&#8217;-tetrakis (2-hydroxypropyl) ethylenediamine</td>
			<td style="width:195px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:229px;">821940</td>
			<td style="width:236px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyethylene glycol mono-p-isooctylphenyl ether</td>
			<td style="width:195px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:229px;">648462</td>
			<td style="width:236px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:195px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:229px;">648462</td>
			<td style="width:236px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Sucrose</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:229px;">S0389</td>
			<td style="width:236px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound</td>
			<td style="width:195px;">Tissue-Tek</td>
			<td style="width:229px;">4583</td>
			<td style="width:236px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">anti-Keratin14 antibody</td>
			<td style="width:195px;">Covance</td>
			<td style="width:229px;">PRB-155P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">anti-Ki67 antibody&#160;</td>
			<td style="width:195px;">Abcam</td>
			<td style="width:229px;">ab16667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:423px;">Donkey anti-rabbit Alexa 594</td>
			<td style="width:195px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:229px;">A21207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Dimethylsulfoxide</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:229px;">D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Urea</td>
			<td style="width:195px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:229px;">66612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2,2&#8242;,2&#8242;&#8217;-nitrilotriethanol</td>
			<td style="width:195px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:229px;">137002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:423px;">Confocal Microscope</td>
			<td style="width:195px;">Nikon Instruments Inc</td>
			<td style="width:229px;">Nikon A1 - Confocal Microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">cruZer6 Face Trimmer</td>
			<td style="width:195px;">Braun</td>
			<td style="width:229px;">Braun cruZer6 Face</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Sodium azide</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:229px;">438456</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cubic protocol visualizes protein expression at single cell resolution in whole mount skin preparations

A pele é essencial para a nossa sobrevivência. A camada epidérmica exterior consiste da epiderme interfolicular, que é um epitélio escamoso estratificado que cobrem a maior parte do nosso corpo, e apêndices epidérmicos, como os folículos pilosos e glândulas sudoríparas. A epiderme é submetido a regeneração e ao longo da vida em resposta a lesão. Isso é ativado por K14-expressando populações / células progenitoras-tronco epidérmicas basais que são fortemente regulados por múltiplos mecanismos reguladores ativos dentro da epiderme e entre epiderme e derme. Este artigo descreve um método simples para esclarecer rato espessura biópsias de pele cheios, e visualizar os padrões de expressão de proteína K14, Ki67 rotulados células em proliferação, Nile Red marcado sebócitos e rotulagem nuclear DAPI em resolução de uma única célula em 3D. Este método permite uma avaliação precisa e quantificação da anatomia da pele e patologia, e de fenótipos epidérmicas anormais nas linhas de rato geneticamente modificados. O protocolo cúbica é the melhor método disponível no momento para investigar as interações moleculares e celulares em biópsias de pele de espessura total com resolução de uma única célula.

Espessura dorsal biopsias completas de pele de ratinhos de tipo selvagem adultos foram esclarecidas, coradas com uma ligação de queratinócitos basais marcador Keratin14 (K14) de anticorpo, e os núcleos foram contrastadas com solução de coloração de DAPI (Figura 2 e um filme). Núcleos DAPI-positivos eram visíveis em toda a amostra (Figura 2A, C), e K14 coloração era visível exclusivamente na camada basal de espessura de uma célu...

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CUBIC Protocol Visualizes Protein Expression at Single Cell Resolution in Whole Mount Skin Preparations

Este relatório descreve um protocolo cúbicos para esclarecer rato espessura biópsias de pele cheios, e visualizar os padrões de expressão de proteínas, células em proliferação e sebócitos com a resolução única célula em 3D. Este método permite uma avaliação precisa da anatomia da pele e patologia, e de fenótipos epidérmicas anormais nas linhas de rato geneticamente modificados.

Protocolo CUBIC Visualiza Protein Expression na resolução única célula em preparações e peles, inteiros Mount

The skin is essential for our survival. The outer epidermal layer consists of the interfollicular epidermis, which is a stratified squamous epithelium ...

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