Name: a high throughput, multiplexed and targeted proteomic csf assay to quantify neurodegenerative biomarkers and apolipoprotein e isoforms status
Uploaded: 2016-10-20T14:00:00
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This work was funded and facilitated through the GOSomics research initiative by the National Institute for Health Research, Biomedical Research Centre at Great Ormond Street Hospital and the UCL Biological Mass Spectrometry Centre at the UCL Institute of Child Health with kind donations from the Szeban Peto Foundation. The Dementia Research Centre is an Alzheimer's Research UK coordinating centre. The authors acknowledge the support of Alzheimer's Research UK, the NIHR Queen Square Dementia Biomedical Research Unit, UCL/H Biomedical Research Centre, and Leonard Wolfson Experimental Neurology Centre.

NOTE:. Un schéma du protocole global décrit ici est donnée dans le Fi gurer 1 Tous les échantillons utilisés pour le développement de cette méthode sont des échantillons cliniques de diagnostic excédentaires et avoir l&#39; approbation éthique du comité de Londres Bloomsbury éthique. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/54541/54541fig1.jpg" /> Figure 1. Schéma illustrant le processus global de ...

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	<li>Prince, P. M., Guerchet, D. M., Prina, D. 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Comme avec tous les tests basés sur la SEP, les étapes critiques du procédé sont la détermination des quantités appropriées et précises des normes internes. Si la quantification absolue est utilisée, alors les quantités correctes de peptides enrichis dans la courbe standard sont également critiques. Notre test ne nécessite pas la précipitation du CSF ou l&#39;utilisation de tout type d&#39;étapes de nettoyage vers le haut ou dessalage avant l&#39;analyse de MS - il est un proc?...

L&#39;impact croissant des maladies neurodégénératives telles que la maladie d&#39;Alzheimer, la démence Lewy corps et la maladie de Parkinson, devient un enjeu socio - économique dans de nombreux pays 1. Il existe un besoin de marqueurs supplémentaires qui peuvent être utilisés pour identifier et classer les patients dans les premiers stades de la maladie, et de surveiller tous les nouveaux traitements potentiels. L&#39;objectif global de cette méthode est de créer un pipeline générique pour une manière simplifiée, économique et plus rapide de la validation de marqueurs de CSF potentiels de neurodégénérescence. La raison est d&#39;utiliser la protéomique ciblées ou peptide MRM LC-MS / MS comme une méthode facilement amendable pour évaluer plusieurs biomarqueurs protéiques potentiels à partir d&#39;expériences de découverte. Ceux-ci peuvent encore être multiplexes sur une séparation rapide chromatographique (&lt;10 min) et évalués. Dans cet écran multiplex pour les biomarqueurs neurodégénératives, nous avons inclus la démence facteur de risque connu apolipoprotéine isoforme E4 (ApoE4) donc nous CAn déterminer simultanément son statut et son niveau d&#39;expression, par ce qui élimine la nécessité pour les tests de génotypage séparés 2. LC MS / MS est couramment utilisé comme la méthode de choix pour quantifier avec précision de petites molécules sur d&#39;autres méthodes telles que ELISA ou dosage radio-immunologique (RIA). Ce changement dans l&#39;utilisation de la technologie MS aux protéines d&#39;analyse, a été tirée principalement par des problèmes avec les technologies immunodéprimés. Ceux-ci comprennent spécificité croisée, le lot à la variation de lot, durée de vie limitée, et le coût élevé. Par conséquent, la protéomique ciblées est en train de devenir une alternative de plus en plus à des méthodes d&#39;anticorps à base tels que Western blot, RIA et ELISA. Cependant, la capacité de multiplexer plusieurs marqueurs dans une analyse est le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes basées sur immuno-3. La technique est applicable à de nombreux tissus et a été utilisé en tant que stratégie de validation de nombreuses études protéomiques , y compris le plasma et l&#39; urine 4 5,6. Le technique peut être appliqué à tout laboratoire qui a accès et de l&#39;expertise dans l&#39;utilisation de spectromètres de masse triple quadripôle. design Peptide est relativement simple avec l&#39;utilisation croissante de bases de données open source. Le marché concurrentiel de la synthèse sur mesure des peptides rend beaucoup plus abordable. peptides lourds, cependant, sont chers et donc les marqueurs doivent être évalués sur une petite cohorte avant de passer à une plus grande échelle. Il existe un potentiel de croissance pour la technique à utiliser dans les paramètres cliniques de diagnostic, avec la plupart des grands hôpitaux ayant des plates-formes triples quadripôles à base qui peuvent être facilement adaptés pour exécuter des analyses protéomiques ciblées. Une telle application de la méthode, ce qui en fait dans le cadre de diagnostic de routine, est son application récente au dépistage de tache de sang nouveau - né pour l&#39; anémie falciforme 7.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="542">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">Acetonitrile (ACN), LC-MS grade&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">A955-1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Formic acid, LC-MS grade,</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A117-50</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">D5545-5G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hydrochloric acid, 37% w/w</td>
			<td>VWR&#160;</td>
			<td style="width:119px;">BDH3028-2.5LG</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Iodoacetamide&#160;&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">I1149-5G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S318-500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin, sequencing grade, modified</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5113</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trifluoroacetic acid (TFA), LC-MS grade</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A116-50</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Urea</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U0631-500g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Water, LC-MS ULTRA Chromasolv</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>14263</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">Custom synthesised peptides desalted 1-4mg</td>
			<td style="width:71px;">Genscript</td>
			<td style="width:119px;">custom</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:352px;">heavy labelled amino acid [C13 N15] custom peptides</td>
			<td style="width:71px;">Genscript</td>
			<td style="width:119px;">custom</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:352px;">ASB 14</td>
			<td style="width:71px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:119px;">182750-25gm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">Thiourea</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T7875-500G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">Tris base</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T6066</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">VanGuard precolumn</td>
			<td style="width:71px;">Waters</td>
			<td style="width:119px;">186007125</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">Cortecs UPLC C18+ 1.6um&#160; 2.1 x50mm column</td>
			<td style="width:71px;">Waters</td>
			<td style="width:119px;">186007114</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">Yeast Enolase&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E6126</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:352px;">300ul clear screw top glass vials&#160;&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:119px;">03-FISV</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:352px;">Y slit screw caps&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:119px;">9SCK-(B)-ST1X</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:352px;">Freeze dryer</td>
			<td style="width:71px;">Edwards Mudulyo&#160;</td>
			<td style="width:119px;">Mudulyo system</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:352px;">Concentrator/Speed vaccum</td>
			<td style="width:71px;">Eppendof&#160;</td>
			<td style="width:119px;">concentrator&#160; plus 5301</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">Xevo -TQ-S mass spectrometer</td>
			<td style="width:71px;">Waters</td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">Acquity UPLC system</td>
			<td style="width:71px;">Waters</td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high throughput, multiplexed and targeted proteomic csf assay to quantify neurodegenerative biomarkers and apolipoprotein e isoforms status

De nombreuses maladies neurodégénératives manquent encore de traitements efficaces. biomarqueurs fiables pour identifier et classer ces maladies seront importantes dans le développement de nouvelles thérapies futures. Souvent, de nouveaux biomarqueurs potentiels ne font pas dans la clinique en raison des limites de leur développement et des coûts élevés. Cependant, la protéomique ciblées en utilisant la réaction Multiple Surveillance chromatographie liquide-tandem / spectrométrie de masse (MRM LC-MS / MS), en utilisant spécifiquement triple spectromètres de masse quadripolaires, est une méthode qui peut être utilisée pour évaluer rapidement et valider des biomarqueurs pour la traduction clinique dans les laboratoires de diagnostic . Traditionnellement, cette plate-forme a été largement utilisée pour la mesure de petites molécules dans les laboratoires cliniques, mais il est le potentiel d&#39;analyser les protéines, qui en fait une alternative intéressante à la technique ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) méthodes basées. Nous décrivons ici comment protéomique ciblée peut être utilisée pour mesurer les marqueurs multiplexés de démence, y compris la détection et la quantification du facteur de risque connu apolipoprotéine E isoforme 4 (ApoE4). Afin de rendre le dosage approprié pour la traduction, il est conçu pour être rapide, simple, hautement spécifique et rentable. Pour ce faire, chaque étape dans le développement de l&#39;essai doit être optimisé pour les protéines et les tissus individuels, ils sont analysés dans. Cette méthode décrit un flux de travail typique, y compris divers trucs et astuces pour le développement d&#39;une cible protéomique MRM LC-MS / MS pour la traduction . Le développement de la méthode est optimisée en utilisant des versions personnalisées de synthèse de peptides tryptiques quantotypic, qui calibrent MS pour la détection, puis enrichi en CSF pour déterminer l&#39;identification correcte du peptide endogène dans la séparation chromatographique avant l&#39;analyse dans les MS. Pour y parvenir absolute quantification, versions standard interne isotopes stables marqué des peptides avec peu acides marqueurs de séquence d&#39;acide et contenant un site de clivage de la trypsine, sont inclus dans l&#39;essai.

En utilisant le procédé décrit ci - dessus, un dosage multiplex à haut débit 10 min constitué de 74 peptides à partir de 54 protéines a été mis au point, en tant que dosage de marqueurs des maladies neurodégénératives maladies et à corps de Lewy (LBD) d&#39;Alzheimer 8. La figure 3 montre un chromatogramme de multiplexage publiée 8 précédemment des marqueurs peptidiques significatifs de l&#39;analyse. Les peptides inclus dans l&#39;...

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A High Throughput, Multiplexed and Targeted Proteomic CSF Assay to Quantify Neurodegenerative Biomarkers and Apolipoprotein E Isoforms Status

Nous décrivons un haut-débit, multiplex, et le liquide céphalorachidien protéomique ciblée (CSF) test développé avec le potentiel pour la traduction clinique. Le test peut quantifier des marqueurs potentiels et les facteurs de risque pour la neurodégénérescence, telles que les variantes de l&#39;apolipoprotéine E (E2, E3 et E4), et mesurer leur expression allélique.

A High Throughput, multiplexée et ciblée protéomique CSF Assay à Quantifier neurodégénératifs Biomarqueurs et apolipoprotéine E isoformes Status

Many neurodegenerative diseases are&#160;still lacking effective treatments. Reliable biomarkers for identifying and classifying these diseases will be ...

Research

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