Name: procedure for adaptive laboratory evolution of microorganisms using a chemostat
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00
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This study was financially supported by the Korean Ministry of Science, ICT and Future Planning (Intelligent Synthetic Biology Center program 2012M3A6A8054887). P. Kim was supported by a fellowship from the Catholic University of Korea (2015).

1. उपकरण तैयारी <ol><li> एक chemostat जार (150-250 मिलीलीटर) या एक Erlenmeyer कुप्पी (250 मिलीलीटर) एक इनलेट बंदरगाह से युक्त और एक दुकान के बंदरगाह प्राप्त करते हैं। सिलिकॉन टयूबिंग 10-100 मिलीग्राम / घंटा के प्रवाह दरों के लिए अन?...

<ol>
	<li>Rando, O. J., Verstrepen, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Timescales+of+genetic+and+epigenetic+inheritance.">Timescales of genetic and epigenetic inheritance.</a> Cell. 128, 655-668 (2007).</li><li>Kim, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+differential+adaptation+to+anaerobic+stress+via+genomic+mutations+by+Escherichia+coli+strains+K-12+and+B+lacking+alcohol+dehydrogenase.">Short-term differential adaptation to anaerobic stress via genomic mutations by Escherichia coli strains K-12 and B lacking alcohol dehydrogenase.</a> Front Microbiol. 5, 476 (2014).</li><li>Mendizabal, I., Keller, T. E., Zeng, J., Yi, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetics+and+evolution.">Epigenetics and evolution.</a> Integr Comp Biol. 54, 31-42 (2014).</li><li>Lee, J. Y., Seo, J., Kim, E. S., Lee, H. S., Kim, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+evolution+of+Corynebacterium+glutamicum+resistant+to+oxidative+stress+and+its+global+gene+expression+profiling.">Adaptive evolution of Corynebacterium glutamicum resistant to oxidative stress and its global gene expression profiling.</a> Biotechnol Lett. 35, 709-717 (2013).</li><li>Lee, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+oxidative+stress-tolerant+Corynebacterium+glutamicum.">Artificial oxidative stress-tolerant Corynebacterium glutamicum.</a> AMB Express. 4, 15 (2014).</li><li>Narang, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+steady+states+of+microbial+growth+on+mixtures+of+substitutable+substrates+in+a+chemostat.">The steady states of microbial growth on mixtures of substitutable substrates in a chemostat.</a> J Theor Biol. 190, 241-261 (1998).</li><li>Kwon, Y. D., Kim, S., Lee, S. Y., Kim, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+continuous+adaptation+of+Escherichia+coli+to+high+succinate+stress+and+transcriptome+analysis+of+the+tolerant+strain.">Long-term continuous adaptation of Escherichia coli to high succinate stress and transcriptome analysis of the tolerant strain.</a> J Biosci Bioeng. 111, 26-30 (2011).</li><li>Barrick, J. E., Lenski, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+dynamics+during+experimental+evolution.">Genome dynamics during experimental evolution.</a> Nat Rev Genet. 14, 827-839 (2013).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sequence+Alignment/Map+format+and+SAMtools.">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25, 2078-2079 (2009).</li><li>McKenna, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Genome+Analysis+Toolkit:+a+MapReduce+framework+for+analyzing+next-generation+DNA+sequencing+data.">The Genome Analysis Toolkit: a MapReduce framework for analyzing next-generation DNA sequencing data.</a> Genome Res. 20, 1297-1303 (2010).</li><li>Deatherage, D. E., Barrick, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+mutations+in+laboratory-evolved+microbes+from+next-generation+sequencing+data+using+breseq.">Identification of mutations in laboratory-evolved microbes from next-generation sequencing data using breseq.</a> Methods Mol Biol. 1151, 165-188 (2014).</li></ol>

सूक्ष्मजीवों उनके तेजी से विकास दर और आनुवंशिक विविधता की वजह से लगभग सभी प्रकार के वातावरण के अनुकूल ढालने में सक्षम हैं। अनुकूली प्रयोगशाला विकास के लिए बनाया गया परिस्थितियों, जो व्यक्ति सहज म्यू?...

सूक्ष्मजीवों को जीवित और विविध वातावरण के लिए अनुकूलित कर सकते हैं। गंभीर तनाव के तहत, अनुकूलन यादृच्छिक जीनोमिक म्यूटेशन और बाद में सकारात्मक चयन 1-3 से फायदेमंद phenotypes के अधिग्रहण के माध्यम से हो सकता है। इसलिए, माइक्रोबियल कोशिकाओं इष्टतम विकास है, जो कहा जाता है &quot;अनुकूली विकास के लिए&quot; चयापचय या नियामक नेटवर्क बदलकर अनुकूलन कर सकते हैं। ऐसे सुपेर्बुग्स के फैलने और मजबूत माइक्रोबियल उपभेदों की घटना के रूप में हाल ही में महत्वपूर्ण माइक्रोबियल प्रवृत्तियों, बहुत बारीकी से तनावपूर्ण परिस्थितियों में विकास अनुकूली से संबंधित हैं। परिभाषित प्रयोगशाला परिस्थितियों के तहत हम आणविक विकास के तंत्र का अध्ययन करने के लिए और यहां तक ​​कि विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए माइक्रोबियल विकास की दिशा को नियंत्रित कर सकते हैं। बहुकोशिकीय जीव के विपरीत, एक कोशिकीय जीवों में अच्छी तरह से निम्नलिखित कारणों के लिए अनुकूली प्रयोगशाला विकास (शराब) के लिए अनुकूल हैं: वे जल्दी से पुनर्जीवित, वे बड़ी आबादी को बनाए रखने, और इसे बनाने और hom बनाए रखने के लिए आसान हैogeneous वातावरण। डीएनए अनुक्रमण तकनीक और उच्च throughput प्रौद्योगिकियों में हाल के अग्रिमों के साथ संयुक्त, शराब जीनोमिक परिवर्तन है कि प्रणालीगत विनियामक परिवर्तन करने के लिए नेतृत्व के प्रत्यक्ष अवलोकन के लिए अनुमति देता है। Mutational गतिशीलता और जनसंख्या की विविधता भी प्रत्यक्ष कर रहे हैं। जेनेटिक इंजीनियरिंग रणनीतियों शराब उपभेदों 4,5 के विश्लेषण से निर्धारित किया जा सकता है। Chemostat संस्कृति स्थिर राज्य कोशिकाओं को प्राप्त और किण्वन प्रक्रिया 6 में उत्पादकता बढ़ाने के लिए इस्तेमाल एक विधि है। ताजा माध्यम से जोड़ा जाता है और संस्कृति शोरबा प्रक्रिया (उत्तरार्द्ध मध्यम और बायोमास भी शामिल है) के दौरान काटा जाता है। लंबे समय तक chemostat संस्कृति, तथापि, संस्कृति के स्थिर राज्य उत्पादकता में परिवर्तन और संस्कृति (चित्रा 1 ए) के दौरान सहज म्यूटेशन और चयन के संचय के बारे में लाता है। विभिन्न चयन दबावों (तनाव) के तहत परिवर्तन के संचय बढ़ाया है। एक लंबी अवधि में तनाव का एक क्रमिक वृद्धि<html> chemostat म्यूटेशन, जैसे तापमान, पीएच, आसमाटिक दबाव, पोषक तत्व भुखमरी, ऑक्सीकरण, विषाक्त अंत उत्पादों, आदि कॉलोनी हस्तांतरण एक तरल माध्यम से एक ठोस मध्यम और धारावाहिक हस्तांतरण (दोहराया से उस के रूप में दी तनाव के खिलाफ काम की एक सतत चयन के लिए प्रदान करता है बैच संस्कृति) भी शोधकर्ताओं ने विकसित सूक्ष्मजीवों (चित्रा 1 बी और 1 सी) प्राप्त करने के लिए अनुमति देते हैं। हालांकि chemostat संस्कृति जटिल तरीकों की आवश्यकता है, विविधता के पूल (अनुकरण और जनसंख्या के आकार की संख्या) कॉलोनी हस्तांतरण और सीरियल हस्तांतरण तकनीक के द्वारा प्राप्त की तुलना में अधिक है। व्यक्ति की कोशिकाओं को स्थिर तनाव जोखिम और chemostat संस्कृति (स्थिर राज्य) बैच संस्कृति आधारित तकनीकों की तुलना में शराब के अन्य लाभ कर रहे हैं के दौरान सेलुलर राज्य में बदलाव की कमी हुई। कोलाई उच्च succinate शर्तों के अधीन की तनाव प्रेरित शराब इस लेख में पेश किया है। Iles / ftp_upload / 54446 / 54446fig1.jpg &quot;/&gt; चित्रा 1: अनुकूली प्रयोगशाला विकास के तरीके (ए) Chemostat;। (बी) के सीरियल अंतरण; (सी) कॉलोनी हस्तांतरण। शीर्ष आंकड़े शराब के लिए तरीकों की अवधारणा को वर्णन है, और नीचे आंकड़े कोशिकाओं है कि शराब के दौरान हुई की संख्या को दर्शाते हैं। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54446/54446fig1large.jpg" target="_blank">यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Mini-chemostat fermentor</td>
			<td style="width:71px;">Biotron Inc.</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:167px;">manufactured by special order</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">silicon tubing</td>
			<td style="width:71px;">Cole-Parmer</td>
			<td style="width:119px;">Masterflex L/S 13</td>
			<td>tubing size can be varied depending on the dilution rate and the size of fermentor jar.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">reservoir jar</td>
			<td style="width:71px;">Bellco</td>
			<td style="width:119px;">Media storage bottle&#160;</td>
			<td>20 L</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">chemicals</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td>reagent grade</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">glucose</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G5767</td>
			<td>ACS reagent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">NH4Cl</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A9434</td>
			<td>for molecular biology, suitable for cell culture, &#8805;99.5%</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">NaCl</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">746398</td>
			<td>ACS reagent, &#8805;99%</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Na2HPO4&#183;2H2O</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4272</td>
			<td>98.5-101%</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">KH2PO4&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">795488</td>
			<td>ACS reagent, &#8805;99%</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">MgSO4&#183;7H2O</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">230391</td>
			<td>ACS reagent, &#8805;98%</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">CaCl2</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">793639</td>
			<td>ACS reagent, &#8805;96%</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">thiamine&#183;HCl&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T4625</td>
			<td>reagent grade, &#8805;99%</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Na2&#183;succinate&#183;6H2O</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S2378</td>
			<td>ReagentPlus, &#8805;99%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

procedure for adaptive laboratory evolution of microorganisms using a chemostat

Natural evolution involves genetic diversity such as environmental change and a selection between small populations. Adaptive laboratory evolution (ALE) refers to the experimental situation in which evolution is observed using living organisms under controlled conditions and stressors; organisms are thereby artificially forced to make evolutionary changes. Microorganisms are subject to a variety of stressors in the environment and are capable of regulating certain stress-inducible proteins to increase their chances of survival. Naturally occurring spontaneous mutations bring about changes in a microorganism's genome that affect its chances of survival. Long-term exposure to chemostat culture provokes an accumulation of spontaneous mutations and renders the most adaptable strain dominant. Compared to the colony transfer and serial transfer methods, chemostat culture entails the highest number of cell divisions and, therefore, the highest number of diverse populations. Although chemostat culture for ALE requires more complicated culture devices, it is less labor intensive once the operation begins. Comparative genomic and transcriptome analyses of the adapted strain provide evolutionary clues as to how the stressors contribute to mutations that overcome the stress. The goal of the current paper is to bring about accelerated evolution of microorganisms under controlled laboratory conditions.

उच्च succinate तनाव अनुकूलन के लिए, जंगली प्रकार के ई कोलाई W3110 तनाव डी में एक chemostat में सुसंस्कृत था = 0.1 मानव संसाधन -1 270 दिनों के लिए (चित्रा 2)। <img alt="चित्र 2" src="/files/ftp_upload/54446/54446fig2.jpg" /> <stro...

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Procedure for Adaptive Laboratory Evolution of Microorganisms Using a Chemostat

यहाँ, हम chemostat संस्कृति का उपयोग की शर्तों के तहत सूक्ष्मजीवों के अनुकूली प्रयोगशाला विकास प्राप्त करने के लिए एक प्रोटोकॉल उपस्थित थे। इसके अलावा, विकसित तनाव के जीनोमिक विश्लेषण चर्चा की है।

सूक्ष्मजीवों के अनुकूली प्रयोगशाला विकास के लिए प्रक्रिया एक Chemostat का प्रयोग

Natural evolution involves genetic diversity such as environmental change and a selection between small populations. Adaptive laboratory evolution (ALE) ...

The overall goal of this procedure is to enable a microorganism to evolve in laboratory conditions. This method can help answer key questions in the microbiology field, such as adrenal function relationships, stress responses, metabolic engineering, and of course, evolution. The main advantage of this technique is continuous selection of the most suaded descendant under specific laboratory conditions.Begin this procedure with the preparation of equipment, as well as initial medium, stress medium and high stress medium, as described in the text protocol. Inoculate a single colony or wild type E.coli in a 15-milliliter test tube containing four milliliters of initial medium. Incubate the test tube in a shaking incubator for 12 hours at 37 degrees celsius and 220 rpm.Incubate the chemostat jar providing for aeration and agitation at 37 degrees celsius for six hours. Following the incubation, aseptically connect the end of the silicon tubing from the pumps to the chemostat jar. Aseptically transfer one milliliter of pre-culture to the chemostat jar.Start the outlet pump and collect the culture in the exponential phase. Check the optical density at 600 nanometers of the culture from the outlet tubing. Then, start the inlet pump.Check the optical density of the culture at 600 nanometers from the outlet tubing every 24 hours. After operating the chemostat for 96 hours, which is a 9.6 full turnover, exchange the reservoir to the lowest concentration of high stress medium. When you exchange the reservoir to a higher stress medium, the cells may be shocked.If the cell density is too low, stop feeding the higher stress medium for some time to restore the cell density. If the optical density is lower than 0.2, stop the feeding inlet pump for six hours. Restart the inlet pump and check that the optical density is over 0.2.Gradually increase the concentration of the stressor by incrementally changing to a reservoir containing a higher stressor concentration. Take samples of the adapted culture whenever it reaches a stressor adaptation milestone and store for further genomic analysis. For sample storage, mix the 0.5 milliliter culture sample with 0.5 milliliters of a sterilized 80%glycerol solution and store it at 80 degrees celsius.Prepare 1.6%ager plate medium containing the same stressor at the same concentration as in the medium. Plate 0.1 milliliters of the outlet culture from the chemostat and incubate at 37 degrees celsius for 16 hours. Following incubation, pick single colonies from the plate using a sterile toothpick and inoculate them in 15 milliliter test tubes containing the same stressor and at the same medium concentration as in the chemostat.Incubate for six hours. Transfer one milliliter of the culture broth into a 250 milliliter erlenmeyer flask containing 50 milliliters of medium. Harvest 0.5 milliliters of the culture broth every hour and measure the optical density at 600 nanometers.Compare the growth rate of the adapted strain to that of the wild type strain given the stressor. The wild type E.coli strain was evolved in a high succinate stressed condition for 270 days, which corresponds to nearly 930 generations. Whenever higher succinate stress was added, the biomass concentration was immediately lowered and then restored.Shown here is a schematic diagram of the chemostat with a mutant that is tolerant against the high succinate stress. Most wild type cells are washed out under the stress conditions and the mutant grows more. Eventually, the population of the mutant descendant is increased.The second and third mutations are continuously selected for and eventually dominate the chemostat. This figure shows that the adapted strain grew without delay under high succinate stressed conditions, while the wild type strain did not. A similar strategy can be applied to adaptive laboratory evolution using a chemostat with a variation of stressors.After watching this video, you should have a good understanding of how to acquire and evolve the microorganism under a specified condition. Once mastered, this technique can be done in a couple of month. While attempting this procedure, it's important to remember not to wash out chemostat cells by adding too much stress at once and remember to check the optical density every day.Following this procedure are the methods like a genome analysis and transcriptome analysis can be performed in order to answer additional questions like what mutation contributes to the stress tolerant evolution?

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