Name: procedure for adaptive laboratory evolution of microorganisms using a chemostat
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Procedure for Adaptive Laboratory Evolution of Microorganisms Using a Chemostat at JoVE.com

This study was financially supported by the Korean Ministry of Science, ICT and Future Planning (Intelligent Synthetic Biology Center program 2012M3A6A8054887). P. Kim was supported by a fellowship from the Catholic University of Korea (2015).

1. إعداد المعدات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على جرة ناظم كيميائي (150-250 مل) أو دورق مخروطي (250 مل) تحتوي على مدخل الميناء والميناء منفذا. ربط الموانئ مع أنبوب السيليكون السماح لمعدلات تدفق 10-100 مل / ساعة. اختياريا، است...

<ol>
	<li>Rando, O. J., Verstrepen, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Timescales+of+genetic+and+epigenetic+inheritance.">Timescales of genetic and epigenetic inheritance.</a> Cell. 128, 655-668 (2007).</li><li>Kim, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+differential+adaptation+to+anaerobic+stress+via+genomic+mutations+by+Escherichia+coli+strains+K-12+and+B+lacking+alcohol+dehydrogenase.">Short-term differential adaptation to anaerobic stress via genomic mutations by Escherichia coli strains K-12 and B lacking alcohol dehydrogenase.</a> Front Microbiol. 5, 476 (2014).</li><li>Mendizabal, I., Keller, T. E., Zeng, J., Yi, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetics+and+evolution.">Epigenetics and evolution.</a> Integr Comp Biol. 54, 31-42 (2014).</li><li>Lee, J. Y., Seo, J., Kim, E. S., Lee, H. S., Kim, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+evolution+of+Corynebacterium+glutamicum+resistant+to+oxidative+stress+and+its+global+gene+expression+profiling.">Adaptive evolution of Corynebacterium glutamicum resistant to oxidative stress and its global gene expression profiling.</a> Biotechnol Lett. 35, 709-717 (2013).</li><li>Lee, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+oxidative+stress-tolerant+Corynebacterium+glutamicum.">Artificial oxidative stress-tolerant Corynebacterium glutamicum.</a> AMB Express. 4, 15 (2014).</li><li>Narang, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+steady+states+of+microbial+growth+on+mixtures+of+substitutable+substrates+in+a+chemostat.">The steady states of microbial growth on mixtures of substitutable substrates in a chemostat.</a> J Theor Biol. 190, 241-261 (1998).</li><li>Kwon, Y. D., Kim, S., Lee, S. Y., Kim, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+continuous+adaptation+of+Escherichia+coli+to+high+succinate+stress+and+transcriptome+analysis+of+the+tolerant+strain.">Long-term continuous adaptation of Escherichia coli to high succinate stress and transcriptome analysis of the tolerant strain.</a> J Biosci Bioeng. 111, 26-30 (2011).</li><li>Barrick, J. E., Lenski, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+dynamics+during+experimental+evolution.">Genome dynamics during experimental evolution.</a> Nat Rev Genet. 14, 827-839 (2013).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sequence+Alignment/Map+format+and+SAMtools.">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25, 2078-2079 (2009).</li><li>McKenna, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Genome+Analysis+Toolkit:+a+MapReduce+framework+for+analyzing+next-generation+DNA+sequencing+data.">The Genome Analysis Toolkit: a MapReduce framework for analyzing next-generation DNA sequencing data.</a> Genome Res. 20, 1297-1303 (2010).</li><li>Deatherage, D. E., Barrick, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+mutations+in+laboratory-evolved+microbes+from+next-generation+sequencing+data+using+breseq.">Identification of mutations in laboratory-evolved microbes from next-generation sequencing data using breseq.</a> Methods Mol Biol. 1151, 165-188 (2014).</li></ol>

الكائنات الدقيقة قادرة على التكيف مع جميع البيئات تقريبا بسبب معدل نموها السريع والتنوع الجيني. تطور مختبر التكيف تمكن الكائنات الدقيقة تتطور في ظل ظروف مصممة، الذي يوفر وسيلة لاختيار الكائنات الفردية إيواء الطفرات العفوية التي تعود بالفائدة تحت ظروف معينة. <p class...

يمكن أن الكائنات الحية الدقيقة على البقاء والتكيف مع بيئات متنوعة. تحت ضغط شديد، يمكن أن يحدث التكيف عن طريق الاستحواذ على الظواهر المفيدة التي كتبها الطفرات الجينومية عشوائية واختيار إيجابية لاحقة 1-3. لذلك، يمكن أن الخلايا الميكروبية التكيف عن طريق تغيير التمثيل الغذائي أو الشبكات التنظيمية للنمو الأمثل، وهو ما يطلق عليه &quot;تطور التكيف&quot;. الأخيرة النزعات الميكروبية الهامة، مثل انتشار الجراثيم وحدوث سلالات ميكروبية قوية، ترتبط ارتباطا وثيقا جدا لالتكييفية تطور تحت ظروف ضاغطة. تحت ظروف المختبر محددة، ونحن قادرون على دراسة آليات التطور الجزيئي وحتى التحكم في اتجاه تطور ميكروبات لمختلف التطبيقات. على عكس الكائنات متعددة الخلايا والكائنات وحيدة الخلية هي مناسبة تماما لتطور مختبر التكيف (الرابطة) وذلك للأسباب التالية: أنها تجديد بسرعة، والحفاظ على عدد كبير من السكان، وأنه من السهل لخلق والحفاظ هومبيئات ogeneous. جنبا إلى جنب مع التطورات الحديثة في تقنيات تسلسل الحمض النووي وتقنيات عالية الإنتاجية، الرابطة يسمح لمراقبة مباشرة من التغيرات الجينية التي تؤدي إلى تغييرات تنظيمية النظامية. ديناميات طفرية ومجموعة متنوعة من السكان هي أيضا ملاحظتها. استراتيجيات الهندسة الوراثية يمكن تحديد من تحليل سلالات الرابطة 4،5. ثقافة ناظم كيميائي هي الطريقة المستخدمة للحصول على خلايا ثابتة للدولة وزيادة الإنتاجية في عمليات التخمير 6. يضاف متوسطة جديدة ويتم حصاد ثقافة مرق أثناء عملية (ويشمل هذا الأخير المتوسطة والكتلة الحيوية). ثقافة ناظم كيميائي على المدى الطويل، ومع ذلك، يتغير الإنتاجية ثابتة للدولة للثقافة ويجلب تراكم الطفرات العفوية والاختيار خلال ثقافة (الشكل 1A). تحت ضغوط الانتقاء مختلفة (الضغوطات)، ومما يعزز تراكم الطفرات. وهناك زيادة تدريجية من التوتر في المدى الطويل<html> يوفر ناظم كيميائي لمجموعة مستمرة من الطفرات التي تعمل ضد الضغوطات معينة، مثل درجة الحرارة ودرجة الحموضة، والضغط الاسموزي والتجويع المغذيات، والأكسدة، والمنتجات النهائية السامة، وما إلى ذلك نقل مستعمرة من وسط صلب ونقل المسلسل من الوسط السائل (المتكررة ثقافة دفعة) تسمح للباحثين للحصول على الكائنات الحية الدقيقة تطورت (الشكل 1B و1C). على الرغم من أن الثقافة ناظم كيميائي يتطلب أساليب معقدة، وتجمع التنوع (عدد مكررات وحجم السكان) أعلى من تلك التي يحصل عليها عن طريق التحويل مستعمرة وتقنيات نقل التسلسلية. تعرض الضغط مستقر إلى الخلايا الفردية وانخفض التباين في دولة الخلوية خلال ثقافة ناظم كيميائي (الحالة المستقرة) هي فوائد أخرى من الرابطة بالمقارنة مع التقنيات المعتمدة ثقافة دفعة واحدة. هو عرض ALE التوتر الناجم عن الإشريكية القولونية يتعرضون لظروف السكسينات عالية في هذه المقالة. ديزيل / ftp_upload / 54446 / 54446fig1.jpg &quot;/&gt; الشكل 1: طرق تطور مختبر التكيف (A) ناظم كيميائي؛ (ب) نقل المسلسل؛ (ج) نقل مستعمرة. الأرقام أعلى توضح مفهوم طرق الرابطة، والأرقام السفلية توضح عدد الخلايا التي نمت خلال الرابطة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54446/54446fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Mini-chemostat fermentor</td>
			<td style="width:71px;">Biotron Inc.</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:167px;">manufactured by special order</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">silicon tubing</td>
			<td style="width:71px;">Cole-Parmer</td>
			<td style="width:119px;">Masterflex L/S 13</td>
			<td>tubing size can be varied depending on the dilution rate and the size of fermentor jar.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">reservoir jar</td>
			<td style="width:71px;">Bellco</td>
			<td style="width:119px;">Media storage bottle&#160;</td>
			<td>20 L</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">chemicals</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td>reagent grade</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">glucose</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G5767</td>
			<td>ACS reagent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">NH4Cl</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A9434</td>
			<td>for molecular biology, suitable for cell culture, &#8805;99.5%</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">NaCl</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">746398</td>
			<td>ACS reagent, &#8805;99%</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Na2HPO4&#183;2H2O</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4272</td>
			<td>98.5-101%</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">KH2PO4&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">795488</td>
			<td>ACS reagent, &#8805;99%</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">MgSO4&#183;7H2O</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">230391</td>
			<td>ACS reagent, &#8805;98%</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">CaCl2</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">793639</td>
			<td>ACS reagent, &#8805;96%</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">thiamine&#183;HCl&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T4625</td>
			<td>reagent grade, &#8805;99%</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Na2&#183;succinate&#183;6H2O</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S2378</td>
			<td>ReagentPlus, &#8805;99%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

procedure for adaptive laboratory evolution of microorganisms using a chemostat

Natural evolution involves genetic diversity such as environmental change and a selection between small populations. Adaptive laboratory evolution (ALE) refers to the experimental situation in which evolution is observed using living organisms under controlled conditions and stressors; organisms are thereby artificially forced to make evolutionary changes. Microorganisms are subject to a variety of stressors in the environment and are capable of regulating certain stress-inducible proteins to increase their chances of survival. Naturally occurring spontaneous mutations bring about changes in a microorganism's genome that affect its chances of survival. Long-term exposure to chemostat culture provokes an accumulation of spontaneous mutations and renders the most adaptable strain dominant. Compared to the colony transfer and serial transfer methods, chemostat culture entails the highest number of cell divisions and, therefore, the highest number of diverse populations. Although chemostat culture for ALE requires more complicated culture devices, it is less labor intensive once the operation begins. Comparative genomic and transcriptome analyses of the adapted strain provide evolutionary clues as to how the stressors contribute to mutations that overcome the stress. The goal of the current paper is to bring about accelerated evolution of microorganisms under controlled laboratory conditions.

لارتفاع السكسينات من التوتر التكيف، والبرية من نوع E. كان القولونية W3110 سلالة مثقف في ناظم كيميائي في D = 0.1 ساعة -1 لمدة 270 يوما (الشكل 2). <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/54446/54446fig2.jpg" /> الشكل 2...

Watch this Scientific Journal Video about Procedure for Adaptive Laboratory Evolution of Microorganisms Using a Chemostat at JoVE.com

Procedure for Adaptive Laboratory Evolution of Microorganisms Using a Chemostat

هنا، نقدم بروتوكول للحصول تطور مختبر التكيف من الكائنات الحية الدقيقة في ظل ظروف استخدام الثقافة ناظم كيميائي. أيضا، وتناقش التحليل الجيني لسلالة تطورت.

إجراءات التكيف مختبر تطور الكائنات الدقيقة باستخدام ناظم كيميائي

Natural evolution involves genetic diversity such as environmental change and a selection between small populations. Adaptive laboratory evolution (ALE) ...

The overall goal of this procedure is to enable a microorganism to evolve in laboratory conditions. This method can help answer key questions in the microbiology field, such as adrenal function relationships, stress responses, metabolic engineering, and of course, evolution. The main advantage of this technique is continuous selection of the most suaded descendant under specific laboratory conditions.Begin this procedure with the preparation of equipment, as well as initial medium, stress medium and high stress medium, as described in the text protocol. Inoculate a single colony or wild type E.coli in a 15-milliliter test tube containing four milliliters of initial medium. Incubate the test tube in a shaking incubator for 12 hours at 37 degrees celsius and 220 rpm.Incubate the chemostat jar providing for aeration and agitation at 37 degrees celsius for six hours. Following the incubation, aseptically connect the end of the silicon tubing from the pumps to the chemostat jar. Aseptically transfer one milliliter of pre-culture to the chemostat jar.Start the outlet pump and collect the culture in the exponential phase. Check the optical density at 600 nanometers of the culture from the outlet tubing. Then, start the inlet pump.Check the optical density of the culture at 600 nanometers from the outlet tubing every 24 hours. After operating the chemostat for 96 hours, which is a 9.6 full turnover, exchange the reservoir to the lowest concentration of high stress medium. When you exchange the reservoir to a higher stress medium, the cells may be shocked.If the cell density is too low, stop feeding the higher stress medium for some time to restore the cell density. If the optical density is lower than 0.2, stop the feeding inlet pump for six hours. Restart the inlet pump and check that the optical density is over 0.2.Gradually increase the concentration of the stressor by incrementally changing to a reservoir containing a higher stressor concentration. Take samples of the adapted culture whenever it reaches a stressor adaptation milestone and store for further genomic analysis. For sample storage, mix the 0.5 milliliter culture sample with 0.5 milliliters of a sterilized 80%glycerol solution and store it at 80 degrees celsius.Prepare 1.6%ager plate medium containing the same stressor at the same concentration as in the medium. Plate 0.1 milliliters of the outlet culture from the chemostat and incubate at 37 degrees celsius for 16 hours. Following incubation, pick single colonies from the plate using a sterile toothpick and inoculate them in 15 milliliter test tubes containing the same stressor and at the same medium concentration as in the chemostat.Incubate for six hours. Transfer one milliliter of the culture broth into a 250 milliliter erlenmeyer flask containing 50 milliliters of medium. Harvest 0.5 milliliters of the culture broth every hour and measure the optical density at 600 nanometers.Compare the growth rate of the adapted strain to that of the wild type strain given the stressor. The wild type E.coli strain was evolved in a high succinate stressed condition for 270 days, which corresponds to nearly 930 generations. Whenever higher succinate stress was added, the biomass concentration was immediately lowered and then restored.Shown here is a schematic diagram of the chemostat with a mutant that is tolerant against the high succinate stress. Most wild type cells are washed out under the stress conditions and the mutant grows more. Eventually, the population of the mutant descendant is increased.The second and third mutations are continuously selected for and eventually dominate the chemostat. This figure shows that the adapted strain grew without delay under high succinate stressed conditions, while the wild type strain did not. A similar strategy can be applied to adaptive laboratory evolution using a chemostat with a variation of stressors.After watching this video, you should have a good understanding of how to acquire and evolve the microorganism under a specified condition. Once mastered, this technique can be done in a couple of month. While attempting this procedure, it's important to remember not to wash out chemostat cells by adding too much stress at once and remember to check the optical density every day.Following this procedure are the methods like a genome analysis and transcriptome analysis can be performed in order to answer additional questions like what mutation contributes to the stress tolerant evolution?

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Genetics

Evolution

Evolutionary History

SCIENTISTS IN ACTION

Design and Use of a Low Cost, Automated Morbidostat for Adaptive Evolution of Bacteria Under Antibiotic Drug Selection

تصميم واستخدام ومنخفضة التكلفة، الآلي Morbidostat عن التكيف تطور البكتيريا تحت المضادات الحيوية اختيار الدواء

We describe a low cost, configurable morbidostat for characterizing the evolutionary pathway of antibiotic resistance. The morbidostat is a bacterial ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

كريسبر/Cas9-بوساطة التكامل المستهدفة في فيفو استخدام استراتيجية تستند إلى الانضمام إلى التماثل بوساطة نهاية

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

Testing the Role of Multicopy Plasmids in the Evolution of Antibiotic Resistance

اختبار دور البلازميدات Multicopy في تطور المقاومة للمضادات الحيوية

Multicopy plasmids are extremely abundant in prokaryotes but their role in bacterial evolution remains poorly understood. We recently showed that the ...

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

المراقبة على نطاق الجينوم من أخطاء النسخ في الكائنات الحية حقيقية النواة

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...

High-Resolution Comparison of Bacterial Conjugation Frequencies

مقارنة عالية الاستبانة للترددات الاقتران البكتيري

Bacterial conjugation is an important step in the horizontal transfer of antibiotic resistance genes via a conjugative DNA element. In-depth comparisons ...

Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes

Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes

إنتاج الجينات الحذف في الإشريكيّة القولونية بتوصيل P1 مع أشرطة الكاسيت المهربة مقاومة المضادات الحيوية

A first approach to study the function of an unknown gene in bacteria is to create a knock-out of this gene. Here, we describe a robust and fast protocol ...

qKAT: Quantitative Semi-automated Typing of Killer-cell Immunoglobulin-like Receptor Genes

قكات: "كتابة سيميوتوماتيد الكمية" من القاتل-الخلية "جينات مستقبلات" الغلوبولين المناعي مثل

Killer cell immunoglobulin-like receptors (KIRs) are a set of inhibitory and activating immune receptors, on natural killer (NK) and T cells, encoded by a ...

Using Sniper-Cas9 to Minimize Off-target Effects of CRISPR-Cas9 Without the Loss of On-target Activity Via Directed Evolution

استخدام القناصة-Cas9 إلى أدنى حد من آثار خارج الهدف كريسبر-Cas9 دون فقدان النشاط على الهدف عن طريق التطور الموجه

The development of clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-associated protein 9 (Cas9) into therapeutic modalities requires the ...

A FACS-based Protocol to Isolate RNA from the Secondary Cells of Drosophila Male Accessory Glands

A FACS-based Protocol to Isolate RNA from the Secondary Cells of Drosophila Male Accessory Glands

بروتوكول يستند إلى FACS لعزل الحمض النووي الريبي من الخلايا الثانوية للغدد التبعي الذكور Drosophila

To understand the function of an organ, it is often useful to understand the role of its constituent cell populations. Unfortunately, the rarity of ...

A New Toolkit for Evaluating Gene Functions using Conditional Cas9 Stabilization

مجموعة أدوات جديدة لتقييم وظائف الجينات باستخدام تثبيت Cas9 الشرطي

The clustered regularly interspaced short palindromic repeat- (CRISPR-) associated protein 9 (CRISPR/Cas9) technology has become a prevalent laboratory ...