Name: capture and release of viable circulating tumor cells from blood
Uploaded: 2016-10-28T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Capture and Release of Viable Circulating Tumor Cells from Blood at JoVE.com

We thank all the patients who have donated blood samples to support this work. We thank Drs. Guiseppe Giaconne, Ritesh Parajuli, and Marc E. Lippman for their assistance in clinical sample acquirement, and Drs. Carmen Gomez, Ralf Landgraf, Stephan Z&#252;chner, Toumy Guettouche, Diana Lopez for their insightful discussions. Zheng Ao thanks partial support and assistance from the Sheila and David Fuente Graduate Program in Cancer Biology, Sylvester Comprehensive Cancer Center.

Declaração de Ética: Para proteger os direitos dos seres humanos, amostras de sangue foram obtidas na sequência de um consentimento informado ao abrigo de protocolos aprovados pela Universidade de Miami conselhos de revisão institucional sob IRB 20.150.020. NOTA: Sangue a ser filtrada para captura de CTC deve ser coletado em um tubo de EDTA para impedir a coagulação. 1. Revestimento do microfiltro com poli (N-iso-propilacrilamida) (PIPAAm) <ol><li> Pesar PIPAAm para preparar uma solução a 10% w...

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	<li>Cristofanilli, M., Budd, G. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cells,+disease+progression,+and+survival+in+metastatic+breast+cancer.">Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer.</a> N Engl J Med. 351 (8), 781-791 (2004).</li><li>de Bono, J. S., Scher, H. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cells+predict+survival+benefit+from+treatment+in+metastatic+castration-resistant+prostate+cancer.">Circulating tumor cells predict survival benefit from treatment in metastatic castration-resistant prostate cancer.</a> Clin Cancer Res. 14 (19), 6302-6309 (2008).</li><li>Cohen, S. J., Punt, C. J. a., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+significance+of+circulating+tumor+cells+in+patients+with+metastatic+colorectal+cancer.">Prognostic significance of circulating tumor cells in patients with metastatic colorectal cancer.</a> Ann. Oncol. 20 (7), 1223-1229 (2009).</li><li>Smerage, J. B., Barlow, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+Tumor+Cells+and+Response+to+Chemotherapy+in+Metastatic+Breast+Cancer:+SWOG+S0500.">Circulating Tumor Cells and Response to Chemotherapy in Metastatic Breast Cancer: SWOG S0500.</a> J. Clin. Oncol. 32 (31), 3483-3490 (2014).</li><li>Mach, A. J., Kim, J. H., Arshi, A., Hur, S. C., Di Carlo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+cellular+sample+preparation+using+a+Centrifuge-on-a-Chip.">Automated cellular sample preparation using a Centrifuge-on-a-Chip.</a> Lab chip. 11 (17), 2827-2834 (2011).</li><li>Ozkumur, E., Shah, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inertial+Focusing+for+Tumor+Antigen-Dependent+and+-Independent+Sorting+of+Rare+Circulating+Tumor+Cells.">Inertial Focusing for Tumor Antigen-Dependent and -Independent Sorting of Rare Circulating Tumor Cells.</a> Sci. Transl. Med. 5 (179), 179 (2013).</li><li>Nagrath, S., Sequist, L. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+rare+circulating+tumour+cells+in+cancer+patients+by+microchip+technology.">Isolation of rare circulating tumour cells in cancer patients by microchip technology.</a> Nature. 450 (7173), 1235-1239 (2007).</li><li>Hosokawa, M., Kenmotsu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size-Based+Isolation+of+Circulating+Tumor+Cells+in+Lung+Cancer+Patients+Using+a+Microcavity+Array+System.">Size-Based Isolation of Circulating Tumor Cells in Lung Cancer Patients Using a Microcavity Array System.</a> PLoS ONE. 8 (6), (2013).</li><li>Bhagat, A. A. S., Hou, H. W., Li, L. D., Lim, C. T., Han, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pinched+flow+coupled+shear-modulated+inertial+microfluidics+for+high-throughput+rare+blood+cell+separation.">Pinched flow coupled shear-modulated inertial microfluidics for high-throughput rare blood cell separation.</a> Lab on a chip. 11 (11), 1870-1878 (2011).</li><li>Tan, S. J., Lakshmi, R. L., Chen, P., Lim, W. -. T., Yobas, L., Lim, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+label+free+biochip+for+the+detection+of+circulating+tumor+cells+from+peripheral+blood+in+cancer+patients.">Versatile label free biochip for the detection of circulating tumor cells from peripheral blood in cancer patients.</a> Biosens. Bioelectron. 26 (4), 1701-1705 (2010).</li><li>Vona, G., Sabile, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+by+size+of+epithelial+tumor+cells+a+new+method+for+the+immunomorphological+and+molecular+characterization+of+circulatingtumor+cells.">Isolation by size of epithelial tumor cells a new method for the immunomorphological and molecular characterization of circulatingtumor cells.</a> Am. J. Pathol. 156 (1), 57-63 (2000).</li><li>Marrinucci, D., Bethel, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Case+study+of+the+morphologic+variation+of+circulating+tumor+cells.">Case study of the morphologic variation of circulating tumor cells.</a> Human pathology. 38 (3), 514-519 (2007).</li><li>Lin, H. K., Zheng, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Portable+filter-based+microdevice+for+detection+and+characterization+of+circulating+tumor+cells.">Portable filter-based microdevice for detection and characterization of circulating tumor cells.</a> Clin. Cancer Res. 16 (20), 5011-5018 (2010).</li><li>Williams, A., Rawal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+translation+of+a+novel+microfilter+technology+Capture,+characterization+and+culture+of+circulating+tumor+cells.">Clinical translation of a novel microfilter technology Capture, characterization and culture of circulating tumor cells.</a> PHT. , 220-223 (2013).</li><li>Ao, Z., Parasido, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermoresponsive+release+of+viable+microfiltrated+Circulating+Tumor+Cells+(CTCs)+for+precision+medicine+applications.">Thermoresponsive release of viable microfiltrated Circulating Tumor Cells (CTCs) for precision medicine applications.</a> Lab Chip. 15, 4277-4282 (2015).</li><li>Xu, T., Lu, B., Tai, Y. C., Goldkorn, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cancer+detection+platform+which+measures+telomerase+activity+from+live+circulating+tumor+cells+captured+on+a+microfilter.">A cancer detection platform which measures telomerase activity from live circulating tumor cells captured on a microfilter.</a> Cancer Res. 70 (16), 6420-6426 (2010).</li><li>Okano, T., Bae, Y. H., Jacobs, H., Kim, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermally+on-off+switching+polymers+for+drug+permeation+and+release.">Thermally on-off switching polymers for drug permeation and release.</a> J. Control. Release. 11 (1-3), 255-265 (1990).</li><li>Yamada, N., Okano, T., Sakai, H., Karikusa, F., Sawasaki, Y., Sakurai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermo-responsive+polymeric+surfaces;+control+of+attachment+and+detachment+of+cultured+cells.">Thermo-responsive polymeric surfaces; control of attachment and detachment of cultured cells.</a> Die Makromol. Chemie, Rapid Commun. 11 (11), 571-576 (1990).</li><li>Deng, Y., Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+microfluidic+chip+system+for+single-cell+secretion+profiling+of+rare+circulating+tumor+cells.">An integrated microfluidic chip system for single-cell secretion profiling of rare circulating tumor cells.</a> Sci. Rep. 4, 7499 (2014).</li><li>Hou, S., Zhao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capture+and+stimulated+release+of+circulating+tumor+cells+on+polymer-grafted+silicon+nanostructures.">Capture and stimulated release of circulating tumor cells on polymer-grafted silicon nanostructures.</a> Adv. Mater. 25 (11), 1547-1551 (2013).</li><li>Xiao, Y., Zhou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+and+selective+cell+retention+and+recovery+from+whole+blood+by+electroactive+thin+films.">Effective and selective cell retention and recovery from whole blood by electroactive thin films.</a> ACS Appl. Mater. Interfaces. 6 (23), 20804-20811 (2014).</li><li>Wallwiener, M., Hartkopf, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+HER2+phenotype+of+circulating+tumor+cells+in+metastatic+breast+cancer:+a+retrospective+study+in+107+patients.">The impact of HER2 phenotype of circulating tumor cells in metastatic breast cancer: a retrospective study in 107 patients.</a> BMC cancer. 15 (1), 403 (2015).</li></ol>

O processo de captura CTC viável do sangue total e liberando-os do microfiltro é relativamente simples; no entanto alguns pontos críticos são dignos de menção. É imperativo, como com toda a cultura de células que uma condição estéril é mantido através de todo o processo. O passo inicial de revestimento do filtro com PIPAAm é crítico, como a base para a técnica de libertar as células do filtro se baseia na exploração de temperatura propriedades interfaciais responsivos do PIPAAm. Para assegurar o filtr...

A doença metastática é responsável pela maioria das mortes por câncer. Desenvolvimento de biomarcador de diagnóstico e prognóstico companheiro para metástase é crucial na gestão e tratamento do câncer. As células tumorais em circulação (CTC) desempenham um papel central na disseminação de tumores e metástases. Além disso, sendo facilmente acessível como uma &quot;biópsia líquida&quot; biomarcador, CTC em pacientes com câncer &#39;sangue periférico tem vindo a aumentar como um &quot;viveiro&quot; para pesquisa com biomarcadores de câncer. CTC têm sido bem validado como um biomarcador prognóstico em várias configurações de câncer, incluindo mama, próstata e cancro colorectal 1-3. No entanto, avanços recentes no campo CTC indicou que a simples enumeração dessas células raras tem utilidade clínica limitada, como demonstrado em ensaios clínicos de intervenção 4. Assim, existe uma necessidade emergente para as tecnologias que permitem a caracterização molecular e funcional do CTC. Atualmente, existem apenas algumas tecnologias que permitem for não-antigénio tendenciosa, captura viável e lançamento do CTC, permitindo robusta 5,6 análise molecular e funcional jusante. A maioria destes dispositivos microfabricados são acoplados às plataformas de microfluidos e, assim, têm um factor limitante na quantidade de sangue que esta pode ser processado, o que varia de 2-4 ml 7-10. CTC são eventos raros em um único tubo de coleta de sangue (7,5 ml), portanto, reduzindo ainda mais a quantidade de sangue que pode ser processado, dificulta enormemente a possibilidade de capturar e isolar estas células de interesse. Nós desenvolvemos dois tipos de dispositivos microfiltro de membrana Parylene C para a captura de CTC que exploram as diferenças de tamanho entre as células tumorais maiores e as células sanguíneas normais menores 11,12. Temos relatado anteriormente no filtro de poros enumeração rodada e comparou-o com uma plataforma de aprovado pela FDA, onde o micro filtro mostrou-se superior em CTC eficiência de capturapara amostras de cancro do sangue do paciente 13,14. No entanto, uma limitação do filtro redondo é a necessidade de usar um fixador à base de formaldeído antes da filtração. Este processo preserva a morfologia de células, permitindo-lhes resistir a tensão de cisalhamento e a pressão durante o processo de filtração. Enquanto enumeração e estudos moleculares podem ser realizados no chip 13, o fixador prejudica a capacidade de realizar uma caracterização funcional. Para resolver esta limitação, foi desenvolvido um filtro de poro de ranhura que nega a necessidade de fixar as células antes da filtração (Figura 1). A geometria da ranhura de poro (6 uM de largura x 40 ^ m de entalhe comprimento poros) permite que as células tumor a ser capturado quando a oclusão apenas parcialmente uma poro e, portanto, ainda permitindo a passagem livre para outras células de sangue e aliviar o aumento da pressão, que poderia levar a danos nas células e eventual rebentamento 15,16 O cartucho de slot de poros é composto por 2 peças de acrílico que sandwicho filtro de entalhe de poro entre a parte superior e na parte inferior com polidimetilsiloxano (PDMS), que actua como um vedante para proporcionar uma vedação à prova de fugas 14,15 (Figura 1). Embora a eficiência da captação do filtro de entalhe de poro é alta, (Tabela 1), o CTC capturado estão ligadas à membrana Parylene C por fortes interacções electrostáticas não-específicos, em vez de matriz extracelular (ECM) 15 adesão mediada. Métodos tais como o fluxo inverso ou a utilização de raspadores de células não conseguem libertar eficazmente as células do filtro, ou resultar em danos celulares e a morte celular. Nós exploramos um uso não convencional de PIPAAm para formular uma estratégia de liberação 15. PIPAAm é um polímero que sofre uma transição de fase reversível temperatura crítica inferior de solução (TCIS), a uma temperatura de solução de 32 ° C 17. Tradicionalmente, esta propriedade de PIPAAm tem sido amplamente explorada para aplicações de engenharia de tecidos. Tipicamente, as células sãosuperfícies cultivadas em PIPAAm revestidos a 37 ° C quando PIPAAm é hidrofóbico. As células podem então ser separado como uma folha, quando a temperatura da cultura é deslocada para abaixo de 32 ° C, onde a superfície revestida PIPAAm torna-se hidratado 17,18. Nós explorou essa propriedade térmica através da realização do processo de filtração à temperatura ambiente (inferior a 32 ° C) e, em seguida, permitindo libertação de células, colocando o filtro em meios de cultura mantida a 37 ° C. A esta temperatura, a camada de polímero se torna hidrofóbica PIPAAm, libertando assim a células electrostaticamente ligados 15 (Figura 1). Embora o método sensível à temperatura, bem como outros métodos têm sido aplicadas com sucesso para atingir captação CTC viável e libertar 19-21, uma desvantagem potencial chave partilhada por estas tecnologias relatados é que todos eles empregam um princípio dependente de antigénio para a captura do CTC. Antigen baseada captura de CTC, p, como mostradoreviously, pode levar a tendenciosa análise 11,14 CTC. Por exemplo, muitas tecnologias baseadas em afinidade empregar anticorpo que se liga EpCAM para a captura do CTC. No entanto, tem sido demonstrado CTC para expressar vários níveis de EpCAM, levando a omissão de EpCAM e EpCAM baixo CTC negativa por estas tecnologias. Além disso, as limitações podem ocorrer quando CTC de origem não epitelial é de interesse, tais como CTC em ambientes de melanoma e sarcoma. Assim, uma tecnologia que permite a captura viável CTC e liberação sem potencial viés introduzido por captura com base antígeno é altamente desejável. Importantemente, o dispositivo de captura é puramente microfiltro dimensionada com base e a estratégia de liberação é agnóstico à presença de certos marcadores de superfície. Acreditamos que o emprego do microfiltro revestido PIPAAm vai ajudar a expandir a nossa compreensão do processo metastático, através do fornecimento a capacidade de capturar e liberar CTC para as análises a jusante de forma eficaz e eficiente. Isto pode potenteei ra me expor novas moléculas para as quais novas terapias direcionadas sistêmicas pode ser dirigidas, bem como fornecer um biomarcador que pode ser monitorado de forma fácil e ajuda na gestão do paciente com câncer.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="603">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:107px;width:216px;">Slot Filter</td>
			<td style="width:101px;">Circulogix Inc.</td>
			<td style="width:119px;">MSF-01</td>
			<td style="width:167px;">Different size filters available based for filtration for CTC from blood or urine (www.circulogixinc.com)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">poly(N-iso-propylacrylamide) (PIPAAm)&#160;</td>
			<td style="width:101px;">Ploysciences Inc.</td>
			<td style="width:119px;">21458</td>
			<td style="width:167px;">Non-Hazardous. Store at room temp.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">1-Butanol</td>
			<td style="width:101px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">B7906</td>
			<td style="width:167px;">Use in well ventilated area</td>
		</tr>
		<tr height="118">
			<td height="118" style="height:119px;width:216px;">Plastic Microscope Slides</td>
			<td style="width:101px;">Cole-Parmer</td>
			<td style="width:119px;">48510-30</td>
			<td style="width:167px;">Any plastic slides or alternatively any sort of square (Metal, Acrylic etc.) can be used if it will be bale to hold the 8mmx8mm filter square</td>
		</tr>
		<tr height="59">
			<td height="59" style="height:59px;width:216px;">Spin Coater</td>
			<td style="width:101px;">Specialty Coating Systems</td>
			<td style="width:119px;">SCS G3 Spin Coater</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:63px;width:216px;">Polyimide Tape</td>
			<td style="width:101px;">Uline</td>
			<td style="width:119px;">S-7595</td>
			<td style="width:167px;">Polyimide is the generic name for Kapton Tape which can be purchased form multiple vendors (Amazon, Kaptontape.com)</td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;width:216px;">HBSS- Hank&#39;s Balanced Salt Solution</td>
			<td style="width:101px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:216px;">1XPBS</td>
			<td style="width:101px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="189">
			<td height="189" style="height:189px;width:216px;">McCoy&#39;s</td>
			<td style="width:101px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">16600-082</td>
			<td style="width:167px;">Warm in 37 &#8304;C water bath before use. McCoys was used for SKBr3 cells, if you use different cell lines or patient blood, please use media that would be optimal for that particular case</td>
		</tr>
		<tr height="74">
			<td height="74" style="height:74px;width:216px;">Falcon Petri dishes 35x10 mm</td>
			<td style="width:101px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">25373-041</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="87">
			<td height="87" style="height:87px;width:216px;">Microfilter Cassette</td>
			<td style="width:101px;">Circulogix Inc.</td>
			<td style="width:119px;">FC-01</td>
			<td style="width:167px;">Custom catridges are avilable based on filtration for CTC from blood or urine&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Syringe 20mL</td>
			<td style="width:101px;">BD Scientific</td>
			<td style="width:119px;">302830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Syringe Pump</td>
			<td style="width:101px;">KD scientific&#160;</td>
			<td style="width:119px;">78-0100V</td>
			<td style="width:167px;">Any syringe pump capable of holding a 25mL syringe may be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cellstar 50mL Centrifuge tube</td>
			<td style="width:101px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">82050-322</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Greiner Bio One 6 well plate</td>
			<td style="width:101px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">89131-688</td>
			<td style="width:167px;">Any brand can be used, as long as the surface is compatiable for cell adesion and not repellant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SKBR3 Cells</td>
			<td style="width:101px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">HTB-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Live Dead Assay</td>
			<td style="width:101px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">L3224</td>
			<td style="width:167px;">Any assay that can provide a reasonable analysis to evaluate live cells will work</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Cell Culture Incubator</td>
			<td style="width:101px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">98000-368</td>
			<td style="width:167px;">Any incubator that can be used for cell culture will suffice</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

capture and release of viable circulating tumor cells from blood

Nós demonstramos um método para captura com base tamanho de células de tumor circulantes viável (CTC) a partir de sangue total, juntamente com a libertação destas células a partir de chip para análise e / ou a jusante cultura. A estratégia emprega o uso de um novo Parylene C microfiltro ranhura membrana de poros para capturar CTC e um revestimento de poli (N-iso-propilacrilamida) (PIPAAm) para thermoresponsive libertação viável do CTC capturado. A captura de células vivas é activado, aproveitando a concepção de uma geometria de abertura de poros com dimensões específicas para reduzir a tensão de cisalhamento tipicamente associados com o processo de filtração. Enquanto o microfiltro exibe uma elevada eficiência de captura, a libertação destas células não é trivial. Tipicamente, apenas uma pequena percentagem de células são libertadas quando as técnicas tais como o fluxo reverso ou raspagem célula são utilizados. A forte adesão destas células de cancro epitelial da membrana Parylene C é atribuível à interacção electrostática não específica. Para contrariar thé efeito, aplicou-se o uso de revestimento PIPAAm e exploradas as suas propriedades interfaciais responsivos térmica para libertar as células do filtro. O sangue é filtrado em primeiro lugar, à temperatura ambiente. Abaixo de 32 ° C, PIPAAm é hidrofílica. Depois disso, o filtro é colocado em qualquer meio de cultura ou um tampão mantida a 37 ° C, o que resulta na PIPAAm transformando hidrófobo, e, subsequentemente, libertando as células electrostaticamente ligados.

Usando sangue de dadores saudáveis ​​(obtido no âmbito de um protocolo aprovado pela Universidade de Miami IRB 20.150.020 sequência de um consentimento informado) enriquecida com células cancerígenas cultivadas, a técnica thermoresponsive para a liberação de células viáveis ​​circulantes do tumor (CTC), a captura alcançado, liberação e eficiência na recuperação de 94% ± 9%, 82% ± 5% e 77% ± 5%, respectivamente (Tabela 1) 15. Por comp...

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Capture and Release of Viable Circulating Tumor Cells from Blood

Um protocolo para utilizar um poli (N-iso-propilacrilamida) (PIPAAm) microfiltro revestido para captura e libertação eficaz thermoresponsive de células viáveis tumorais circulantes (CTC) é apresentada. Este método permite a captura de CTC de sangue dos pacientes e posterior liberação dos CTC viável para a cultura off-chip jusante, análises e caracterização.

Captura e libertação de viáveis ​​circulantes células tumorais do sangue

We demonstrate a method for size based capture of viable circulating tumor cell (CTC) from whole blood, along with the release of these cells from chip ...

The overall goal of this technique is to effectively capture viable circulating tumor cells or CTCs from whole blood. These CTCs can be placed into culture or be used for downstream analyses which require non fixed samples. This method can help answer key questions in the field of metastasis.It can also be used to follow disease progression, response to therapy and evaluate risk of recurrence. The advantage of this technique is the ability to perform label-free capture of viable CTCs from any solid tumor while remaining independent of biomarker expression. We first had the idea of releasing CTCs from the filter because we wanted to do downstream RNA analysis and culture of CTCs, instead of culturing them in-situ on the filter.To begin the experiment, weigh enough PIPAAm to prepare a 10%weight per volume solution in a 15 milliliter tube, containing butanol. Vortex the tube until the solution is clear. Next, cut plastic microscope slides into roughly 12 millimeter by 12 millimeter squares with a pair of scissors.Then, using a sharp pair of straight edge scissors, cut a slot-pore microfilter wafer into eight millimeter by eight millimeters squares and place these pieces directly onto the plastic squares. Using a polyimide film tape, secure the cut filters onto the plastic squares, only on the edge and the corner of the filter so that at least, seven millimeter by seven millimeter filter area is not covered by the tape. Place the microfilter that is secured on the plastic square onto the vacuum chuck of the spin coater.Program the spin coater to the following recipe. Then, with a standard plastic transfer pipette, dispense enough 10%weight per volume PIPAAm solution to completely cover the microfilter surface and start the spin coater. After the coating is completed, remove the PIPAAm coated microfilter from the spin coater and leave the filter attached to the plastic square during storage.Move on to filtration cassette assembly and rehydrate the PIPAAm coated microfilter at room temperature by placing the microfilter into a petri dish. Add 1X PBS until the microfilter is fully submerged. After the hydration step, release the filter from the plastic square by peeling or cutting the polyimide film tape from the filter.Next, assemble the microfilter into the filtration cassette by sandwiching the microfilter between the top and bottom acrylic piece along the PDMS pieces which act as a gasket. Then, clamp the acrylic cassette with clips to secure the filter, to provide a tight seal. Warm three milliliters of McCoy's cell culture medium to 37 degrees celsius.Add 7.5 milliliters of Hank's balanced salt solution or HBSS to the 7.5 milliliters of blood sample and aspirate this diluted blood into a 25 milliliter syringe. After identifying the top of the cassette, engage the filtration cassette with the syringe and place it onto the syringe pump. Set the syringe pump to a 75 milliliter per hour flow rate.Place a 50 milliliter tube at the bottom to collect the flow through and start the pump. After filtration is complete, disengage the filtration cassette, taking note which side is the top that has the cells caught in the PIPAAm coated surface. Aspirate one milliliter of the warm culture medium into a new syringe.Again, determine the top of the cassette and then re-engage the filtration cassette with the syringe containing the medium and engage the bottom end of the cassette so that the PIPAAm coated surface of the filter is facing away from the syringe. Then place the syringe back onto the syringe pump and hold the six well plate right under the filtration cassette. Set the flow rate and start the pump.Pass all the medium through the filter and collect the flow through in the petri dish. Wait for all the medium to pass through, then stop the pump and remove the syringe and filtration cassette from the pump. Next, disengage the filtration cassette from the syringe and open it to retrieve the filter from the cassette.Place the filter with the PIPAAm surface facing down into the same petri dish used to collect the reverse flow when releasing the cells from the pores. Add the rest of the warm medium and place the petri dish into a culture incubator, set at 37 degrees celsius. Once the filter has been retrieve from the cassette, it is critical to place it in the plate with the cells facing down and if needed, gently shake it in the media to ensure the cells are detached from the filter.After 24 hours in culture, carefully remove the microfilter using forceps and discard the filter. Gently resuspend the erythrocytes and peripheral blood mononuclear cells or PBMCs with a 1000 micro liter pipette. It is critical to be extremely gentle when resuspending the erythrocytes and PBMCs to avoid pipetting out the CTCs.Carefully remove the entire medium containing the resuspended erythrocytes and PBMCs while leaving behind the attached cancer cells and substitute the cells with fresh medium, pre-warmed to 37 degrees celsius. Proceed with CTC viability evaluation. Using healthy donors blood spiked with cultured cancer cells, the thermal responsive technique for release of viable circulating tumor cells or CTCs, achieved capture, release and retrieval efficiency of 94%82%and 77%respectively.The release and retrieval efficiency of uncoated filters were significantly lower. A live dead assay was performed to evaluate the cell viability before the spike into blood and after release. The cells remained viable post release and expanded in culture rapidly.SKBr-3 cells were retrieved from blood by the PIPAAm coated slot filter and plated on a 48 well plate. At 16 hours in a culture, tumour cells adhere to the culture plate along with a hypotonic erythrocytes and leukocytes which settled at the bottom of the plate. Post-wash non-adherent cells were removed only leaving adhering tumor cells on the plate.The same filters can be used for fixed cell capture, both for enumerating and molecular characterizations of CTCs to track progression of cancer and better cancer management. After its development, this technique paved the way for the researchers in the field of CTCs enabling functional characterization of these cells to explore future drug targets while taking a step towards personalized medicine.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Isolation of Circulating Tumor Cells in an Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer

Isolamento de células tumorais circulantes em um modelo de rato ortotópico de câncer colorretal

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, subcutaneous mouse models have severe limitations and do not accurately simulate ...

Pesquisa do câncer

Conditional Knockdown of Gene Expression in Cancer Cell Lines to Study the Recruitment of Monocytes/Macrophages to the Tumor Microenvironment

Knockdown condicional de expressão gênica em linhas de células de câncer para estudar o recrutamento de monócitos/macrófagos para o microambiente do Tumor

siRNA and shRNA-mediated knock down (KD) methods of regulating gene expression are invaluable tools for understanding gene and protein function. However, ...

The Establishment of a Lung Colonization Assay for Circulating Tumor Cell Visualization in Lung Tissues

O estabelecimento de um ensaio de colonização de pulmão para visualização de células de Tumor nos tecidos do pulmão de circulação

Metastasis is the major cause of cancer death. The role of circulating tumor cells (CTCs) in promoting cancer metastasis, in which lung colonization by ...

Characterization of Tumor Cells Using a Medical Wire for Capturing Circulating Tumor Cells: A 3D Approach Based on Immunofluorescence and DNA FISH

Caracterização de células tumorais, usando um fio de médico para a captura de células tumorais de circulação: uma abordagem 3D baseado no DNA peixe e imunofluorescência

Circulating tumor cells (CTCs) are associated with poor survival in metastatic cancer. Their identification, phenotyping, and genotyping could lead to a ...

Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts

Isolamento e caracterização de células iniciantes tumorais de sarcoma de xenoenxertos derivados do paciente

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been ...

Investigation of Genetic Dependencies Using CRISPR-Cas9-based Competition Assays

Investigação de dependências genéticas utilizando ensaios de competição baseados em CRISPR-Cas9

Gene perturbation studies have been extensively used to investigate the role of individual genes in AML pathogenesis. For achieving complete gene ...

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

Isolamento de células-tronco mesenquimais de tecido pulpar e co-cultura com células cancerosas para estudar suas interações

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor ...

Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

Análise Citométrica de fluxo de espécies reativas de oxigênio mitocondrial em células tronco e progenitoras hematopoiéticas Murinas e leucemia acionada por MLL-AF9

We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from ...

Micromanipulation of Circulating Tumor Cells for Downstream Molecular Analysis and Metastatic Potential Assessment

Micromanipulação de células tumorais circulantes para análise molecular a jusante e avaliação do potencial metastático

Blood-borne metastasis accounts for&#160;most cancer-related deaths and involves circulating tumor cells (CTCs) that are successful in establishing new ...

Captura e libertação de viáveis ​​circulantes células tumorais do sangue

Captura e libertação de viáveis circulantes células tumorais do sangue