Name: the visual colorimetric detection of multi-nucleotide polymorphisms on a pneumatic droplet manipulation platform
Uploaded: 2016-09-27T14:00:00
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Ministry of Science and Technology of Taiwan provided financial support of this research under contracts MOST-103-2221-E-002 -097 -MY3.

1. Méthode pour détecter MNP Remarque: Cette section décrit la procédure pour détecter le MNP basé sur la croissance de l&#39;hybridation médiée par des nanoparticules d&#39;or. <ol><li> Préparer l&#39;ADN de sonde (5&#39;-thiol GAGCTGGTGGCGTAGGCAAG-3 &#39;) solution à une concentration de 100 uM. </li><li> Préparer la AUNP sonde ADN modifié (sonde AUNP) particules. 21 Remarque: Le volume utilisé ici dépend de l&#39;exigence de AUNP sonde ADN modifié (sonde AUNP) particules. Il...

<ol>
	<li>Chorley, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+and+verification+of+functional+single+nucleotide+polymorphisms+in+regulatory+genomic+regions:+current+and+developing+technologies.">Discovery and verification of functional single nucleotide polymorphisms in regulatory genomic regions: current and developing technologies.</a> Mutat. Res. Rev. Mutat. 659 (1), 147-157 (2008).</li><li>Hinds, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-genome+patterns+of+common+DNA+variation+in+three+human+populations.">Whole-genome patterns of common DNA variation in three human populations.</a> Science. 307 (5712), 1072-1079 (2005).</li><li>Rosenfeld, J. A., Malhotra, A. K., Lencz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+multi-nucleotide+polymorphisms+in+the+human+genome+characterized+by+whole+genome+and+exome+sequencing.">Novel multi-nucleotide polymorphisms in the human genome characterized by whole genome and exome sequencing.</a> Nucleic Acids Res. , 408 (2010).</li><li>Whelan, S., Goldman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+the+frequency+of+events+that+cause+multiple-nucleotide+changes.">Estimating the frequency of events that cause multiple-nucleotide changes.</a> Genetics. 167 (4), 2027-2043 (2004).</li><li>Saiki, R. K., Walsh, P. S., Levenson, C. H., Erlich, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+amplified+DNA+with+immobilized+sequence-specific+oligonucleotide+probes.">Genetic analysis of amplified DNA with immobilized sequence-specific oligonucleotide probes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86 (16), 6230-6234 (1989).</li><li>Kim, S., Misra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SNP+genotyping:+technologies+and+biomedical+applications.">SNP genotyping: technologies and biomedical applications.</a> Annu. Rev. Biomed. Eng. 9, 289-320 (2007).</li><li>Kwok, P. Y., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+single+nucleotide+polymorphisms.">Detection of single nucleotide polymorphisms.</a> Curr. Issues Mol. Biol. 5, 43-60 (2003).</li><li>Elghanian, R., Storhoff, J. J., Mucic, R. C., Letsinger, R. L., Mirkin, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+colorimetric+detection+of+polynucleotides+based+on+the+distance-dependent+optical+properties+of+gold+nanoparticles.">Selective colorimetric detection of polynucleotides based on the distance-dependent optical properties of gold nanoparticles.</a> Science. 277 (5329), 1078-1081 (1997).</li><li>Lee, J. S., Han, M. S., Mirkin, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorimetric+Detection+of+Mercuric+Ion+(Hg2+)+in+Aqueous+Media+using+DNA-Functionalized+Gold+Nanoparticles.">Colorimetric Detection of Mercuric Ion (Hg2+) in Aqueous Media using DNA-Functionalized Gold Nanoparticles.</a> Angew. Chem. 119 (22), 4171-4174 (2007).</li><li>Storhoff, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gold+nanoparticle-based+detection+of+genomic+DNA+targets+on+microarrays+using+a+novel+optical+detection+system.">Gold nanoparticle-based detection of genomic DNA targets on microarrays using a novel optical detection system.</a> Biosens. Bioelectron. 19 (8), 875-883 (2004).</li><li>Bao, Y. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SNP+identification+in+unamplified+human+genomic+DNA+with+gold+nanoparticle+probes.">SNP identification in unamplified human genomic DNA with gold nanoparticle probes.</a> Nucleic Acids Res. 33 (2), 15-15 (2005).</li><li>Chen, Y. T., Hsu, C. L., Hou, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+single-nucleotide+polymorphisms+using+gold+nanoparticles+and+single-strand-specific+nucleases.">Detection of single-nucleotide polymorphisms using gold nanoparticles and single-strand-specific nucleases.</a> Anal. Biochem. 375 (2), 299-305 (2008).</li><li>Li, H., Rothberg, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorimetric+detection+of+DNA+sequences+based+on+electrostatic+interactions+with+unmodified+gold+nanoparticles.">Colorimetric detection of DNA sequences based on electrostatic interactions with unmodified gold nanoparticles.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (39), 14036-14039 (2004).</li><li>Fang, W. F., Chen, W. J., Yang, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorimetric+determination+of+DNA+concentration+and+mismatches+using+hybridization-mediated+growth+of+gold+nanoparticle+probes.">Colorimetric determination of DNA concentration and mismatches using hybridization-mediated growth of gold nanoparticle probes.</a> Sensor. Actuat. B Chem. 192, 77-82 (2014).</li><li>Wang, Z., Zhang, J., Ekman, J. M., Kenis, P. J., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-mediated+control+of+metal+nanoparticle+shape:+one-pot+synthesis+and+cellular+uptake+of+highly+stable+and+functional+gold+nanoflowers.">DNA-mediated control of metal nanoparticle shape: one-pot synthesis and cellular uptake of highly stable and functional gold nanoflowers.</a> Nano Lett. 10 (5), 1886-1891 (2010).</li><li>Chen, L., Manz, A., Day, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+nucleic+acid+analysis+integrated+on+microfluidic+devices.">Total nucleic acid analysis integrated on microfluidic devices.</a> Lab Chip. 7 (11), 1413-1423 (2007).</li><li>Lien, K. Y., Liu, C. J., Lin, Y. C., Kuo, P. L., Lee, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+of+genomic+DNA+and+detection+of+single+nucleotide+polymorphism+genotyping+utilizing+an+integrated+magnetic+bead-based+microfluidic+platform.">Extraction of genomic DNA and detection of single nucleotide polymorphism genotyping utilizing an integrated magnetic bead-based microfluidic platform.</a> Microfluid. Nanofluid. 6 (4), 539-555 (2009).</li><li>Ng, J. K. K., Feng, H. H., Liu, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+discrimination+of+single-nucleotide+mismatches+using+a+microfluidic+device+with+monolayered+beads.">Rapid discrimination of single-nucleotide mismatches using a microfluidic device with monolayered beads.</a> Anal. Chim. Acta. 582 (2), 295-303 (2007).</li><li>Xing, S., Harake, R. S., Pan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet-driven+transports+on+superhydrophobic-patterned+surface+microfluidics.">Droplet-driven transports on superhydrophobic-patterned surface microfluidics.</a> Lab Chip. 11 (21), 3642-3648 (2011).</li><li>Huang, C. J., Fang, W. F., Ke, M. S., Chou, H. Y. E., Yang, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+biocompatible+open-surface+droplet+manipulation+platform+for+detection+of+multi-nucleotide+polymorphism.">A biocompatible open-surface droplet manipulation platform for detection of multi-nucleotide polymorphism.</a> Lab Chip. 14 (12), 2057-2062 (2014).</li><li>Mirkin, C. A., Letsinger, R. L., Mucic, R. C., Storhoff, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+DNA-based+method+for+rationally+assembling+nanoparticles+into+macroscopic+materials.">A DNA-based method for rationally assembling nanoparticles into macroscopic materials.</a> Nature. 382 (6592), 607-609 (1996).</li><li>Ichimura, K., Oh, S. K., Nakagawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-driven+motion+of+liquids+on+a+photo-responsive+surface.">Light-driven motion of liquids on a photo-responsive surface.</a> Science. 288 (5471), 1624-1626 (2000).</li><li>Jones, T. B., Gunji, M., Washizu, M., Feldman, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dielectrophoretic+liquid+actuation+and+nanodroplet+formation.">Dielectrophoretic liquid actuation and nanodroplet formation.</a> J. Appl. Phys. 89 (2), 1441-1448 (2001).</li><li>Lee, J., Kim, C. J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface-tension-driven+microactuation+based+on+continuous+electrowetting.">Surface-tension-driven microactuation based on continuous electrowetting.</a> J. Microelectromech. S. 9 (2), 171-180 (2000).</li><li>Daniel, S., Chaudhury, M. K., De Gennes, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vibration-actuated+drop+motion+on+surfaces+for+batch+microfluidic+processes.">Vibration-actuated drop motion on surfaces for batch microfluidic processes.</a> Langmuir. 21 (9), 4240-4248 (2005).</li><li>Darhuber, A. A., Valentino, J. P., Davis, J. M., Troian, S. M., Wagner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+actuation+by+modulation+of+surface+stresses.">Microfluidic actuation by modulation of surface stresses.</a> Appl. Phys. Lett. 82 (4), 657-659 (2003).</li></ol>

Dans ce protocole, une méthode colorimétrique simple pour détecter MNP peut être mis en oeuvre à des concentrations allant de 0.11-0.50 uM dans des tubes de microcentrifugation. En outre, la méthode de détection MNP proposé est réalisé sur une plate-forme de manipulation de gouttelettes de pneumatique qui a un fort potentiel pour le criblage de l&#39;ADN et d&#39;autres applications biomédicales. En pratique, la plage détectable de la concentration d&#39;ADN de l&#39;échantillon dépend de l&#39;efficacité...

Polymorphisme nucléotidique (SNP), qui est d&#39;une seule différence dans une séquence d&#39;ADN de paires de bases, est l&#39;un des variations génétiques les plus courantes. Les études actuelles indiquent que les SNP sont associés à un risque de maladie, l&#39; efficacité des médicaments et les effets secondaires des individus en affectant la fonction des gènes. 1,2 Des études récentes ont également révélé que les mutations à deux ou multi-points (multi-nucleotide polymorphism) provoquent des maladies et individuelles particulières différences dans les effets de la maladie. 3,4 La détection du polymorphisme nucléotidique est donc impératif de prescreening maladie. Des méthodes simples et efficaces pour la détection rapide des oligonucléotides spécifiques de la séquence ont été très développées au cours des deux dernières décennies. 1,5 Les approches actuelles pour identifier les mutations de l&#39; ADN impliquent généralement des procédures , y compris la sonde immobilisation, marquage par fluorescence, électrophorèse sur gel, etc., 6,7 mais ces méthodes nécessitent généralement un processus d&#39;analyse long, expenéquipements sive, techniciens bien formés, et la consommation importante d&#39;échantillons et de réactifs. Une nanoparticule avec un grand rapport de la surface au volume et propriétés physico-chimiques uniques est un matériau idéal en tant que plate-forme de détection très sensible et pas cher pour des biomarqueurs spécifiques. Les nanoparticules d&#39;or (AUNP) sont largement utilisés pour la détection de l&#39; ADN en raison de leur grande capacité à être modifiée avec des sondes oligonucléotidiques. 8-10 techniques de détection de SNP ont également été développés en utilisant AUNP. 11-13 Dans ce travail , nous avons adopté une approche colorimétrique roman pour détecter la plusieurs polymorphisme nucléotidique (MNP) par croissance d&#39;hybridation à médiation par l&#39; ADN de sondes AUNP 14. Cette méthode de sondage simple et rapide est basé sur la théorie selon laquelle les différentes longueurs d&#39;ADN simple brin (ADNsb) ou de l&#39; ADN double brin (ADNdb) conjugué à AUNP influencer la taille de la croissance et la forme du AUNP (voir Figure 1). 15 Cette méthode de détection de l&#39; ADNdispose d&#39;une faible consommation de réactifs, une petite durée de l&#39;essai (quelques minutes), et une procédure simple, sans contrôle thermique qui est applicable à l&#39;avenir pour le diagnostic clinique et un examen médical interne. Plusieurs systèmes microfluidiques pour détecter la séquence d&#39;ADN ont été développés; 16 ces systèmes microfluidiques, évolué à partir de protocoles expérimentaux traditionnels, besoin de moins de pièces d&#39;équipement à grande échelle et simplifié les protocoles expérimentaux afin d&#39;améliorer la sensibilité, limite de détection et la spécificité de l&#39;ADN biocapteur. Les méthodes de détection de l&#39; ADN dans les systèmes microfluidiques nécessitent encore, cependant, les instruments d&#39;un processus ultérieur tel qu&#39;une PCR (réaction en chaîne par polymérase) Machine pour l&#39; amplification de signal et un lecteur de fluorescence pour une seule lecture pour identifier le SNP hétérogène. 17,18 Développement simple plateforme sans traitement ultérieur pour lire directement les résultats de multi-nucléotide polymorphismeest hautement souhaitable. Comparé à bien utilisé, classique, fermé des systèmes microfluidiques, la surface ouverte des dispositifs microfluidiques offrent promisingly plusieurs avantages, comme une voie claire optique, un moyen facile d&#39;accéder à l&#39;exemple, un accès direct sur l&#39;environnement et la cavitation pas facilement formé ou une obstruction interfaciale dans le canal. 19 Nos travaux antérieurs mis en place une plate - forme pneumatique simple pour la manipulation ouverte de la surface des gouttelettes (voir la figure 2). 20 Sur cette plate - forme, les gouttelettes peuvent être transportées simultanément et manipulées sans interférence à partir d&#39; une énergie d&#39; entraînement en utilisant une force d&#39;aspiration, qui a une un grand potentiel dans les applications biologiques et chimiques. Cette plate-forme pneumatique a donc été utilisée pour exécuter la manipulation d&#39;échantillons d&#39;ADN pour la détection MNP en combinaison avec l&#39;approche colorimétrique en utilisant le concept de croissance d&#39;hybridation médiée par l&#39;ADN de sondes AUNP. Le protocole présenté dans le présent document décritune détection visuelle simple de polymorphismes multi-nucléotidiques sur le pneumatique plate-forme de manipulation de gouttelettes sur une surface ouverte. Ce travail confirme que multi-nucléotide polymorphisme est détectable à l&#39;œil nu; la plate-forme pneumatique proposé est adapté pour des applications biologiques et chimiques.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="735">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:245px;">PDMS</td>
			<td style="width:204px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:119px;">SYLGARD 184</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">benchtop engravers</td>
			<td style="width:204px;">&#160;Roland DG</td>
			<td style="width:119px;">EGX-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">laser cutting machine</td>
			<td style="width:204px;">Universal Laser Systems, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">VLS 3.50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Oxygen plasma treatment system</td>
			<td style="width:204px;">Femto Science Inc. Korea</td>
			<td style="width:119px;">CUTE-MPR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">solenoid valve</td>
			<td style="width:204px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>home built</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">vacuum pump</td>
			<td>ULVAC KIKO, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">DA-30D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">13-nm AuNP solution</td>
			<td style="width:204px;">TAN Bead Inc., Taiwan</td>
			<td style="width:119px;">NG-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">DNA (with 5 -end labeled thiol)</td>
			<td style="width:204px;">MDBio, Inc., Taiwan</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>UniRegion&#160;Bio-Tech,. Taiwan</td>
			<td>PBS001-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td style="width:204px;">J. T. baker</td>
			<td style="width:119px;">4095-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:245px;">Hydroxylamine solution (NH2OH)</td>
			<td style="width:204px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">467804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:245px;">Chloroauric acid (HAuCl4)</td>
			<td style="width:204px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>G4022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">sodium chloride (NaCl)</td>
			<td style="width:204px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:245px;">vortex mixer</td>
			<td style="width:204px;">Digisystem Laboratory Instruments Inc.</td>
			<td style="width:119px;">VM-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">centrifuge</td>
			<td style="width:204px;">Hermle Labortechnik GmbH.</td>
			<td style="width:119px;">Z 216 MK</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the visual colorimetric detection of multi-nucleotide polymorphisms on a pneumatic droplet manipulation platform

Une méthode simple et visuel pour détecter plusieurs polymorphisme nucléotidique (MNP) a été réalisée sur une plate-forme de manipulation de gouttelettes pneumatique sur une surface ouverte. Cette approche de la détection de l&#39;ADN colorimétrie a été basée sur la croissance d&#39;hybridation à médiation par des sondes de nanoparticules d&#39;or (sondes AUNP). La taille de la croissance et la configuration de la AUNP sont dominées par le nombre d&#39;échantillons d&#39;ADN hybridées avec les sondes. Sur la base des propriétés optiques SIZE- et dépendant de la forme spécifique des nanoparticules, le nombre de discordances dans un fragment d&#39;ADN de l&#39;échantillon aux sondes est en mesure d&#39;être discriminé. Les tests ont été effectués par l&#39;intermédiaire de gouttelettes contenant des réactifs et des échantillons d&#39;ADN, respectivement, et ont été transportés et mélangés sur la plateforme pneumatique avec l&#39;aspiration pneumatique contrôlée de la membrane superhydrophobe à base de PDMS flexibles. Gouttelettes peuvent être fournis simultanément et précisément sur une surface ouverte sur la plateforme pneumatique proposée qui est hautement biocompatible sans eff latéralect d&#39;échantillons d&#39;ADN à l&#39;intérieur des gouttelettes. En combinant les deux méthodes proposées, le polymorphisme multi-nucléotide peut être détectée à la vue sur le pneumatique plate-forme de manipulation de gouttelettes; aucun instrument supplémentaire est nécessaire. La procédure de montage des gouttelettes sur la plate-forme pour le résultat final prend moins de 5 minutes, beaucoup moins qu&#39;avec les méthodes existantes. En outre, cette approche combinée de détection MNP nécessite un volume d&#39;échantillon de seulement 10 ul dans chaque opération, ce qui est notablement inférieure à celle d&#39;un système de macro.

Dans ce travail, trois échantillons d&#39;ADN ont été testés à l&#39;aide d&#39;une méthode simple et nouvelle de la détection grâce à la croissance de l&#39;hybridation ADN médiée par des sondes AUNP. Les séquences d&#39;ADN de la sonde et des échantillons d&#39;ADN de trois types, en particulier, CDNA (entièrement complémentaire pour sonder l&#39;ADN), TMDNA (trois paires de bases d&#39;ADN ne correspondent pas), et SixMDNA (DNA dépareillés six paires de bases) sont é...

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The Visual Colorimetric Detection of Multi-nucleotide Polymorphisms on a Pneumatic Droplet Manipulation Platform

Ce travail présente une méthode simple et visuelle pour détecter les polymorphismes multi-nucléotidiques sur une plateforme de manipulation de gouttelettes pneumatique. Avec la méthode proposée, l&#39;ensemble de l&#39;expérience, y compris la manipulation des gouttelettes et la détection de polymorphismes nucléotidiques multiples, peut être effectuée à proximité de 23 ° C, sans l&#39;aide d&#39;instruments avancés.

La détection Colorimétrie visuelle de Multi-nucleotide polymorphismes sur une plate-forme de manipulation pneumatique Droplet

A simple and visual method to detect multi-nucleotide polymorphism (MNP) was performed on a pneumatic droplet manipulation platform on an open surface. ...

The overall goal of this procedure is to combine a simple method for visually detecting multi-nucleotide polymorphisms with a pneumatic droplet manipulation platform. The DNA detection platform is on an open surface and is straight forward to use for biochemical researchers. We investigated a simple tool to repeatedly detect genetic mutations and genetic diseases.It has greater potential helping us understand how genetic variation leads to disease. We combined two novel and simple methods. The multi-nucleotide polymorphism can be detected on the pneumatic droplet manipulation platform with the naked eye and without any additional instrument.The method for detecting multi-nucleotide polymorphism will be demonstrated by Tzu-Ming Wang, the post doctor in our group. To begin this procedure, prepare a 100 micromolar solution of probe DNA as indicated in the text protocol. Then, add the probe DNA to a one OD per milliliter solution of gold nanoparticles.Bring the final concentration of SDS to 0.01%and of PBS to 0.01 molar. Allow the solution to incubate for 20 minutes. Next, increase the concentration of sodium chloride to 0.05 molar by adding a solution of two molar sodium chloride and 0.01 molar PBS.Maintain the SDS concentration at 0.01%and let the solution incubate for anoher 20 minutes. Increase the concentration of sodium chloride in increments of 0.1 molar over 20 minute intervals until a final concentration of one molar is reached. Incubate the solution at 23 degrees Celsius overnight on a rotator.After the DNA samples and gold nanoparticles have become conjugated, centrifuge the solution at 7, 000 times g for 30 seconds. Remove the supernatant. Next, prepare a 25 nanomolar gold nanoparticle probe solution by resuspending the pellet in deionized water.Prepare target DNA samples as outlined in the text protocol. Add six microliters of gold nanoparticle probe solution into each DNA sample with sodium chloride. Using a vortex mixer, shake each sample solution for five minutes at 23 degrees Celsius.Then, add six microliters of 400 millimolar hydroxyl amine and six microliters of 25.4 millimolar chloroauric acid to each DNA sample solution. Set these samples aside as a steady change in coloration will occur over the next hour. the size, shape-dependent optical properties of the nanoparticle, the number of the mismatch in a sample DNA fragment typical can be discerned by eye.To begin fabricating the droplet manipulation platform, utilize a computer numerical controlled machine equipped with a 0.5 millimeter drill bit to produce PMMA-based mastermolds with microstructures. For the drill, use a feed speed of seven millimeters per second and a rotation rate of 26, 000 rpm, and inspect the molds after drilling. Use an air blower and deionized water to clean the surface of the mastermolds and remove any PMMA scrap.Following this, prepare a 10 to one mixture of PDMS base and curing agent. Degas the mixture in a desiccator until all air bubbles are removed. Then, pour the PDMS mixture into the mastermold.Bake for three hours at 60 degrees Celsius to obtain the inverse microstructures in the air chambers and air channels. After baking is complete, remove the PDMS layer from the mastermold, and punch holes in it for the air suction inlets. Use an oxygen plasma treatment system to clean the PDMS membrane and PDMS layer.After treatment, bond the PDMS membrane and the PDMS layer, and then punch holes in this conjugated structure. Next, bond the PDMS and glass substrate together using a hot plate at 90 degrees Celsius for 10 minutes. Once the layers are bonded together, place the composite plate into a laser cutting machine PDMS membrane-side up.Import the dwg file to define the super hydrophobic area, and note this will be directly engraved into the PDMS membrane. Clean the newly engraved superhydrophobic surface with deionized water. This will wash away any carbonized residues.After the surface has been cleaned, connect the air suction inlet and vacuum pump through a solenoid valve. Then, connect the solenoid valve to a computer to control it with a digital IO USB module. Once the pneumatic droplet manipulation platform has been set up, add 10 microliters of 0.5 micromolar target DNA on the superhydrophobic area.Next, add 10 microliters of freshly hybridized 25 nanomolar gold nanoparticle probe solution next to the target DNA drop. Use a simple program to control air suction to the platform through a solenoid valve. Set the pressure to negative 80 kilopascals, and the driving frequency to five hertz.Provide suction along the droplet's vibration paths, causing them to collide and coalesce. Next, mix the coalesced droplet by manipulating the suction to roll the sample for three minutes. Add two microliters of 400 milimolar hydroxylamine, and two microliters of 25.4 milimolar chloroauric acid to the superhydrophobic area of the pneumatic droplet manipulation platform.Manipulate the suction so that the droplets collide and merge. Then, mix the merged droplet by rolling it for one minute. Observe the color of the final droplet with the naked eye.In this study, multi nucleotide polymorphisms are detected colorometrically using DNA hybridization mediated growth of gold nanoparticle probes. Here, the DNA samples possess different affinities to the probe DNA, causing differences in the growth of the gold nanoparticles, seen as a change in color. The three base pair mismatched DNA sample has less hybridization than the fully complimentary DNA, which can be seen as noticeable distinctions in color, especially at higher concentrations.The six base mismatched DNA has weak hybridization affinity to the probe, and thus the growth size of the gold nanoparticles was small. This colorometric analysis is shown to be repeatable when samples are manipulated via a pneumatic suction platform, as the results of DNA mismatch are readily observable by the naked eye. Once mastered, the entire procedure takes less than five minutes from the addition of the sample and the reagent until result of them, which is much quicker than the traditional method.The total in each operation is only 10 microliter, which is significantly less than what is required in a large system. Following this procedure, once the sequence variation of the space of DNA fragment is confirmed to be responsible for a specific disease. The specifically designed product can be used to acquire a number of mismatch of the sample DNA.The pneumatic droplet manipulation platform is more biocompatible than other methods such as optical weighting, dye electro fluorescence, electro weighting, and shoomoo's capillary actuation. The proposed multinucleotide polymorphism detection method was conducted under pneumatical droplet manipulation platform, which means the samples and reagents can be directly loaded and collected with pipette. After its development, this technique has a high potential for DNA screening, and other chemical and biomatical applications.

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