Name: capture and release of viable circulating tumor cells from blood
Uploaded: 2016-10-28T14:00:00
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We thank all the patients who have donated blood samples to support this work. We thank Drs. Guiseppe Giaconne, Ritesh Parajuli, and Marc E. Lippman for their assistance in clinical sample acquirement, and Drs. Carmen Gomez, Ralf Landgraf, Stephan Z&#252;chner, Toumy Guettouche, Diana Lopez for their insightful discussions. Zheng Ao thanks partial support and assistance from the Sheila and David Fuente Graduate Program in Cancer Biology, Sylvester Comprehensive Cancer Center.

Etica Dichiarazione: Per proteggere i diritti dei soggetti umani, i campioni di sangue sono stati ottenuti a seguito di un consenso informato secondo protocolli approvati dalla University of Miami revisione istituzionale tavole sotto IRB 20.150.020. NOTA: Il sangue da filtrare per la cattura CTC deve essere raccolto in un tubo EDTA per prevenire la coagulazione. 1. Rivestimento il microfiltro con Poli (N-iso-propylacrylamide) (PIPAAm) <ol><li> Pesare PIPAAm preparare un 10% w / v in butanolo. Mescolare ...

<ol>
	<li>Cristofanilli, M., Budd, G. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cells,+disease+progression,+and+survival+in+metastatic+breast+cancer.">Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer.</a> N Engl J Med. 351 (8), 781-791 (2004).</li><li>de Bono, J. S., Scher, H. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cells+predict+survival+benefit+from+treatment+in+metastatic+castration-resistant+prostate+cancer.">Circulating tumor cells predict survival benefit from treatment in metastatic castration-resistant prostate cancer.</a> Clin Cancer Res. 14 (19), 6302-6309 (2008).</li><li>Cohen, S. J., Punt, C. 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Bioelectron. 26 (4), 1701-1705 (2010).</li><li>Vona, G., Sabile, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+by+size+of+epithelial+tumor+cells+a+new+method+for+the+immunomorphological+and+molecular+characterization+of+circulatingtumor+cells.">Isolation by size of epithelial tumor cells a new method for the immunomorphological and molecular characterization of circulatingtumor cells.</a> Am. J. Pathol. 156 (1), 57-63 (2000).</li><li>Marrinucci, D., Bethel, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Case+study+of+the+morphologic+variation+of+circulating+tumor+cells.">Case study of the morphologic variation of circulating tumor cells.</a> Human pathology. 38 (3), 514-519 (2007).</li><li>Lin, H. K., Zheng, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Portable+filter-based+microdevice+for+detection+and+characterization+of+circulating+tumor+cells.">Portable filter-based microdevice for detection and characterization of circulating tumor cells.</a> Clin. Cancer Res. 16 (20), 5011-5018 (2010).</li><li>Williams, A., Rawal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+translation+of+a+novel+microfilter+technology+Capture,+characterization+and+culture+of+circulating+tumor+cells.">Clinical translation of a novel microfilter technology Capture, characterization and culture of circulating tumor cells.</a> PHT. , 220-223 (2013).</li><li>Ao, Z., Parasido, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermoresponsive+release+of+viable+microfiltrated+Circulating+Tumor+Cells+(CTCs)+for+precision+medicine+applications.">Thermoresponsive release of viable microfiltrated Circulating Tumor Cells (CTCs) for precision medicine applications.</a> Lab Chip. 15, 4277-4282 (2015).</li><li>Xu, T., Lu, B., Tai, Y. C., Goldkorn, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cancer+detection+platform+which+measures+telomerase+activity+from+live+circulating+tumor+cells+captured+on+a+microfilter.">A cancer detection platform which measures telomerase activity from live circulating tumor cells captured on a microfilter.</a> Cancer Res. 70 (16), 6420-6426 (2010).</li><li>Okano, T., Bae, Y. H., Jacobs, H., Kim, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermally+on-off+switching+polymers+for+drug+permeation+and+release.">Thermally on-off switching polymers for drug permeation and release.</a> J. Control. 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Rep. 4, 7499 (2014).</li><li>Hou, S., Zhao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capture+and+stimulated+release+of+circulating+tumor+cells+on+polymer-grafted+silicon+nanostructures.">Capture and stimulated release of circulating tumor cells on polymer-grafted silicon nanostructures.</a> Adv. Mater. 25 (11), 1547-1551 (2013).</li><li>Xiao, Y., Zhou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+and+selective+cell+retention+and+recovery+from+whole+blood+by+electroactive+thin+films.">Effective and selective cell retention and recovery from whole blood by electroactive thin films.</a> ACS Appl. Mater. Interfaces. 6 (23), 20804-20811 (2014).</li><li>Wallwiener, M., Hartkopf, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+HER2+phenotype+of+circulating+tumor+cells+in+metastatic+breast+cancer:+a+retrospective+study+in+107+patients.">The impact of HER2 phenotype of circulating tumor cells in metastatic breast cancer: a retrospective study in 107 patients.</a> BMC cancer. 15 (1), 403 (2015).</li></ol>

Il processo di acquisizione vitali CTC dal sangue intero e rilascio dal microfiltro è relativamente semplice; tuttavia alcuni punti critici sono degni di nota. È indispensabile, come tutte coltura cellulare che una condizione sterile viene mantenuta attraverso l&#39;intero processo. La fase iniziale del rivestimento del filtro con PIPAAm è critica, come base per la tecnica di rilasciare le cellule dal filtro si basa sullo sfruttamento di temperatura reattivi proprietà interfacciali del PIPAAm. Per assicurare il filt...

La malattia metastatica è responsabile per la maggior parte delle morti per cancro. Lo sviluppo di biomarker diagnostici prognostica e compagno di metastasi è cruciale nella gestione e trattamento del cancro. cellule tumorali circolanti (CTC) svolgono un ruolo centrale nella diffusione del tumore e metastasi. Inoltre, essendo facilmente accessibile come una &#39;biopsia liquida&#39; biomarcatore, CTC nei pazienti affetti da cancro &#39;sangue periferico è in aumento come un&#39; covo &#39;per la ricerca sul cancro biomarcatore. CTC sono stati ben convalidato come un biomarcatore prognostico in varie impostazioni di cancro, compresi seno, alla prostata e il cancro colorettale 1-3. Tuttavia, i recenti progressi nel campo CTC ha indicato che la mera enumerazione di queste rare cellule ha limitato utilità clinica, come dimostrato in studi clinici interventistici 4. Pertanto, vi è una necessità emergente di tecnologie che consentono la caratterizzazione molecolare e funzionale di CTC. Attualmente, solo alcune tecnologie esistenti che consentono FOR non antigene di parte, la cattura vitale e rilascio di CTC, consentendo robusto valle molecolare e funzionale analisi 5,6. Maggior parte di questi dispositivi microfabbricati sono accoppiati alle piattaforme microfluidica ed avere quindi un fattore limitante nella quantità di sangue che possono essere trasformati, che varia da 2-4 ml 7 - 10. CTC sono eventi rari in un singolo tubo di prelievo di sangue (7,5 ml), quindi riducendo ulteriormente la quantità di sangue che può essere elaborato, ostacola notevolmente le possibilità di catturare e isolare queste cellule di interesse. Abbiamo sviluppato due tipi di dispositivi di microfiltri membrana parylene C per la cattura di CTC che sfruttano le differenze di dimensione tra cellule tumorali più grandi e più piccoli normali globuli 11,12. Abbiamo precedentemente riportato sul filtro pori enumerazione rotonda e lo ha confrontato con una piattaforma approvato dalla FDA, in cui il microfiltro ha dimostrato di essere superiore in CTC efficienza di catturaper i campioni di sangue dei pazienti di cancro 13,14. Tuttavia, una limitazione del filtro rotondo è la necessità di utilizzare un fissativo a base di formaldeide prima della filtrazione. Questo processo conserva la morfologia delle cellule, consentendo loro di resistere alla sollecitazione di taglio e pressione durante il processo di filtrazione. Mentre enumerazione e studi molecolari possono essere eseguite on-chip 13, il fissativo compromette la capacità di eseguire la caratterizzazione funzionale. Per far fronte a questa limitazione, abbiamo sviluppato un filtro pori slot che nega la necessità di fissare le cellule prima della filtrazione (Figura 1). La geometria dei pori di slot (6 micron di larghezza x 40 micron di slot lunghezza pori) permette alle cellule tumorali di essere catturati mentre solo parzialmente occlude un poro e quindi ancora permettere il libero passaggio per le altre cellule del sangue e alleviare l&#39;aumento della pressione che porterebbe a danni cellulari ed eventuale scoppio 15,16 La cartuccia del poro slot è composto da 2 pezzi acrilico che paninoil filtro pori fessura tra la parte superiore e inferiore con Polidimetilsilossano (PDMS) fungente da guarnizione per fornire una perdita sigillo 14,15 (figura 1). Mentre l&#39;efficienza di cattura del filtro pori slot è elevata, (Tabella 1), il catturato CTC sono legati alla membrana Parylene C da forti non specifiche interazioni elettrostatiche invece di matrice extracellulare (ECM) adesione 15 mediata. Metodi come flusso inverso o l&#39;uso di raschietti cellule non riescono a rilasciare efficacemente le cellule dal filtro, o provocare danno cellulare e morte cellulare. Abbiamo esplorato un uso non convenzionale di PIPAAm di formulare una strategia di rilascio 15. PIPAAm è un polimero che subisce una transizione di fase reversibile temperatura della soluzione critica più bassa (LCST) ad una temperatura della soluzione di 32 ° C 17. Tradizionalmente, questa proprietà di PIPAAm è stato ampiamente esplorato per applicazioni di ingegneria tissutale. Tipicamente, le cellule sonosuperfici coltivate su PIPAAm rivestito a 37 ° C quando PIPAAm è idrofoba. Le cellule possono quindi essere staccate come un foglio quando la temperatura coltura viene spostata al di sotto 32 ° C, dove la superficie rivestita PIPAAm diventa idratato 17,18. Abbiamo sfruttato questa proprietà termica eseguendo il processo di filtrazione a temperatura ambiente (inferiore a 32 ° C) e quindi consentire il rilascio delle cellule posizionando il filtro in terreni di coltura mantenuto a 37 ° C. A questa temperatura, lo strato di polimero PIPAAm diventa idrofobo, liberando così il cellule elettrostaticamente legato 15 (Figura 1). Sebbene il metodo sensibile alla temperatura, nonché altri metodi sono stati implementati con successo per raggiungere cattura CTC vitali e rilasciare 19 - 21, una chiave potenziale svantaggio condivisa da queste tecnologie riportati è che tutti impiegano un principio antigene-dipendente per la cattura CTC. cattura CTC base di Antigen, come mostrato previously, può portare a parziale CTC analisi 11,14. Ad esempio, molte tecnologie di affinità basata impiegano anticorpo che si lega EpCAM per la cattura CTC. Tuttavia, CTC ha mostrato di esprimere diversi livelli di EpCAM, portando ad omissione di EpCAM bassa e EpCAM negativo CTC da queste tecnologie. Inoltre, le limitazioni possono verificarsi quando CTC di origine non epiteliale è di interesse, come ad esempio CTC nelle impostazioni di melanoma e sarcoma. Così, una tecnologia che permette di vitale cattura e rilascio CTC senza potenziale distorsione introdotta da antigene-capture based è altamente auspicabile. È importante sottolineare che il dispositivo di cattura microfiltro è puramente dimensionato in base e la strategia di rilascio è agnostico per la presenza di alcuni marcatori di superficie. Noi crediamo che l&#39;impiego del microfiltro rivestito PIPAAm aiuterà a espandere la nostra comprensione del processo metastatico, fornendo la capacità di catturare e rilasciare CTC per le analisi a valle in modo efficace ed efficiente. Questo può potenteesporre buona resa nuove molecole per le quali nuove terapie mirate sistemiche possono essere diretti, oltre a fornire un biomarker che può essere monitorato in modo semplice e aiuto nel cancro gestione del paziente.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="603">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:107px;width:216px;">Slot Filter</td>
			<td style="width:101px;">Circulogix Inc.</td>
			<td style="width:119px;">MSF-01</td>
			<td style="width:167px;">Different size filters available based for filtration for CTC from blood or urine (www.circulogixinc.com)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">poly(N-iso-propylacrylamide) (PIPAAm)&#160;</td>
			<td style="width:101px;">Ploysciences Inc.</td>
			<td style="width:119px;">21458</td>
			<td style="width:167px;">Non-Hazardous. Store at room temp.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">1-Butanol</td>
			<td style="width:101px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">B7906</td>
			<td style="width:167px;">Use in well ventilated area</td>
		</tr>
		<tr height="118">
			<td height="118" style="height:119px;width:216px;">Plastic Microscope Slides</td>
			<td style="width:101px;">Cole-Parmer</td>
			<td style="width:119px;">48510-30</td>
			<td style="width:167px;">Any plastic slides or alternatively any sort of square (Metal, Acrylic etc.) can be used if it will be bale to hold the 8mmx8mm filter square</td>
		</tr>
		<tr height="59">
			<td height="59" style="height:59px;width:216px;">Spin Coater</td>
			<td style="width:101px;">Specialty Coating Systems</td>
			<td style="width:119px;">SCS G3 Spin Coater</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:63px;width:216px;">Polyimide Tape</td>
			<td style="width:101px;">Uline</td>
			<td style="width:119px;">S-7595</td>
			<td style="width:167px;">Polyimide is the generic name for Kapton Tape which can be purchased form multiple vendors (Amazon, Kaptontape.com)</td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;width:216px;">HBSS- Hank&#39;s Balanced Salt Solution</td>
			<td style="width:101px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:216px;">1XPBS</td>
			<td style="width:101px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="189">
			<td height="189" style="height:189px;width:216px;">McCoy&#39;s</td>
			<td style="width:101px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">16600-082</td>
			<td style="width:167px;">Warm in 37 &#8304;C water bath before use. McCoys was used for SKBr3 cells, if you use different cell lines or patient blood, please use media that would be optimal for that particular case</td>
		</tr>
		<tr height="74">
			<td height="74" style="height:74px;width:216px;">Falcon Petri dishes 35x10 mm</td>
			<td style="width:101px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">25373-041</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="87">
			<td height="87" style="height:87px;width:216px;">Microfilter Cassette</td>
			<td style="width:101px;">Circulogix Inc.</td>
			<td style="width:119px;">FC-01</td>
			<td style="width:167px;">Custom catridges are avilable based on filtration for CTC from blood or urine&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Syringe 20mL</td>
			<td style="width:101px;">BD Scientific</td>
			<td style="width:119px;">302830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Syringe Pump</td>
			<td style="width:101px;">KD scientific&#160;</td>
			<td style="width:119px;">78-0100V</td>
			<td style="width:167px;">Any syringe pump capable of holding a 25mL syringe may be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cellstar 50mL Centrifuge tube</td>
			<td style="width:101px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">82050-322</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Greiner Bio One 6 well plate</td>
			<td style="width:101px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">89131-688</td>
			<td style="width:167px;">Any brand can be used, as long as the surface is compatiable for cell adesion and not repellant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SKBR3 Cells</td>
			<td style="width:101px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">HTB-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Live Dead Assay</td>
			<td style="width:101px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">L3224</td>
			<td style="width:167px;">Any assay that can provide a reasonable analysis to evaluate live cells will work</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Cell Culture Incubator</td>
			<td style="width:101px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">98000-368</td>
			<td style="width:167px;">Any incubator that can be used for cell culture will suffice</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

capture and release of viable circulating tumor cells from blood

Abbiamo dimostrato un metodo per la cattura dimensioni base di vitale cellule tumorali circolanti (CTC) da sangue intero, insieme con il rilascio di queste cellule dal circuito integrato di analisi e / o di cultura downstream. La strategia impiega l&#39;uso di un romanzo Parylene C poro fessura membrana microfiltro per catturare CTC ed un rivestimento di poli (N--ISO propylacrylamide) (PIPAAm) per thermoresponsive rilascio praticabile della CTC catturato. La cattura di cellule vive è abilitata sfruttando la progettazione di una geometria dei pori dello slot con dimensioni specifiche per ridurre la sollecitazione di taglio tipicamente associati con il processo di filtrazione. Mentre il microfiltro presenta una elevata efficienza di cattura, il rilascio di queste cellule non è banale. Tipicamente, solo una piccola percentuale di cellule vengono rilasciati quando si utilizzano tecniche come flusso inverso o raschiatura cellulare. L&#39;adesione di queste cellule tumorali epiteliali alla membrana parylene C è attribuibile alla interazione elettrostatica non specifico. Per contrastare °è effetto, abbiamo impiegato l&#39;uso di rivestimento PIPAAm e sfruttato le sue proprietà interfacciali reattivi termiche per rilasciare le cellule dal filtro. Sangue viene prima filtrato a temperatura ambiente. Sotto 32 ° C, PIPAAm è idrofila. Successivamente, il filtro è posizionato o nel mezzo di coltura o un buffer mantenuta a 37 ° C, che determina la rotazione PIPAAm idrofobica, e successivamente rilasciare le cellule elettrostaticamente rilegati.

Utilizzando il sangue donatori sani &#39;(ottenuto con un protocollo approvato dalla University of Miami IRB 20.150.020 a seguito di un consenso informato) a spillo con le cellule tumorali in coltura, la tecnica thermoresponsive per il rilascio di cellule vitali circolanti tumorali (CTC), la cattura raggiunto, il rilascio e l&#39;efficienza di recupero del 94% ± 9%, 82% ± 5% e 77% ± 5% rispettivamente (Tabella 1) 15. In confronto, l&#39;efficienza rilascio ...

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Capture and Release of Viable Circulating Tumor Cells from Blood

Un protocollo di utilizzare un poli (N--ISO propylacrylamide) (PIPAAm) microfiltro rivestito per la cattura e il rilascio efficace thermoresponsive delle cellule tumorali circolanti vitali (CTC) è presentato. Questo metodo permette la cattura di CTC dal sangue dei pazienti e il successivo rilascio di valida CTC per la cultura a valle off-chip, analisi e caratterizzazione.

Cattura e rilascio di vitali circolanti cellule tumorali del sangue

We demonstrate a method for size based capture of viable circulating tumor cell (CTC) from whole blood, along with the release of these cells from chip ...

The overall goal of this technique is to effectively capture viable circulating tumor cells or CTCs from whole blood. These CTCs can be placed into culture or be used for downstream analyses which require non fixed samples. This method can help answer key questions in the field of metastasis.It can also be used to follow disease progression, response to therapy and evaluate risk of recurrence. The advantage of this technique is the ability to perform label-free capture of viable CTCs from any solid tumor while remaining independent of biomarker expression. We first had the idea of releasing CTCs from the filter because we wanted to do downstream RNA analysis and culture of CTCs, instead of culturing them in-situ on the filter.To begin the experiment, weigh enough PIPAAm to prepare a 10%weight per volume solution in a 15 milliliter tube, containing butanol. Vortex the tube until the solution is clear. Next, cut plastic microscope slides into roughly 12 millimeter by 12 millimeter squares with a pair of scissors.Then, using a sharp pair of straight edge scissors, cut a slot-pore microfilter wafer into eight millimeter by eight millimeters squares and place these pieces directly onto the plastic squares. Using a polyimide film tape, secure the cut filters onto the plastic squares, only on the edge and the corner of the filter so that at least, seven millimeter by seven millimeter filter area is not covered by the tape. Place the microfilter that is secured on the plastic square onto the vacuum chuck of the spin coater.Program the spin coater to the following recipe. Then, with a standard plastic transfer pipette, dispense enough 10%weight per volume PIPAAm solution to completely cover the microfilter surface and start the spin coater. After the coating is completed, remove the PIPAAm coated microfilter from the spin coater and leave the filter attached to the plastic square during storage.Move on to filtration cassette assembly and rehydrate the PIPAAm coated microfilter at room temperature by placing the microfilter into a petri dish. Add 1X PBS until the microfilter is fully submerged. After the hydration step, release the filter from the plastic square by peeling or cutting the polyimide film tape from the filter.Next, assemble the microfilter into the filtration cassette by sandwiching the microfilter between the top and bottom acrylic piece along the PDMS pieces which act as a gasket. Then, clamp the acrylic cassette with clips to secure the filter, to provide a tight seal. Warm three milliliters of McCoy's cell culture medium to 37 degrees celsius.Add 7.5 milliliters of Hank's balanced salt solution or HBSS to the 7.5 milliliters of blood sample and aspirate this diluted blood into a 25 milliliter syringe. After identifying the top of the cassette, engage the filtration cassette with the syringe and place it onto the syringe pump. Set the syringe pump to a 75 milliliter per hour flow rate.Place a 50 milliliter tube at the bottom to collect the flow through and start the pump. After filtration is complete, disengage the filtration cassette, taking note which side is the top that has the cells caught in the PIPAAm coated surface. Aspirate one milliliter of the warm culture medium into a new syringe.Again, determine the top of the cassette and then re-engage the filtration cassette with the syringe containing the medium and engage the bottom end of the cassette so that the PIPAAm coated surface of the filter is facing away from the syringe. Then place the syringe back onto the syringe pump and hold the six well plate right under the filtration cassette. Set the flow rate and start the pump.Pass all the medium through the filter and collect the flow through in the petri dish. Wait for all the medium to pass through, then stop the pump and remove the syringe and filtration cassette from the pump. Next, disengage the filtration cassette from the syringe and open it to retrieve the filter from the cassette.Place the filter with the PIPAAm surface facing down into the same petri dish used to collect the reverse flow when releasing the cells from the pores. Add the rest of the warm medium and place the petri dish into a culture incubator, set at 37 degrees celsius. Once the filter has been retrieve from the cassette, it is critical to place it in the plate with the cells facing down and if needed, gently shake it in the media to ensure the cells are detached from the filter.After 24 hours in culture, carefully remove the microfilter using forceps and discard the filter. Gently resuspend the erythrocytes and peripheral blood mononuclear cells or PBMCs with a 1000 micro liter pipette. It is critical to be extremely gentle when resuspending the erythrocytes and PBMCs to avoid pipetting out the CTCs.Carefully remove the entire medium containing the resuspended erythrocytes and PBMCs while leaving behind the attached cancer cells and substitute the cells with fresh medium, pre-warmed to 37 degrees celsius. Proceed with CTC viability evaluation. Using healthy donors blood spiked with cultured cancer cells, the thermal responsive technique for release of viable circulating tumor cells or CTCs, achieved capture, release and retrieval efficiency of 94%82%and 77%respectively.The release and retrieval efficiency of uncoated filters were significantly lower. A live dead assay was performed to evaluate the cell viability before the spike into blood and after release. The cells remained viable post release and expanded in culture rapidly.SKBr-3 cells were retrieved from blood by the PIPAAm coated slot filter and plated on a 48 well plate. At 16 hours in a culture, tumour cells adhere to the culture plate along with a hypotonic erythrocytes and leukocytes which settled at the bottom of the plate. Post-wash non-adherent cells were removed only leaving adhering tumor cells on the plate.The same filters can be used for fixed cell capture, both for enumerating and molecular characterizations of CTCs to track progression of cancer and better cancer management. After its development, this technique paved the way for the researchers in the field of CTCs enabling functional characterization of these cells to explore future drug targets while taking a step towards personalized medicine.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Isolation of Circulating Tumor Cells in an Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer

Isolamento delle cellule tumorali circolanti in un modello di topo ortotopico del tumore del colon-retto

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, subcutaneous mouse models have severe limitations and do not accurately simulate ...

Ricerca

Ricerca sul cancro

Conditional Knockdown of Gene Expression in Cancer Cell Lines to Study the Recruitment of Monocytes/Macrophages to the Tumor Microenvironment

Atterramento condizionale dell'espressione genica in linee cellulari del cancro per studiare il reclutamento dei monociti/macrofagi al microambiente tumorale

siRNA and shRNA-mediated knock down (KD) methods of regulating gene expression are invaluable tools for understanding gene and protein function. However, ...

The Establishment of a Lung Colonization Assay for Circulating Tumor Cell Visualization in Lung Tissues

L'istituzione di un'analisi di colonizzazione del polmone per la visualizzazione di cellule del tumore nei tessuti polmonari di circolazione

Metastasis is the major cause of cancer death. The role of circulating tumor cells (CTCs) in promoting cancer metastasis, in which lung colonization by ...

Characterization of Tumor Cells Using a Medical Wire for Capturing Circulating Tumor Cells: A 3D Approach Based on Immunofluorescence and DNA FISH

Caratterizzazione delle cellule del tumore usando un filo medico per l'acquisizione di cellule tumorali circolanti: un approccio 3D basato sul DNA pesce e immunofluorescenza

Circulating tumor cells (CTCs) are associated with poor survival in metastatic cancer. Their identification, phenotyping, and genotyping could lead to a ...

Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts

Isolamento e caratterizzazione delle cellule che invitano il tumore dalle cellule che hanno invitato il tumore da Sarcoma Xenotrapianto derivato dal paziente

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been ...

Investigation of Genetic Dependencies Using CRISPR-Cas9-based Competition Assays

Indagine delle dipendenze genetiche utilizzando dosaggi di concorrenza basati su CRISPR-Cas9

Gene perturbation studies have been extensively used to investigate the role of individual genes in AML pathogenesis. For achieving complete gene ...

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

Isolamento di cellule staminali mesenchimali da tessuto della polpa e co-coltura con cellule tumorali per studiare le loro interazioni

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor ...

Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

Flusso Analisi citometrica delle specie di ossigeno reattivo mitocondriale nelle cellule staminali e semigeniche Murine Hematopoietic e MLL-AF9 Driven Leucemia

We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from ...

Micromanipulation of Circulating Tumor Cells for Downstream Molecular Analysis and Metastatic Potential Assessment

Micromanipolazione delle cellule tumorali circolanti per l'analisi molecolare a valle e la valutazione del potenziale metastatico

Blood-borne metastasis accounts for&#160;most cancer-related deaths and involves circulating tumor cells (CTCs) that are successful in establishing new ...