Name: procedure for adaptive laboratory evolution of microorganisms using a chemostat
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Procedure for Adaptive Laboratory Evolution of Microorganisms Using a Chemostat at JoVE.com

This study was financially supported by the Korean Ministry of Science, ICT and Future Planning (Intelligent Synthetic Biology Center program 2012M3A6A8054887). P. Kim was supported by a fellowship from the Catholic University of Korea (2015).

1. Подготовка оборудования <ol><li> Получить хемостате банку (150-250 мл) или колбы Эрленмейера (250 мл), содержащей входное отверстие и выходное отверстие. Соедините порты с кремнием трубки позволяет скорости потока 10-100 мл / ч. Необязательно использовать вентиляционное отверстие, выпускно?...

<ol>
	<li>Rando, O. J., Verstrepen, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Timescales+of+genetic+and+epigenetic+inheritance.">Timescales of genetic and epigenetic inheritance.</a> Cell. 128, 655-668 (2007).</li><li>Kim, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+differential+adaptation+to+anaerobic+stress+via+genomic+mutations+by+Escherichia+coli+strains+K-12+and+B+lacking+alcohol+dehydrogenase.">Short-term differential adaptation to anaerobic stress via genomic mutations by Escherichia coli strains K-12 and B lacking alcohol dehydrogenase.</a> Front Microbiol. 5, 476 (2014).</li><li>Mendizabal, I., Keller, T. E., Zeng, J., Yi, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetics+and+evolution.">Epigenetics and evolution.</a> Integr Comp Biol. 54, 31-42 (2014).</li><li>Lee, J. Y., Seo, J., Kim, E. S., Lee, H. S., Kim, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+evolution+of+Corynebacterium+glutamicum+resistant+to+oxidative+stress+and+its+global+gene+expression+profiling.">Adaptive evolution of Corynebacterium glutamicum resistant to oxidative stress and its global gene expression profiling.</a> Biotechnol Lett. 35, 709-717 (2013).</li><li>Lee, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+oxidative+stress-tolerant+Corynebacterium+glutamicum.">Artificial oxidative stress-tolerant Corynebacterium glutamicum.</a> AMB Express. 4, 15 (2014).</li><li>Narang, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+steady+states+of+microbial+growth+on+mixtures+of+substitutable+substrates+in+a+chemostat.">The steady states of microbial growth on mixtures of substitutable substrates in a chemostat.</a> J Theor Biol. 190, 241-261 (1998).</li><li>Kwon, Y. D., Kim, S., Lee, S. Y., Kim, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+continuous+adaptation+of+Escherichia+coli+to+high+succinate+stress+and+transcriptome+analysis+of+the+tolerant+strain.">Long-term continuous adaptation of Escherichia coli to high succinate stress and transcriptome analysis of the tolerant strain.</a> J Biosci Bioeng. 111, 26-30 (2011).</li><li>Barrick, J. E., Lenski, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+dynamics+during+experimental+evolution.">Genome dynamics during experimental evolution.</a> Nat Rev Genet. 14, 827-839 (2013).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sequence+Alignment/Map+format+and+SAMtools.">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25, 2078-2079 (2009).</li><li>McKenna, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Genome+Analysis+Toolkit:+a+MapReduce+framework+for+analyzing+next-generation+DNA+sequencing+data.">The Genome Analysis Toolkit: a MapReduce framework for analyzing next-generation DNA sequencing data.</a> Genome Res. 20, 1297-1303 (2010).</li><li>Deatherage, D. E., Barrick, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+mutations+in+laboratory-evolved+microbes+from+next-generation+sequencing+data+using+breseq.">Identification of mutations in laboratory-evolved microbes from next-generation sequencing data using breseq.</a> Methods Mol Biol. 1151, 165-188 (2014).</li></ol>

Микроорганизмы способны адаптироваться к практически во всех средах из-за их быстрого темпа роста и генетического разнообразия. Эволюция Адаптивная лаборатория позволяет микроорганизмы развиваться при условиях, разработанных, что обеспечивает способ выбора отдельных организмов, у?...

Микроорганизмы могут выжить и адаптироваться к различных средах. Под сильным стрессом, адаптация может происходить путем приобретения полезных фенотипов случайными геномных мутаций и последующего положительного отбора 1-3. Таким образом, микробные клетки могут адаптироваться путем изменения метаболических или регуляторных сетей для оптимального роста, которая называется &quot;адаптивная эволюция&quot;. Последние важные микробные тенденции, такие как вспышки суперошибок и появления устойчивых штаммов микроорганизмов, которые очень тесно связаны с адаптивной эволюции в стрессовых условиях. В соответствии с определенными в лабораторных условиях, мы можем изучить механизмы молекулярной эволюции и даже контролировать направление эволюции микробов для различных областей применения. В отличие от многоклеточных организмов, одноклеточные организмы хорошо подходят для адаптивной лабораторной эволюции (ALE) по следующим причинам: они быстро регенерируют, они поддерживают большие группы населения, а также легко создавать и поддерживать Homogeneous среды. В сочетании с последними достижениями в области методов секвенирования ДНК и высокопроизводительных технологий, ALE позволяет непосредственное наблюдение за геномных изменений, которые приводят к системным регуляторных изменений. Мутационные динамика и разнообразие населения также наблюдается. Генная инженерия стратегии могут быть определены из анализа ALE штаммов 4,5. Хемостатическую культура представляет собой метод , используемый для получения устойчивого состояния клеток и увеличение производительности в бродильных процессов 6. добавляют свежую среду и культуральный бульон собирают во время процесса (последняя включает в себя среду и биомассы). Долгосрочный хемостатическую культура, однако, изменяет стационарную продуктивности культуры и приводит к накоплению спонтанных мутаций и отбора в процессе культивирования (рис 1а). При различных давлениях отбора (стрессоров), накопление мутаций усиливается. Постепенное увеличение стресса в долгосрочной перспективе<html> хемостатическую предусматривает непрерывный отбор мутаций , которые работают против заданных факторов стресса, таких как температура, рН, осмотическое давление, питательного голодания, окисления, токсичных конечных продуктов и т.д. передачи колонии от твердой среды и последовательной передачи из жидкой среды ( с повтором партия культуры) также позволяют исследователям получить эволюционировали микроорганизмы (рис 1б и 1в). Хотя хемостатическую культура требует сложных методов, пул разнообразия (количество репликаций и численности населения) выше, чем полученная путем переноса колоний и последовательные методы переноса. Стабильная воздействие стресса на отдельные клетки и снижение изменения в клеточном состоянии во время хемостатной культуры (устойчивое состояние) и другие преимущества эля по сравнению с методами культивирования на основе партий. Стресс-индуцированной ALE кишечной палочки , подвергнутой воздействию высоких янтарной условий вводится в этой статье. Iles / ftp_upload / 54446 / 54446fig1.jpg &quot;/&gt; Рисунок 1: Методы лабораторной эволюции адаптивной (А) хемостатическую;. (B) последовательный перевод; (C) перенос колонии. Верхние цифры иллюстрируют концепцию методов ALE, а нижние рисунки иллюстрируют количество клеток, выросших во время ALE. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54446/54446fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54446/54446fig1large.jpg" target="_blank">нажмите здесь</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54446/54446fig1large.jpg" target="_blank">чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Mini-chemostat fermentor</td>
			<td style="width:71px;">Biotron Inc.</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:167px;">manufactured by special order</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">silicon tubing</td>
			<td style="width:71px;">Cole-Parmer</td>
			<td style="width:119px;">Masterflex L/S 13</td>
			<td>tubing size can be varied depending on the dilution rate and the size of fermentor jar.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">reservoir jar</td>
			<td style="width:71px;">Bellco</td>
			<td style="width:119px;">Media storage bottle&#160;</td>
			<td>20 L</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">chemicals</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td>reagent grade</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">glucose</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G5767</td>
			<td>ACS reagent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">NH4Cl</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A9434</td>
			<td>for molecular biology, suitable for cell culture, &#8805;99.5%</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">NaCl</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">746398</td>
			<td>ACS reagent, &#8805;99%</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Na2HPO4&#183;2H2O</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4272</td>
			<td>98.5-101%</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">KH2PO4&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">795488</td>
			<td>ACS reagent, &#8805;99%</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">MgSO4&#183;7H2O</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">230391</td>
			<td>ACS reagent, &#8805;98%</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">CaCl2</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">793639</td>
			<td>ACS reagent, &#8805;96%</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">thiamine&#183;HCl&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T4625</td>
			<td>reagent grade, &#8805;99%</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Na2&#183;succinate&#183;6H2O</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S2378</td>
			<td>ReagentPlus, &#8805;99%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

procedure for adaptive laboratory evolution of microorganisms using a chemostat

Natural evolution involves genetic diversity such as environmental change and a selection between small populations. Adaptive laboratory evolution (ALE) refers to the experimental situation in which evolution is observed using living organisms under controlled conditions and stressors; organisms are thereby artificially forced to make evolutionary changes. Microorganisms are subject to a variety of stressors in the environment and are capable of regulating certain stress-inducible proteins to increase their chances of survival. Naturally occurring spontaneous mutations bring about changes in a microorganism's genome that affect its chances of survival. Long-term exposure to chemostat culture provokes an accumulation of spontaneous mutations and renders the most adaptable strain dominant. Compared to the colony transfer and serial transfer methods, chemostat culture entails the highest number of cell divisions and, therefore, the highest number of diverse populations. Although chemostat culture for ALE requires more complicated culture devices, it is less labor intensive once the operation begins. Comparative genomic and transcriptome analyses of the adapted strain provide evolutionary clues as to how the stressors contribute to mutations that overcome the stress. The goal of the current paper is to bring about accelerated evolution of microorganisms under controlled laboratory conditions.

Для адаптации напряжения высокой сукцинат, дикого типа E. палочка W3110 штамм культивировали в хемостате при D = 0,1 ч -1 в течение 270 дней (Рисунок 2). <img alt="фигура 2" src="/files/ftp_upload/54446/54446fig2.jpg" /> Рисунок 2: High-сукцинат адаптация напряжения ...

Watch this Scientific Journal Video about Procedure for Adaptive Laboratory Evolution of Microorganisms Using a Chemostat at JoVE.com

Procedure for Adaptive Laboratory Evolution of Microorganisms Using a Chemostat

Здесь мы приводим протокол для получения адаптивной лабораторной эволюции микроорганизмов в условиях с использованием хемостате культуры. Кроме того, геномный анализ выделившегося штамма обсуждается.

Методика адаптивной лабораторной эволюции микроорганизмов с использованием хемостатическую

Natural evolution involves genetic diversity such as environmental change and a selection between small populations. Adaptive laboratory evolution (ALE) ...

The overall goal of this procedure is to enable a microorganism to evolve in laboratory conditions. This method can help answer key questions in the microbiology field, such as adrenal function relationships, stress responses, metabolic engineering, and of course, evolution. The main advantage of this technique is continuous selection of the most suaded descendant under specific laboratory conditions.Begin this procedure with the preparation of equipment, as well as initial medium, stress medium and high stress medium, as described in the text protocol. Inoculate a single colony or wild type E.coli in a 15-milliliter test tube containing four milliliters of initial medium. Incubate the test tube in a shaking incubator for 12 hours at 37 degrees celsius and 220 rpm.Incubate the chemostat jar providing for aeration and agitation at 37 degrees celsius for six hours. Following the incubation, aseptically connect the end of the silicon tubing from the pumps to the chemostat jar. Aseptically transfer one milliliter of pre-culture to the chemostat jar.Start the outlet pump and collect the culture in the exponential phase. Check the optical density at 600 nanometers of the culture from the outlet tubing. Then, start the inlet pump.Check the optical density of the culture at 600 nanometers from the outlet tubing every 24 hours. After operating the chemostat for 96 hours, which is a 9.6 full turnover, exchange the reservoir to the lowest concentration of high stress medium. When you exchange the reservoir to a higher stress medium, the cells may be shocked.If the cell density is too low, stop feeding the higher stress medium for some time to restore the cell density. If the optical density is lower than 0.2, stop the feeding inlet pump for six hours. Restart the inlet pump and check that the optical density is over 0.2.Gradually increase the concentration of the stressor by incrementally changing to a reservoir containing a higher stressor concentration. Take samples of the adapted culture whenever it reaches a stressor adaptation milestone and store for further genomic analysis. For sample storage, mix the 0.5 milliliter culture sample with 0.5 milliliters of a sterilized 80%glycerol solution and store it at 80 degrees celsius.Prepare 1.6%ager plate medium containing the same stressor at the same concentration as in the medium. Plate 0.1 milliliters of the outlet culture from the chemostat and incubate at 37 degrees celsius for 16 hours. Following incubation, pick single colonies from the plate using a sterile toothpick and inoculate them in 15 milliliter test tubes containing the same stressor and at the same medium concentration as in the chemostat.Incubate for six hours. Transfer one milliliter of the culture broth into a 250 milliliter erlenmeyer flask containing 50 milliliters of medium. Harvest 0.5 milliliters of the culture broth every hour and measure the optical density at 600 nanometers.Compare the growth rate of the adapted strain to that of the wild type strain given the stressor. The wild type E.coli strain was evolved in a high succinate stressed condition for 270 days, which corresponds to nearly 930 generations. Whenever higher succinate stress was added, the biomass concentration was immediately lowered and then restored.Shown here is a schematic diagram of the chemostat with a mutant that is tolerant against the high succinate stress. Most wild type cells are washed out under the stress conditions and the mutant grows more. Eventually, the population of the mutant descendant is increased.The second and third mutations are continuously selected for and eventually dominate the chemostat. This figure shows that the adapted strain grew without delay under high succinate stressed conditions, while the wild type strain did not. A similar strategy can be applied to adaptive laboratory evolution using a chemostat with a variation of stressors.After watching this video, you should have a good understanding of how to acquire and evolve the microorganism under a specified condition. Once mastered, this technique can be done in a couple of month. While attempting this procedure, it's important to remember not to wash out chemostat cells by adding too much stress at once and remember to check the optical density every day.Following this procedure are the methods like a genome analysis and transcriptome analysis can be performed in order to answer additional questions like what mutation contributes to the stress tolerant evolution?

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Genetics

Evolution

Evolutionary History

SCIENTISTS IN ACTION

Design and Use of a Low Cost, Automated Morbidostat for Adaptive Evolution of Bacteria Under Antibiotic Drug Selection

Конструкция и использование низкой стоимости, Автоматизированная Morbidostat для адаптивной эволюции бактерий в Антибиотик Выбор лекарственных средств

We describe a low cost, configurable morbidostat for characterizing the evolutionary pathway of antibiotic resistance. The morbidostat is a bacterial ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

ТРИФОСФАТЫ/Cas9-опосредованной целенаправленной интеграции в естественных условиях с помощью стратегию на основе присоединения гомологии опосредованной конец

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

Testing the Role of Multicopy Plasmids in the Evolution of Antibiotic Resistance

Проверка роли применим плазмид в эволюции антибиотикорезистентности

Multicopy plasmids are extremely abundant in prokaryotes but their role in bacterial evolution remains poorly understood. We recently showed that the ...

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

Геном широкий наблюдения ошибок транскрипции в эукариотических организмов

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...

High-Resolution Comparison of Bacterial Conjugation Frequencies

Высоким разрешением сравнение частот бактериальных спряжение

Bacterial conjugation is an important step in the horizontal transfer of antibiotic resistance genes via a conjugative DNA element. In-depth comparisons ...

Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes

Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes

Производство гена удалений в Escherichia coli , P1 трансдукция с подакцизных антибиотикорезистентности кассеты

A first approach to study the function of an unknown gene in bacteria is to create a knock-out of this gene. Here, we describe a robust and fast protocol ...

qKAT: Quantitative Semi-automated Typing of Killer-cell Immunoglobulin-like Receptor Genes

qKAT: количественные Semi-automated типирование убийца клетки генов иммуноглобулинов подобных рецепторов

Killer cell immunoglobulin-like receptors (KIRs) are a set of inhibitory and activating immune receptors, on natural killer (NK) and T cells, encoded by a ...

Using Sniper-Cas9 to Minimize Off-target Effects of CRISPR-Cas9 Without the Loss of On-target Activity Via Directed Evolution

С помощью снайпера Cas9 для сведения к минимуму последствий пробить ТРИФОСФАТЫ Cas9 без потери на цель деятельности через направленной эволюции

The development of clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-associated protein 9 (Cas9) into therapeutic modalities requires the ...

A FACS-based Protocol to Isolate RNA from the Secondary Cells of Drosophila Male Accessory Glands

A FACS-based Protocol to Isolate RNA from the Secondary Cells of Drosophila Male Accessory Glands

Протокол на основе FACS для изоляции РНК из вторичных клеток Дрозофилы Мужской Аксессуар Glands

To understand the function of an organ, it is often useful to understand the role of its constituent cell populations. Unfortunately, the rarity of ...

A New Toolkit for Evaluating Gene Functions using Conditional Cas9 Stabilization

Новый инструментарий для оценки функций генов с использованием условной стабилизации Cas9

The clustered regularly interspaced short palindromic repeat- (CRISPR-) associated protein 9 (CRISPR/Cas9) technology has become a prevalent laboratory ...