Name: creation and transplantation of an adipose-derived stem cell (asc) sheet in a diabetic wound-healing model
Uploaded: 2017-08-04T12:30:00
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著者は、実用的なアドバイスを提供するため医学部形成外科、再建外科、順天堂大学医学部の博士占部をありがとうございます。糖尿病センターの東京女子医科大学医学部優れたテクニカル サポートのための村田英一氏も感謝いたします。本研究は、教育省、文化、スポーツ、科学、技術 (文部科学省) 日本から開発途上技術革新システム「細胞シート組織工学センター (CSTEC)」のプロジェクトの学際的研究領域プログラムを高度なイノベーション センターの作成によって支えられました。

All experimental protocols presented below were approved by the Animal Welfare Committee of Tokyo Women&#39;s Medical University School of Medicine and abided by all requirements of the Guidelines for Proper Conduct of Animal Experiments.
1. Preparation of Animals, Instruments, Culture Media, and Dishes
<ol>
	<li>Prepare complete culture medium using minimum essential medium alpha containing 20% fetal bovine serum (FBS) and 1% penicillin/streptomycin. Store this for several months at 4 &#176...

<ol>
	<li>Boulton, A. J., Vileikyte, L., Ragnarson-Tennvall, G., Apelqvist, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+global+burden+of+diabetic+foot+disease.">The global burden of diabetic foot disease.</a> Lancet. 366 (9498), 1719-1724 (2005).</li><li>Zannettino, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipotential+human+adipose-derived+stromal+stem+cells+exhibit+a+perivascular+phenotype+in+vitro+and+in+vivo.">Multipotential human adipose-derived stromal stem cells exhibit a perivascular phenotype in vitro and in vivo.</a> J Cell Physiol. 214 (2), 413-421 (2008).</li><li>Kern, S., Eichler, H., Stoeve, J., Kluter, H., Bieback, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+mesenchymal+stem+cells+from+bone+marrow,+umbilical+cord+blood,+or+adipose+tissue.">Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow, umbilical cord blood, or adipose tissue.</a> Stem Cells. 24 (5), 1294-1301 (2006).</li><li>Casteilla, L., Planat-Benard, V., Laharrague, P., Cousin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose-derived+stromal+cells:+Their+identity+and+uses+in+clinical+trials,+an+update.">Adipose-derived stromal cells: Their identity and uses in clinical trials, an update.</a> World J Stem Cells. 3 (4), 25-33 (2011).</li><li>Zuk, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilineage+cells+from+human+adipose+tissue:+implications+for+cell-based+therapies.">Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies.</a> Tissue Eng. 7 (2), 211-228 (2001).</li><li>Zuk, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The ASC: Critical Participants in Paracrine-Mediated Tissue Health and Function. , (2013).</li><li>Nie, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locally+administered+adipose-derived+stem+cells+accelerate+wound+healing+through+differentiation+and+vasculogenesis.">Locally administered adipose-derived stem cells accelerate wound healing through differentiation and vasculogenesis.</a> Cell Transplant. 20 (2), 205-216 (2011).</li><li>Shin, L., Peterson, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+mesenchymal+stem+cell+grafts+enhance+normal+and+impaired+wound+healing+by+recruiting+existing+endogenous+tissue+stem/progenitor+cells.">Human mesenchymal stem cell grafts enhance normal and impaired wound healing by recruiting existing endogenous tissue stem/progenitor cells.</a> Stem Cells Transl Med. 2 (1), 33-42 (2013).</li><li>Okano, T., Yamada, N., Sakai, H., Sakurai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+recovery+system+for+cultured+cells+using+plasma-treated+polystyrene+dishes+grafted+with+poly(N-isopropylacrylamide).">A novel recovery system for cultured cells using plasma-treated polystyrene dishes grafted with poly(N-isopropylacrylamide).</a> J Biomed Mater Res. 27 (10), 1243-1251 (1993).</li><li>Yamato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermo-responsive+culture+dishes+allow+the+intact+harvest+of+multilayered+keratinocyte+sheets+without+dispase+by+reducing+temperature.">Thermo-responsive culture dishes allow the intact harvest of multilayered keratinocyte sheets without dispase by reducing temperature.</a> Tissue Eng. 7 (4), 473-480 (2001).</li><li>Sekine, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+cell+sheet+transplantation+improves+damaged+heart+function+via+superior+cell+survival+in+comparison+with+dissociated+cell+injection.">Cardiac cell sheet transplantation improves damaged heart function via superior cell survival in comparison with dissociated cell injection.</a> Tissue Engineering Part A. 17 (23-24), 2973-2980 (2011).</li><li>Kuhlmann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intramyocellular+lipid+and+insulin+resistance:+a+longitudinal+in+vivo+1H-spectroscopic+study+in+Zucker+diabetic+fatty+rats.">Intramyocellular lipid and insulin resistance: a longitudinal in vivo 1H-spectroscopic study in Zucker diabetic fatty rats.</a> Diabetes. 52 (1), 138-144 (2003).</li><li>Slavkovsky, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zucker+diabetic+fatty+rat:+a+new+model+of+impaired+cutaneous+wound+repair+with+type+II+diabetes+mellitus+and+obesity.">Zucker diabetic fatty rat: a new model of impaired cutaneous wound repair with type II diabetes mellitus and obesity.</a> Wound Repair Regen. 19 (4), 515-525 (2011).</li><li>Oltman, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progression+of+vascular+and+neural+dysfunction+in+sciatic+nerves+of+Zucker+diabetic+fatty+and+Zucker+rats.">Progression of vascular and neural dysfunction in sciatic nerves of Zucker diabetic fatty and Zucker rats.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 289 (1), E113-E122 (2005).</li><li>Coppey, L. J., Gellett, J. S., Davidson, E. P., Dunlap, J. A., Yorek, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+endoneurial+blood+flow,+motor+nerve+conduction+velocity+and+vascular+relaxation+of+epineurial+arterioles+of+the+sciatic+nerve+in+ZDF-obese+diabetic+rats.">Changes in endoneurial blood flow, motor nerve conduction velocity and vascular relaxation of epineurial arterioles of the sciatic nerve in ZDF-obese diabetic rats.</a> Diabetes Metab Res Rev. 18 (1), 49-56 (2002).</li><li>Galiano, R. D., Michaels, V., Dobryansky, M., Levine, J. P., Gurtner, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+and+reproducible+murine+model+of+excisional+wound+healing.">Quantitative and reproducible murine model of excisional wound healing.</a> Wound Repair Regen. 12 (4), 485-492 (2004).</li><li>Lin, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+multi-layer+adipose-derived+stem+cell+sheet+in+a+full-thickness+wound+healing+model.">Evaluation of a multi-layer adipose-derived stem cell sheet in a full-thickness wound healing model.</a> Acta Biomater. 9 (2), 5243-5250 (2013).</li><li>McLaughlin, M. M., Marra, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+adipose-derived+stem+cells+as+sheets+for+wound+healing.">The use of adipose-derived stem cells as sheets for wound healing.</a> Organogenesis. 9 (2), 79-81 (2013).</li><li>Cerqueira, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+adipose+stem+cells+cell+sheet+constructs+impact+epidermal+morphogenesis+in+full-thickness+excisional+wounds.">Human adipose stem cells cell sheet constructs impact epidermal morphogenesis in full-thickness excisional wounds.</a> Biomacromolecules. 14 (11), 3997-4008 (2013).</li><li>Koga, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+course+of+full-thickness+skin+defects+with+exposed+bone:+an+evaluation+by+a+quantitative+examination+of+new+blood+vessels.">Recovery course of full-thickness skin defects with exposed bone: an evaluation by a quantitative examination of new blood vessels.</a> J Surg Res. 137 (1), 30-37 (2007).</li><li>Cianfarani, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetes+impairs+adipose+tissue-derived+stem+cell+function+and+efficiency+in+promoting+wound+healing.">Diabetes impairs adipose tissue-derived stem cell function and efficiency in promoting wound healing.</a> Wound Repair Regen. 21 (4), 545-553 (2013).</li><li>Matsuda, K., Suzuki, S., Isshiki, N., Ikada, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-freeze+dried+bilayer+artificial+skin.">Re-freeze dried bilayer artificial skin.</a> Biomaterials. 14 (13), 1030-1035 (1993).</li><li>Miyahara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monolayered+mesenchymal+stem+cells+repair+scarred+myocardium+after+myocardial+infarction.">Monolayered mesenchymal stem cells repair scarred myocardium after myocardial infarction.</a> Nat Med. 12 (4), 459-465 (2006).</li><li>Iwata, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+sheet+engineering+and+its+application+for+periodontal+regeneration.">Cell sheet engineering and its application for periodontal regeneration.</a> J Tissue Eng Regen Med. , (2013).</li><li>Elloumi-Hannachi, I., Yamato, M., Okano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+sheet+engineering:+a+unique+nanotechnology+for+scaffold-free+tissue+reconstruction+with+clinical+applications+in+regenerative+medicine.">Cell sheet engineering: a unique nanotechnology for scaffold-free tissue reconstruction with clinical applications in regenerative medicine.</a> J Intern Med. 267 (1), 54-70 (2010).</li><li>Watanabe, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+modified+adipose+tissue-derived+stem/stromal+cells,+using+simian+immunodeficiency+virus-based+lentiviral+vectors,+in+the+treatment+of+hemophilia.">Genetically modified adipose tissue-derived stem/stromal cells, using simian immunodeficiency virus-based lentiviral vectors, in the treatment of hemophilia.</a> B. Hum Gene Ther. 24 (3), 283-294 (2013).</li><li>Kim, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+healing+effect+of+adipose-derived+stem+cells:+a+critical+role+of+secretory+factors+on+human+dermal+fibroblasts.">Wound healing effect of adipose-derived stem cells: a critical role of secretory factors on human dermal fibroblasts.</a> J Dermatol Sci. 48 (1), 15-24 (2007).</li><li>Nakagami, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+autologous+cell+therapy+in+ischemic+limb+disease+through+growth+factor+secretion+by+cultured+adipose+tissue-derived+stromal+cells.">Novel autologous cell therapy in ischemic limb disease through growth factor secretion by cultured adipose tissue-derived stromal cells.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 25 (12), 2542-2547 (2005).</li><li>Asahara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF+contributes+to+postnatal+neovascularization+by+mobilizing+bone+marrow-derived+endothelial+progenitor+cells.">VEGF contributes to postnatal neovascularization by mobilizing bone marrow-derived endothelial progenitor cells.</a> EMBO J. 18 (14), 3964-3972 (1999).</li><li>Kato, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allogeneic+transplantation+of+an+adipose-derived+stem+cell+(ASC)+sheet+combined+with+artificial+skin+accelerates+wound+healing+in+a+rat+wound+model+of+type+2+diabetes+and+obesity.">Allogeneic transplantation of an adipose-derived stem cell (ASC) sheet combined with artificial skin accelerates wound healing in a rat wound model of type 2 diabetes and obesity.</a> Diabetes. , db141133 (2015).</li></ol>

RASC シートを正常に培養するための最も重要な手順は次のとおりです: 1) 温度は、温度応答性培養皿上での培養中におよそ 37 ° C に保たれなければなりません。RASC シートの作成時にすべてのプロシージャを 37 ° C の熱板に行ったし、すべての試薬は自発的に料理31から切り離す細胞を防ぐために 37 ° C に加温しました。2) 受信者 ZDF ラットを監視すると、rASC シートの巧妙な?...

糖尿病患者の人口は世界的に増加しており 4 億 2015年1;糖尿病患者の約 15-25% は、下肢糖尿病性潰瘍2の進行からのリスクです。下肢糖尿病性潰瘍は難治性で、完全な回復後のリハビリ訓練の長期治療を必要とする可能性があります。頻繁に長い治療期間は、患者の生活の質の大幅な削減の結果します。したがって、糖尿病の傷の治療のために減らすか、悪化を防ぐ新たな治療法が開発されなければなりません。糖尿病創傷治癒過程を評価するため我々 は、糖尿病性潰瘍創傷治癒モデル ラットでは, 実用的な臨床的条件を模倣する、最適化し、創傷治癒促進細胞シート工学を用いた脂肪由来幹細胞 (ASC) シートを移植かどうか評価します。
間葉系間質細胞 (MSCs) は、様々 な細胞の血統3に分化する能力を彼らの免疫調節効果、自己再生能力のための創傷治癒を促進するための優れたポテンシャルを展示します。MSCs パラクリン活動4、5潜在的な血管新生を含む他のティッシュから得られる利点を展示して Asc が脂肪組織由来 MSC の一種。脂肪組織は人間の体内では、比較的豊富なでき、アクセシビリティ、低侵襲の手順を使用して、コレクションです。したがって、Asc は創傷治癒のアプリケーション6、7の実験に使用されています。
以前のレポートは、傷の周りの地域に単一細胞 MSC 懸濁液の直接注入が創傷治癒8,9を加速することが示されています。ただし、単一細胞懸濁液を注入糖尿病性潰瘍モデルにおける創傷治癒の加速のレポート、にもかかわらず、創傷部位に移植細胞の生存時間は明確ではないです。
本研究では、温度応答性培養皿を用いた細胞シート工学を適用されます。これらの料理はある温度応答性高分子Nイソプロピルアクリルアミド彼らの表面の10に共有結合です。グラフト高分子層温度制御細胞接着や培養皿の表面から剥離が可能です。皿の表面は 37 ° c、それは 32 ° C 以下の温度では親水性になったとき、細胞が自発的に表面から切り離すに対し、細胞が接着し、増殖を許可する疎水性になります。の温度を減らすことによって単にそのまま細胞間結合と細胞外マトリックス (Ecm) の連続した細胞シートとして培養細胞を収穫できます。したがって、損傷、トリプシンなどの ECM 蛋白質分解酵素は必要な11ではありません。したがって、細胞シート工学は、細胞間の接続を維持でき、細胞移植の有効性を改善することができます。
さらに、細胞シート移植細胞注入12と比較した場合の細胞生存率が増加します。このプロトコル Zucker 糖尿病脂肪 (ZDF) ラットは、創治癒遅延と 2 型糖尿病や肥満モデルとして選ばれました。ZDF ラットは、自発的に約 4 週間で肥満を開発します。彼らは、8、12 週齢、その時点で発揮する高血糖インスリン抵抗性、脂質異常症、高トリグリセリド血症13に関連付けられている間肥満と 2 型糖尿病を開発します。創傷治癒、血流の低下、末梢血管、糖尿病性腎症14,,1516観察も。また、ZDF ラット糖尿病性潰瘍などの難治性皮膚潰瘍の治癒過程を研究するための適切なモデルがあります。
人間および齧歯動物の創傷治癒のメカニズムの違いは、皮膚の解剖学的差異に関連付けられます。正常ラットの創傷治癒は、再上皮化および肉芽組織の形成に基づいて人間の創傷治癒過程に対し創収縮に基づいています。通常、傷副木齧歯動物モデルで使用される創収縮を最小限に抑え、肉芽組織17、漸進的な形成を可能が非糖尿病ラットで傷はほぼ完全に収縮によって閉じられます。ただし、糖尿病創傷収縮 ZDF ラットは障害者と創傷治癒の主が再上皮化および肉芽組織形成を介して行われますしたがって、このプロセスより人間の創傷治癒の14に似ています。
糖尿病性創傷デブリドマンが臨床的によく遭遇後露出した骨付き。無胸腺ヌードマウス18,19の背中に直径 12 mm 全厚皮傷や正常マウス20の背中に直径 10 mm 全厚皮の傷、前が調査されました。重度の糖尿病の傷のための臨床モデルを開発するには、より大きい (15 × 10 mm2) 全層皮膚欠陥は骨を露出し、骨膜なしとして作成された、2 型糖尿病と肥満ラットで、前に説明した21。
通常の Lewis ラットの Asc からラット ASC (rASC) シートは、ASC シートの同種移植によって作成されました。臨床実習、潰瘍糖尿病患者は多くの場合、制御不能な高血糖と高体重指数、これら合併症原因創傷治癒障害これらの患者からの脂肪組織の取得の難易度を高めるなど、重度の糖尿病合併症を示すために、自家移植が可能。さらに、糖尿病を展示動物から Asc プロパティを変更、関数22障害者します。したがって、ここで示されるプロトコルは、正常ラットから rASC シートの同種移植と人工皮膚の糖尿病ラットへの応用について説明します。
このプロトコルで使われる膜人工皮膚の傷の自発収縮を防ぐことができます、新しい結合組織のマトリックスの合成を促進して true 真皮23を似ています。このプロトコルでは、人工皮膚は rASC シート上に配置、創収縮または緩いラット皮膚から結果の拡大を防ぐために糸で固定します。さらに、人工皮膚が移植された ASC シートや傷の湿潤環境を維持、感染や外部の力から傷を保護に ASC シート三次元フレームワークを提供します。最後に、非粘着ドレッシングは、外的な影響から保護、湿潤環境の維持、滲出液を吸収する創傷で配置されます。
RASC シートは薄い、柔軟性、および変形を暴行心24など、受信者のサイトに移動に付着することができます。細胞シート工学は様々 な組織の再建のために使用されているし、治療効果25,26.を生成することができます。臨床治療の可能性を示す ASC シートは、多くのタイプの傷の治癒を促進可能性があります。さらに、ASC シート、人工皮膚の使用と組み合わせるの同種移植は難治性の潰瘍や末梢動脈疾患や膠原病にみられるなど、火傷の治療に適用されるかもしれないまたは彼らは栄養不足ですか、ステロイドを使用している患者に投与されることがあります。このアプローチには、Asc を移植の効率が上がります。ZDF ラットの創傷治癒モデル人間の創傷治癒過程に似ており、小型の実験動物の臨床条件を模倣する重度の巻き具合が生成されます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="678">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">&#945;-MEM glutamax</td>
			<td style="width:169px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">32571-036</td>
			<td style="width:167px;">Carlsbad, CA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Japan Bioserum Co Ltd.</td>
			<td style="width:119px;">S1650-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagenase A</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td style="width:119px;">10 103 578 001</td>
			<td>Mannheim, Germany</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">60-cm2 Primaria tissue culture dish</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>353803</td>
			<td>Franklin Lakes, NJ</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffer Saline (PBS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">1490-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.25% Trypsin-ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-ascorbic acid phosphate magnesium salt n-hydrate</td>
			<td style="width:169px;">Wako</td>
			<td>013-19641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">35-mm temperature-responsive culture dish (UpcellTM)</td>
			<td>CellSeed</td>
			<td>NUNC-174904</td>
			<td>Tokyo, Japan</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Microwarm plate (MP-1000)</td>
			<td style="width:169px;">Kitazato Science Co., Ltd.</td>
			<td style="width:119px;">1111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rodent mechanical ventilator</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>#50206</td>
			<td>Wood Dale, IL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4% isoflurane</td>
			<td>Pfizer Japan</td>
			<td>114-13340-3</td>
			<td>Tokyo, Japan</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Artificial skin (Pelnac&#174;)</td>
			<td>Smith &#38; Nephew</td>
			<td>PN-R40060</td>
			<td>&#160;Tokyo, Japan</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Non-adhesive dressing (Hydrosite plus&#174;)</td>
			<td>Smith &#38; Nephew</td>
			<td align="right">66800679</td>
			<td>Known as Allevyn non-adhessing&#174; in the United State</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">5-0 nylon suture</td>
			<td>Alfresa</td>
			<td style="width:119px;">EP1105NB45-KF2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">20 CELLSTAR TUBES</td>
			<td>greiner bio-one</td>
			<td style="width:119px;">227 261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">15mL Centrifuge Tube</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td align="right" style="width:119px;">430791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">14 GOLDMAN-FOX PERIOSTEAL</td>
			<td>Hu-Friedy</td>
			<td style="width:119px;">P14</td>
			<td>Chicago, IL</td>
		</tr>
	</tbody>
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creation and transplantation of an adipose-derived stem cell (asc) sheet in a diabetic wound-healing model

人工皮膚は、臨床実習でかなり治療成績を成し遂げた。ただし、妨げられる血流や大きな傷、糖尿病患者の傷のため人工皮膚の治療が長引く可能性も。細胞ベースの治療は糖尿病性の潰瘍の治療のための新しい手法として登場している、細胞シート工学は、細胞移植の有効性を改善しました。レポートの数は、脂肪由来幹細胞 (Asc)、間葉系間質細胞 (MSC) の種類は、脂肪組織と他の組織から MSCs と比較されたときコレクションのユーザー補助機能の相対的な豊かさのための治療の可能性を示すことを示唆しています。したがって、Asc は、幹細胞治療上の使用のための良いソースに表示されます。本研究では通常の Lewis ラットの副睾丸脂肪脂肪から ASC シートが作成されましたとアスコルビン酸を含む通常の培養液に温度応答性培養皿を用いたします。ASC シート Zucker 糖尿病性脂肪酸 (ZDF) ラットに移植、2 型糖尿病の減少を示す肥満モデルラット創傷治癒します。傷は後部の頭蓋表面上に作成された、ASC シートが傷に移植した膜人工皮膚シートをカバーするため使用されました。ASC シートを受け取った ZDF ラット ASC シートの移植なし ZDF ラットよりも癒しの傷があった良い。このアプローチは、ASC シート湿潤環境の維持を必要とする、乾燥した条件に敏感であるために限られていた。したがって、人工皮膚は、乾燥を防ぐために ASC シートをカバーしていました。人工皮膚との組み合わせで ASC シートの同種移植も他の難治性潰瘍や火傷、末梢動脈疾患と膠原病、観察などに適用して栄養不足ですか、ステロイドを使用している患者に投与されることがあります。したがって、この治療は糖尿病創傷治癒の治療方法の改善への第一歩かもしれません。

このプロトコルでは、セルベースの難治性の糖尿病性創傷の治療法を確立しようとしています。(図 1に示す) として簡潔に同種 rASC のシーツは細胞シート工学を用いた正常ラットから作成された、糖尿病ラットの重層全層皮膚欠損創に人工皮膚を使用してそれから移植します。RASC シート (図 2 a) の良い例と悪い例 rASC シート (図 2 b</stron...

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Creation and Transplantation of an Adipose-derived Stem Cell ASC Sheet in a Diabetic Wound-healing Model

脂肪由来幹細胞 (Asc) は簡単に隔離され、正常ラットの脂肪から採取しました。ASC のシーツは、細胞シート工学を使用して作成することができます、ザッカー出展全層脂肪の糖尿病のラット皮膚の露出した骨の欠陥と人工皮膚の層で覆われてに移植することができます。

作成および糖尿病創傷治癒モデルにおける脂肪由来幹細胞 (ASC) シートの移植

Artificial skin has achieved considerable therapeutic results in clinical practice. However, artificial skin treatments for wounds in diabetic patients ...

The overall goal of this procedure is to verify the effect of adipose-derived stem cell sheets combined with artificial skin on wound healing for a large full-thickness skin defect in diabetic rat. This method can help answer key questions about healing of chronic wound, such as diabetic large wound with exposed bone. The main advantage of this technique is that cells are transplanted to the wound in solid sheets using cell sheet technology, and the result is a viable, stable transplant.For a fat pad donor, plan to use eight to 33 week old Lewis rats. At the surgical site, have ready several sterile cotton-tipped applicators, gauzes, a scalpel, a needle holder, operating scissors, a pair of forceps, and 5-0 nylon suture. For temporary tissue placement, load a 100 milliliter petri dish with 10 milliliters of PBS.Weigh the PBS-loaded dish to later find the mass of the harvested tissue. After anesthetizing the rat, position it supine on a sterile drape. Then, shave the operative area and scrub the exposed skin using several alternating scrubs of 70%ethanol.Now, make a three centimeter skin incision in the lateral lower abdomen. Next, expose and dissect the external oblique muscle. Then, expose the epididymal adipose tissue surrounding the epididymis.Next, carefully excise the epididymal adipose tissue. Avoid damaging the epididymis, testes, and epididymal blood vessels. Transfer the tissue into the dish of PBS.Then, close up the donor rat and follow standard postoperative care practices. Isolate the ASCs from two to three grams of harvested adipose tissue. Digest the tissue for an hour in 0.1%type A collagenase to obtain the stromal vascular fraction, or SVF.After purifying the SVF, suspend the SVF in 20 milliliters of media. Split the suspension into two 60 square centimeter culture dishes, and culture them for 24 hours under standard conditions. The next day, wash the plates with PBS three times to remove any unattached cells and debris.After the final wash, add back fresh complete medium. Then, continue to passage the cells until they are nearly sub confluent on the third day of culturing. Then, using one milliliter of 0.25%trypsin EDTA in a brief incubation.Remove the cells from the plate. Do not let the cells be exposed to active trypsin more than 10 minutes. After observing and counting the cells, subculture them at a density of 1, 700 per square centimeter.Then, pass the cells every three days, and complete three passages before proceeding. After passing the subcultured rat ASCs for the third time, plate 150, 000 cells onto a 35 millimeter diameter temperature-responsive culture dish, and two milliliters of culture medium. Culture the dish for three days in an incubator to make a uniform cell sheet.Three days later, change the medium, and add 16.4 micrograms per milliliter of AA.Then culture the cells, changing the AA medium every other day. After four or five days on the AA-containing medium, check the proliferation of the ASCs. Look for gaps between the cells and the contiguous cell sheet.Once a contiguous cell sheet is established, the cells can be used for the model. When needed, collect the cell sheet by placing the plate at room temperature for 15 to 20 minutes. Because the plate is temperature sensitive, the cells will spontaneously detach as a contiguous sheet, and the sheet can be removed with forceps.For the obesity wound healing model, use adult male ZDF rats, 16 to 18 weeks old weighing between 500 and 600 grams. Position and anesthetize rat on the surgical field, and before shaving the head, clean it using 70%ethanol. Then, shave the operative area and clean the exposed skin with alternating scrubs of 70%ethanol.Around this time, transfer the temperature sensitive plate of adipose stem cells to the bench. Before the cell sheet detaches from the plate, remove the medium and wash the cell sheet with PBS three times. After collecting the cell sheet, soak it in PBS until needed.Once the cells are ready, make a 15 by 10 millimeter full-thickness skin defect on the rat's head. First, remove the cutaneous tissue down to the periosteum. Then, excise the skin an cutaneous tissue with a scalpel and a pair of surgical scissors.To complete the defect, remove the periosteum with the periosteal raspatory. Then place the cell sheet over the defect. The stem cell sheet is soft and flexible.Use forceps to extend it to every corner of the defect. Now, cover the cell sheet and defect with a 10 by 15 millimeter patch of artificial skin soaked in saline right before use, and close the wound with approximately 10 stitches using 5-0 nylon suture. To protect the wound, use 5-0 nylon suture to secure a 15 by 20 millimeter patch of non-adhesive dressing over the artificial skin.Plan to observe the dressing every other day, because the rat will invariably remove it, and if needed, replace the dressing promptly. In two groups of six Zucker diabetic fatty rats, the described protocol was used to create a skull defect. Experimental rats were treated with a rat adipose stem cell sheet, and the controls were not.After 14 days, the wounds of the treatment group were significantly smaller than those of the controls. After watching this video, you should have a good understanding of how to make large wound with exposed bone in rats, and then treat that wound with adipose derived stem cells. While attempting this procedure, be sure to use strict temperature management during the entire process of using temperature responsive culture dishes.Otherwise, cells could spontaneously detach from the dishes, delaying your experiments.

Research

JoVE Journal

Medicine

Creation and Transplantation of an Adipose-derived Stem Cell (ASC) Sheet in a Diabetic Wound-healing Model

Orthotopic Aortic Transplantation: A Rat Model to Study the Development of Chronic Vasculopathy

同所性大動脈移植：慢性血管障害の発生研究のラットモデル

Research models of chronic rejection are essential to investigate pathobiological and pathophysiological processes during the development of transplant ...

医学

A Mouse Model of in Utero Transplantation

A Mouse Model of in Utero Transplantation

のマウスモデル子宮内で移植

The transplantation of stem cells and viruses in utero has tremendous potential for treating congenital disorders in the human fetus.  For example, in ...

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

における幹細胞移植 in vitroで模擬虚血/再灌流モデル

Stem cell transplantation protocols are finding their way into clinical practice1,2,3. Getting better results, making the protocols more robust, and ...

Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model

競争力のあるマウス骨髄移植モデルにおけるドナー細胞の生着を​​決定するために、定量的リアルタイムPCRを用いて

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules ...

Murine Model of Wound Healing

創傷治癒のマウスモデル

Wound healing and repair are the most complex biological processes that occur in human life. After injury, multiple biological pathways become activated. ...

Transplantation of Adipose Tissue-Derived Stem Cell Sheet to Reduce Leakage After Partial Colectomy in A Rat Model

ラットモデルにおける部分的な術後後の漏れを減らすために脂肪組織由来幹細胞シートの移植

Anastomotic leakage is a disastrous complication after colorectal surgery. Although current methods for leakage prevention have different levels of ...

Corneal Epithelial Abrasion with Ocular Burr As a Model for Cornea Wound Healing

角膜上皮摩耗眼はりのモデルとして角膜創傷治癒

The murine cornea provides an excellent model to study wound healing. The cornea is the outermost layer of the eye, and thus is the first defense to ...

Ex Vivo Corneal Organ Culture Model for Wound Healing Studies

前のヴィヴォ角膜器官培養モデルの創傷治癒の研究

The cornea has been used extensively as a model system to study wound healing. The ability to generate and utilize primary mammalian cells in two ...

Targeting Gray Rami Communicantes in Selective Chemical Lumbar Sympathectomy

ターゲット灰白交通枝選択的化学腰椎交感神経切除術で

Chemical lumbar sympathectomy (CLS) is a commonly used, minimally invasive procedure for the treatment of conditions including ischemic diseases of the ...

An Ex Vivo Tissue Culture Model for Fibrovascular Complications in Proliferative Diabetic Retinopathy

増殖糖尿病網膜症における線合併症の体外培養モデル

Diabetic retinopathy (DR) is the most common microvascular complication of diabetes and one of the leading causes of blindness in working-age adults. No ...