Name: procedure for adaptive laboratory evolution of microorganisms using a chemostat
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Procedure for Adaptive Laboratory Evolution of Microorganisms Using a Chemostat at JoVE.com

This study was financially supported by the Korean Ministry of Science, ICT and Future Planning (Intelligent Synthetic Biology Center program 2012M3A6A8054887). P. Kim was supported by a fellowship from the Catholic University of Korea (2015).

1. הכנת ציוד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג צנצנת chemostat (150-250 מ&quot;ל) או בקבוק Erlenmeyer (250 מ&quot;ל) המכיל יציאת כניסת ויציאת לשקע. חברו את יציאות עם צינורות סיליקון המאפשר ספיקות של 10-100 מ&quot;ל / שעה. לחלופין, להשתמש פורקן אוויר, יצ...

<ol>
	<li>Rando, O. J., Verstrepen, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Timescales+of+genetic+and+epigenetic+inheritance.">Timescales of genetic and epigenetic inheritance.</a> Cell. 128, 655-668 (2007).</li><li>Kim, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+differential+adaptation+to+anaerobic+stress+via+genomic+mutations+by+Escherichia+coli+strains+K-12+and+B+lacking+alcohol+dehydrogenase.">Short-term differential adaptation to anaerobic stress via genomic mutations by Escherichia coli strains K-12 and B lacking alcohol dehydrogenase.</a> Front Microbiol. 5, 476 (2014).</li><li>Mendizabal, I., Keller, T. E., Zeng, J., Yi, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetics+and+evolution.">Epigenetics and evolution.</a> Integr Comp Biol. 54, 31-42 (2014).</li><li>Lee, J. Y., Seo, J., Kim, E. S., Lee, H. S., Kim, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+evolution+of+Corynebacterium+glutamicum+resistant+to+oxidative+stress+and+its+global+gene+expression+profiling.">Adaptive evolution of Corynebacterium glutamicum resistant to oxidative stress and its global gene expression profiling.</a> Biotechnol Lett. 35, 709-717 (2013).</li><li>Lee, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+oxidative+stress-tolerant+Corynebacterium+glutamicum.">Artificial oxidative stress-tolerant Corynebacterium glutamicum.</a> AMB Express. 4, 15 (2014).</li><li>Narang, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+steady+states+of+microbial+growth+on+mixtures+of+substitutable+substrates+in+a+chemostat.">The steady states of microbial growth on mixtures of substitutable substrates in a chemostat.</a> J Theor Biol. 190, 241-261 (1998).</li><li>Kwon, Y. D., Kim, S., Lee, S. Y., Kim, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+continuous+adaptation+of+Escherichia+coli+to+high+succinate+stress+and+transcriptome+analysis+of+the+tolerant+strain.">Long-term continuous adaptation of Escherichia coli to high succinate stress and transcriptome analysis of the tolerant strain.</a> J Biosci Bioeng. 111, 26-30 (2011).</li><li>Barrick, J. E., Lenski, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+dynamics+during+experimental+evolution.">Genome dynamics during experimental evolution.</a> Nat Rev Genet. 14, 827-839 (2013).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sequence+Alignment/Map+format+and+SAMtools.">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25, 2078-2079 (2009).</li><li>McKenna, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Genome+Analysis+Toolkit:+a+MapReduce+framework+for+analyzing+next-generation+DNA+sequencing+data.">The Genome Analysis Toolkit: a MapReduce framework for analyzing next-generation DNA sequencing data.</a> Genome Res. 20, 1297-1303 (2010).</li><li>Deatherage, D. E., Barrick, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+mutations+in+laboratory-evolved+microbes+from+next-generation+sequencing+data+using+breseq.">Identification of mutations in laboratory-evolved microbes from next-generation sequencing data using breseq.</a> Methods Mol Biol. 1151, 165-188 (2014).</li></ol>

מיקרואורגניזמים הם יהיו מסוגלים להתאים כמעט לכל סביבות בגלל קצב הצמיחה המהיר שלהם המגוון הגנטי. אבולוצית מעבדה מסתגלת מאפשרת מיקרואורגניזמים להתפתח בתנאים תוכנן, אשר מספק דרך בחירת אורגניזמים בודדים מחסה מוטציות ספונטניות שאינן מועילים בתנאים הנתונים. <p class="jove_c...

מיקרואורגניזמים יכול לשרוד ולהסתגל סביבות מגוונות. תחת לחץ חמור, הסתגלות יכולה להתרחש באמצעות רכישת פנוטיפים מועילים ידי מוטציות גנומי אקראיות סלקציה חיובית לאחר 1-3. לכן, תאים מיקרוביאליים יכול להתאים על ידי שינוי מטבולי או רשתות רגולטוריות לצמיחה אופטימלית, אשר נקרא &quot;התפתחות מסתגלת&quot;. נטיות חיידקים חשובות אחרונות, כגון התפרצויות של חיידקים לבין ההתרחשות של זנים של חיידקים חזקים, הם קרובים מאוד אדפטיבית אבולוציה בתנאים מלחיצים. בתנאי מעבדה מוגדרים, אנו מסוגלים ללמוד את המכניזם של אבולוציה מולקולרית ואף לשלוט על הכיוון של אבולוצית חיידקים עבור יישומים שונים. בניגוד יצורים רב-תאיים, חד תאיים אורגניזמים מתאימים גם לאבולוציה מעבדה אדפטיבית (ALE) מהסיבות הבאות: הם להתחדש במהירות, הם שומרים על אוכלוסיות גדולות, וזה קל ליצור ולתחזק Homסביבות ogeneous. בשילוב עם התקדמות טכניקות רצפי DNA וטכנולוגיות תפוקה גבוהה, ALE מאפשר תצפית הישירה של שינויים גנומית להוביל שינויים רגולטוריים מערכתיים. דינמיקה מוטציוני ומגוון מהאוכלוסייה הם גם נצפה. אסטרטגיות הנדסה גנטית ניתן לקבוע מניתוח זני ALE 4,5. תרבות Chemostat היא שיטה המשמשת כדי להשיג תאים יציבים ולהגדיל את הפרודוקטיביות תהליכי תסיסה 6. מדיום חדש מתווסף מרק התרבות שנקטף במהלך התהליך (האחרון כולל בינוניות ביומסה). לתרבות לטווח ארוך chemostat, לעומת זאת, משנה את הפרודוקטיביות היציב של התרבות ומביא על הצטברות של מוטציות ספונטניות ובחירת במהלך התרבות (איור 1 א). תחת לחץ ברירה שונה (לחצים), ההצטברות של מוטציות היא משופרת. עלייה הדרגתית של הלחץ לטווח ארוך<html> chemostat מספק מבחר רציף של מוטציות שפועלות נגד גורמי הלחץ הנתונים, כגון טמפרטורה, pH, לחץ האוסמוטי, הרעבה מזינה, חמצון, מוצרי קצה רעילים, וכו &#39;העברת קולוני מתוך בינוני מוצק והעברה סידורית של מדיום נוזלי (חזר תרבות אצווה) גם לאפשר לחוקרים לקבל מיקרואורגניזמים התפתחו (איור 1b ו 1c). למרות שתרבות chemostat דורשת שיטות מסובכות, הברכה של גיוון (מספר חזרות וגודל אוכלוסייה) הוא גבוהה יותר מזה שהושג באמצעות עברת מושבה וטכניקות העברת סדרתי. חשיפת המתח היציבה תאים בודדים וירידת וריאציה במדינת הסלולר במהלך תרבות chemostat (מצב יציב) יתרונות אחרים של ALE לעומת טכניקות התרבות מבוססת יצווה. ALE-induced מתח של Escherichia coli נתון בתנאי succinate גבוהים הוא הציג במאמר זה. Iles / ftp_upload / 54,446 / 54446fig1.jpg &quot;/&gt; איור 1: שיטות של האבולוציה מעבדה אדפטיבית (א) Chemostat;. (ב) העברת סדרתי; (ג) העברת המושבה. הדמויות העליונות להמחיש את הרעיון של שיטות ALE, ואת הדמויות התחתונות להמחיש את מספר התאים גדלו במהלך ALE. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54446/54446fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Mini-chemostat fermentor</td>
			<td style="width:71px;">Biotron Inc.</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:167px;">manufactured by special order</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">silicon tubing</td>
			<td style="width:71px;">Cole-Parmer</td>
			<td style="width:119px;">Masterflex L/S 13</td>
			<td>tubing size can be varied depending on the dilution rate and the size of fermentor jar.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">reservoir jar</td>
			<td style="width:71px;">Bellco</td>
			<td style="width:119px;">Media storage bottle&#160;</td>
			<td>20 L</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">chemicals</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td>reagent grade</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">glucose</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G5767</td>
			<td>ACS reagent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">NH4Cl</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A9434</td>
			<td>for molecular biology, suitable for cell culture, &#8805;99.5%</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">NaCl</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">746398</td>
			<td>ACS reagent, &#8805;99%</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Na2HPO4&#183;2H2O</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4272</td>
			<td>98.5-101%</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">KH2PO4&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">795488</td>
			<td>ACS reagent, &#8805;99%</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">MgSO4&#183;7H2O</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">230391</td>
			<td>ACS reagent, &#8805;98%</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">CaCl2</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">793639</td>
			<td>ACS reagent, &#8805;96%</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">thiamine&#183;HCl&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T4625</td>
			<td>reagent grade, &#8805;99%</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Na2&#183;succinate&#183;6H2O</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S2378</td>
			<td>ReagentPlus, &#8805;99%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

procedure for adaptive laboratory evolution of microorganisms using a chemostat

Natural evolution involves genetic diversity such as environmental change and a selection between small populations. Adaptive laboratory evolution (ALE) refers to the experimental situation in which evolution is observed using living organisms under controlled conditions and stressors; organisms are thereby artificially forced to make evolutionary changes. Microorganisms are subject to a variety of stressors in the environment and are capable of regulating certain stress-inducible proteins to increase their chances of survival. Naturally occurring spontaneous mutations bring about changes in a microorganism's genome that affect its chances of survival. Long-term exposure to chemostat culture provokes an accumulation of spontaneous mutations and renders the most adaptable strain dominant. Compared to the colony transfer and serial transfer methods, chemostat culture entails the highest number of cell divisions and, therefore, the highest number of diverse populations. Although chemostat culture for ALE requires more complicated culture devices, it is less labor intensive once the operation begins. Comparative genomic and transcriptome analyses of the adapted strain provide evolutionary clues as to how the stressors contribute to mutations that overcome the stress. The goal of the current paper is to bring about accelerated evolution of microorganisms under controlled laboratory conditions.

להסתגלות מתח גבוה-succinate, סוג-בר E. coli W3110 זן היה בתרבית chemostat בבית D = 0.1 hr -1 עבור 270 ימים (איור 2). <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54446/54446fig2.jpg" /> איור 2: הסתגלות מתח גבוה-succinate של E. coli W3110 באמצעות תר...

Watch this Scientific Journal Video about Procedure for Adaptive Laboratory Evolution of Microorganisms Using a Chemostat at JoVE.com

Procedure for Adaptive Laboratory Evolution of Microorganisms Using a Chemostat

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להשיג אבולוצית מעבדה אדפטיבית של מיקרואורגניזמים בתנאים באמצעות תרבות chemostat. כמו כן, ניתוח גנטי של הזן התפתח נדון.

נוהל מסתגל מעבדת האבולוציה של מיקרואורגניזמים שימוש Chemostat

Natural evolution involves genetic diversity such as environmental change and a selection between small populations. Adaptive laboratory evolution (ALE) ...

The overall goal of this procedure is to enable a microorganism to evolve in laboratory conditions. This method can help answer key questions in the microbiology field, such as adrenal function relationships, stress responses, metabolic engineering, and of course, evolution. The main advantage of this technique is continuous selection of the most suaded descendant under specific laboratory conditions.Begin this procedure with the preparation of equipment, as well as initial medium, stress medium and high stress medium, as described in the text protocol. Inoculate a single colony or wild type E.coli in a 15-milliliter test tube containing four milliliters of initial medium. Incubate the test tube in a shaking incubator for 12 hours at 37 degrees celsius and 220 rpm.Incubate the chemostat jar providing for aeration and agitation at 37 degrees celsius for six hours. Following the incubation, aseptically connect the end of the silicon tubing from the pumps to the chemostat jar. Aseptically transfer one milliliter of pre-culture to the chemostat jar.Start the outlet pump and collect the culture in the exponential phase. Check the optical density at 600 nanometers of the culture from the outlet tubing. Then, start the inlet pump.Check the optical density of the culture at 600 nanometers from the outlet tubing every 24 hours. After operating the chemostat for 96 hours, which is a 9.6 full turnover, exchange the reservoir to the lowest concentration of high stress medium. When you exchange the reservoir to a higher stress medium, the cells may be shocked.If the cell density is too low, stop feeding the higher stress medium for some time to restore the cell density. If the optical density is lower than 0.2, stop the feeding inlet pump for six hours. Restart the inlet pump and check that the optical density is over 0.2.Gradually increase the concentration of the stressor by incrementally changing to a reservoir containing a higher stressor concentration. Take samples of the adapted culture whenever it reaches a stressor adaptation milestone and store for further genomic analysis. For sample storage, mix the 0.5 milliliter culture sample with 0.5 milliliters of a sterilized 80%glycerol solution and store it at 80 degrees celsius.Prepare 1.6%ager plate medium containing the same stressor at the same concentration as in the medium. Plate 0.1 milliliters of the outlet culture from the chemostat and incubate at 37 degrees celsius for 16 hours. Following incubation, pick single colonies from the plate using a sterile toothpick and inoculate them in 15 milliliter test tubes containing the same stressor and at the same medium concentration as in the chemostat.Incubate for six hours. Transfer one milliliter of the culture broth into a 250 milliliter erlenmeyer flask containing 50 milliliters of medium. Harvest 0.5 milliliters of the culture broth every hour and measure the optical density at 600 nanometers.Compare the growth rate of the adapted strain to that of the wild type strain given the stressor. The wild type E.coli strain was evolved in a high succinate stressed condition for 270 days, which corresponds to nearly 930 generations. Whenever higher succinate stress was added, the biomass concentration was immediately lowered and then restored.Shown here is a schematic diagram of the chemostat with a mutant that is tolerant against the high succinate stress. Most wild type cells are washed out under the stress conditions and the mutant grows more. Eventually, the population of the mutant descendant is increased.The second and third mutations are continuously selected for and eventually dominate the chemostat. This figure shows that the adapted strain grew without delay under high succinate stressed conditions, while the wild type strain did not. A similar strategy can be applied to adaptive laboratory evolution using a chemostat with a variation of stressors.After watching this video, you should have a good understanding of how to acquire and evolve the microorganism under a specified condition. Once mastered, this technique can be done in a couple of month. While attempting this procedure, it's important to remember not to wash out chemostat cells by adding too much stress at once and remember to check the optical density every day.Following this procedure are the methods like a genome analysis and transcriptome analysis can be performed in order to answer additional questions like what mutation contributes to the stress tolerant evolution?

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Genetics

Evolution

Evolutionary History

SCIENTISTS IN ACTION

Design and Use of a Low Cost, Automated Morbidostat for Adaptive Evolution of Bacteria Under Antibiotic Drug Selection

עיצוב ושימוש בעלות נמוכה, אוטומטי Morbidostat עבור Adaptive אבולוציה מהירה של חיידקים תחת אנטיביוטי והתרופות בחירה

We describe a low cost, configurable morbidostat for characterizing the evolutionary pathway of antibiotic resistance. The morbidostat is a bacterial ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-מתווכת אינטגרציה יישוב In Vivo באמצעות אסטרטגיה מבוסס על הצטרפות סוף בתיווך הומולוגיה

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

Testing the Role of Multicopy Plasmids in the Evolution of Antibiotic Resistance

בוחן את התפקיד של פלסמידים Multicopy באבולוציה של עמידות לאנטיביוטיקה

Multicopy plasmids are extremely abundant in prokaryotes but their role in bacterial evolution remains poorly understood. We recently showed that the ...

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

מעקב ברמת הגנום של שגיאות תיעתוק היצורים האיקריוטים

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...

High-Resolution Comparison of Bacterial Conjugation Frequencies

השוואה ברזולוציה גבוהה של תדרים קוניוגציה

Bacterial conjugation is an important step in the horizontal transfer of antibiotic resistance genes via a conjugative DNA element. In-depth comparisons ...

Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes

Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes

הפקת ג'ין מחיקות ב- Escherichia coli מאת P1 התמרה חושית עם קלטות עמידות לאנטיביוטיקה ניתן לניתוח

A first approach to study the function of an unknown gene in bacteria is to create a knock-out of this gene. Here, we describe a robust and fast protocol ...

qKAT: Quantitative Semi-automated Typing of Killer-cell Immunoglobulin-like Receptor Genes

qKAT: Semi-automated כמותיים הקלדה של הרוצח-תא גנים קולטני דמוי נוגדן

Killer cell immunoglobulin-like receptors (KIRs) are a set of inhibitory and activating immune receptors, on natural killer (NK) and T cells, encoded by a ...

Using Sniper-Cas9 to Minimize Off-target Effects of CRISPR-Cas9 Without the Loss of On-target Activity Via Directed Evolution

באמצעות צלף-Cas9 כדי למזער את ההשפעות את המטרה של CRISPR-Cas9 ללא אובדן פעילות--היעד באמצעות אבולוציה מכוונת

The development of clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-associated protein 9 (Cas9) into therapeutic modalities requires the ...

A FACS-based Protocol to Isolate RNA from the Secondary Cells of Drosophila Male Accessory Glands

A FACS-based Protocol to Isolate RNA from the Secondary Cells of Drosophila Male Accessory Glands

פרוטוקול מבוסס FACS כדי לבודד RNA מן התאים המשניים של דרוזוהילה בלוטות אביזר זכר

To understand the function of an organ, it is often useful to understand the role of its constituent cell populations. Unfortunately, the rarity of ...

A New Toolkit for Evaluating Gene Functions using Conditional Cas9 Stabilization

ערכת כלים חדשה להערכת פונקציות גנים באמצעות ייצוב מותנה של Cas9

The clustered regularly interspaced short palindromic repeat- (CRISPR-) associated protein 9 (CRISPR/Cas9) technology has become a prevalent laboratory ...